Abstrakt
Fhit protein er tabt eller reduceret i en stor del af humane tumorer, og dens restaurering udløser apoptose og undertrykker tumordannelse eller progression i prækliniske modeller. Her beskriver vi identificering af kandidat Fhit-interagerende proteiner med cytosolisk og plasmamembranen lokalisering. Blandt disse blev Annexin 4 (ANXA4) valideret af co-immunopræcipitation og konfokal mikroskopi som partner i denne roman Fhit proteinkompleks. Her rapporterer vi, at overekspression af Fhit forhindrer Annexin A4 translokation fra cytosol til plasmamembranen i A549 lungekræft celler behandlet med paclitaxel. Desuden paclitaxel administration i kombination med Ad
FHIT
virker synergistisk for at øge apoptotiske sats af tumorceller både
in vitro
og
in vivo
eksperimenter.
Henvisning: Gaudio E, Paduano F, Spizzo R, Ngankeu A, Zanesi N, Gaspari M, et al. (2013) Fhit Delocalizes Annexin A4 fra plasmamembranen til Cytosol og sensibiliserer Lung Cancer Cells til Paclitaxel. PLoS ONE 8 (11): e78610. doi: 10,1371 /journal.pone.0078610
Redaktør: Srikumar P. Chellappan, universitetet i Catanzaro, USA
Modtaget: Marts 26, 2013; Accepteret: 14. september 2013; Udgivet: November 6, 2013 |
Copyright: © 2013 Gaudio et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af AIRC (Associazione Italiana Ricerca Cancro) og National Institutes of Health (NIH) tilskud CA152758 (CMC). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
FHIT
gen, der omfatter
FRA3B
, den mest aktive fælles skrøbelig hjemmeside på kromosom 3p14.2 [1], [2] er medlem af histidintriade (HIT) familie af proteiner, der omfatter en gruppe af nukleotid-bindende og hydrolysere proteiner med histidintriade motiver, repræsenteret i alle organismer [3].
FHIT
koder for et tumor-suppressor protein, hvis tab er impliceret i en stor del af cancere; Faktisk har sin deletion eller tab af ekspression blevet rapporteret i hoved og hals [4], [5], gastrointestinal [6], cervikal [7], lunge [8], bryst [9], [10], og hæmatopoietisk tumorer [11]. Rolle Fhit i tumorigenese blev bekræftet i mus, hvor
Fhit
genetiske ablation resulterede i øgede følsomhed over for et bredt spektrum af spontane tumorer [12], [13]. Desuden sletning af enten den ene eller begge
Fhit
alleler i mus forbedrede følsomhed over for kræftfremkaldende N-nitrosomethylbenzylamine (NMBA), med de fleste
Fhit
– /-
Fhit
+/- mus udvikler formave tumorer (adenomer, papillomer og invasive karcinomer) efter en dosis af NMBA sammenlignet med vildtype-kontroller [12], [14], som udviklede meget få. Interessant
FHIT
blev også med succes anvendes som et terapeutisk gen i cancer-cellelinjer, hvor den udløser apoptose, og flere prækliniske modeller af
FHIT
-null cancer, herunder lunge, spiserør, bugspytkirtel, bryst og leukæmi [15] – [20]. Imidlertid har rapporter om mekanismer Fhit suppressorfunktion været mere sparsomme og nyere. Fhit koder en diadenosine polyphosphat (Apna) hydrolase der spalter substrater såsom diadenosine
P
1,
P
3 trifosfat (ApppA) og diadenosine 5 ‘, 5’ ‘ ‘-
P
1,
P
4-tetraphosphate (AppppA) til AMP plus andet nukleotid [21], [22]. Gennem adenoviral udtryk for
FHIT
mutant alleler, viste vi, at Fhit-substrat binding er begrænsende for tumor undertrykkelse, mens dens katalytiske aktivitet ikke er nødvendig for Fhit evne til at udløse apoptose [23]; Desuden viste vi, at højt konserveret Fhit tyrosin 114 (Y114), som kan phosphoryleres af Src [24], er nødvendig for at udløse caspase-afhængige Fhit-medieret apoptose [25]. For nylig ved anvendelse af en proteomisk tilgang, identificerede vi et Fhit proteinkompleks herunder Hsp60 og Hsp10, der kan mediere både Fhit stabilitet og dets mitokondriel lokalisering; en gang i mitokondrierne, Fhit binder og stabiliserer ferredoxinreduktase (Fdxr), hvilket fører til modulering af produktionen af reaktive oxygenspecies (ROS), et tidligt trin i Fhit-induceret apoptose [26]. Beviserne for Fhit mitokondrie lokalisering førte også til den opdagelse, at det øger ophobningen af Ca2 + i organel, i overensstemmelse med dens rolle i apoptose under passende betingelser [27].
Den brede subcellulære fordeling af Fhit opmuntret os at fortsætte søgningen efter romanen Fhit protein partnere for yderligere at belyse dets rolle i tumor undertrykkelse. Her vil vi vise, at Fhit interagerer med Annexin 4; denne interaktion kan blokere translokation af Annexin 4 fra cytosol til plasmamembran under behandling af lungekræft celler med paclitaxel. Som følge heraf eksogene
FHIT
restaurering i
FHIT
-null kræftceller virker synergistisk med paclitaxel i udløsning apoptose
in vitro
tumorregression
in vivo
. Tilsammen vores resultater tyder på, at Fhit restaurering kunne have en rolle i at overvinde resistens, og at kombination med paclitaxel dåse er en gyldig metode til kræftbehandling.
Resultater
Isolering af Fhit proteinkomplekser fra celle membraner
I vores tidligere proteomisk tilgang, isoleret vi et opløseligt Fhit proteinkompleks fra A549 cancerceller [26]. Ved at anvende en let modificeret fremgangsmåde, der tager sigte på at identificere Fhit-interagerende proteiner i cellemembraner, brugte vi en rekombinant adenovirus, der bærer en
FHIT
cDNA modificeret ved dens 3′-enden med en sekvens, der koder for et histidin-seks epitopmærke ( Ad
FHIT-
His6), som tidligere beskrevet [26]. Kort fortalt blev A549 lunge kræftceller inficeret med enten Ad
FHIT
(anvendt som kontrol) eller Ad
FHIT-
His6 på MOI50 og behandles med dithiobis [succinimidylpropionat] (DSP), et kryds linker, der krydser membraner og rettelser proteiner i komplekse i levende celler. Cellerne blev lyseret og isoleret membran fraktion; Fhit-His6 rekombinant protein sammen med sin kandidat proteinpartnere blev isoleret med nikkel perler ivrig for His6 epitopmærket. Oprensede proteiner blev behandlet med dithiothreitol (DTT) for at spalte DSP og dissociere komplekset, og fordøjet med trypsin; proteinkomponenter blev identificeret ved væske /chromatografi tandem-massespektrometri (LC-MS /MS). Efter protein identifikation ved databasesøgning, inspektion af LC-MS /MS-data blev foretaget for at vurdere eksklusiv tilstedeværelse af masse toppe tilhører kandidat partner proteiner i prøver fra celler inficeret med Ad
FHIT-
His6. Proteiner identificeret er anført i tabel 1.
Fhit protein interagerer med Annexin 4
Det er tidligere påvist, at fraværet af Fhit protein i kræftceller resulterede i resistens mod paclitaxel [28] ; Annexin 4, et protein med både plasmamembranen og cytoplasmatisk lokalisering, er blevet rapporteret at være overudtrykt i mange cancerceller; især er det blevet påvist, at Annexin 4 overekspression bidrager til kræftceller resistente mod paclitaxel [29]. Således at kaste lys over de mekanismer resistens i
FHIT
-minus kræftceller, besluttede vi at fokusere på Annexin 4 blandt de frisk identificerede kandidat Fhit partnere. Annexin 4 tilhører en super-familie af nært beslægtede calcium- og membran-bindende proteiner, som deltager i en række forskellige cellulære funktioner, herunder vesikeltrafik, celledeling, apoptose, calcium signalering og vækstregulering. Det er blevet foreslået, at nogle ændringer i annexin ekspression under tumorigenese kan resultere i resistens over for kemoterapeutiske midler, og at de enkelte annexiner kan vise sig at være terapeutiske mål [30] – [35]. Annexin 4 (ANX4) genet koder for et protein (dvs. ANX4 eller A4) næsten udelukkende udtrykkes i epitelceller [31] og overudtrykkes under paclitaxel behandling og i paclitaxel-resistente cellelinier; transfektion af ANX4 cDNA i 293 T celler resulterede i en tredobling af paclitaxel modstand [29], [36]. En korrelation mellem tilstedeværelsen af Annexin en (ANX1) og MDR (multi resistens) proteiner i brystkræftceller, forudsat den første direkte bevis for en rolle af et annexin i multiresistens [37].
For at vurdere Fhit og Annexin 4 interaktion, udførte vi en co-immunopræcipitering eksperiment ved hjælp proteinlysater fremstillet som beskrevet ovenfor (Figur 1, a og B). Fhit og Annexin 4 colokalisering blev undersøgt ved konfokal mikroskopi. Som vist i figur 1E, både Fhit og Annexin 4 viser primært et cytoplasmatisk subcellulær colokalisering.
A. A549 lunge cancer celler blev inficeret med Ad
FHIT
-Wild type eller Ad
FHIT-
His6 på MOI50; 48 timer efter infektion blev celler behandlet med DSP og lyseret med Mem-PER eukaryot membranprotein Extraction Kit at give total lysater beriget i fraktion membran. Total lysater blev immunfældet med nikkel perler. Immunopræcipitater blev analyseret ved immunblotting (IB) med anti-Fhit og anti-Annexin A4-antistoffer. B. A549 celler blev forbigående transficeret med et ekspressionsplasmid kodning pattedyr
Annexin4-
V5 (8 ug). 48 timer efter transfektion blev celler behandlet med DSP og totale lysater blev immunpræcipiteret (IP) med anti-V5-antistoffet. Immunopræcipitaterne blev probet ved immunoblotting (IB) med anti-Fhit og anti-Annexin 4-antistoffer. C-D. HEK293-celler blev mock tretated eller tretaed med paclitaxel i 24 timer (800 nm), og lyseret. Total protein lysater blev Immunoprecipited med IgG, Fhit og Annexin 4-antistoffer, som angivet. Påvisningen af endogene Annexin 4 og Fhit blev udført uden anvendelse af DSP-tværbindingsmiddel.
Som vist i figur 1A og 1B, Fhit og Annexin 4 interaktion blev hovedsageligt påvist i cytosoliske ekstrakter. Vi yderligere udført co-immunopræcipitationsforsøg på endogene Fhit og Annexin 4 proteiner i HEK293-celler, og vi demonstreret interaktionen mellem disse proteiner også i fravær af DSP tværbindingsmiddel, enten med eller uden paclitaxel (figur 1C og 1D). Den immunopræcipitation udføres med Fhit antistof efterfulgt af en immunoblotting udføres med et Annexin 4 antiserum, var klart tyder på en Fhit-Annexin 4 endogene kompleks i intakt celler.Varens direkte måde af de IP-adresser mellem endogene proteiner var klart tegn på interaktion (IP : Fhit, og IB: Annexin 4). Desværre, på grund af tekniske vanskeligheder på grund af co-migration af IgG og Fhit protein, den omvendte tilgang, der er immunoudfældning af endogene Annexin 4 protein efterfulgt af Fhit detektion blev unsuccessuful.
Fhit overekspression blokke Annexin 4 translokation fra cytosol til plasmamembran
Fhit og Annexin 4-protein-ekspression blev undersøgt i et panel af cancercellelinjer (fig S1), er Fhit ekspression tabt i de fleste celle undersøgte linjer. For at kaste lys på betydningen af Fhit-Annexin 4 proteinkompleks, vi udførte vores eksperimenter på to af dem, A549 og Calu-2, som viser svag eller ingen Fhit udtryk, hhv. For bedre at definere den subcellulære lokalisering af Fhit-Annexin 4 proteinkompleks, vi udførte cellulære fraktionering eksperimenter. Som vist i figur 2A og 2C, er basal Annexin 4 fordelt i både cytosol og plasmamembranen. Behandling af A549 og Calu-2 lungecancerceller med paclitaxel inducerede cytosoliske udtømning af Annexin 4, som undergik en tilsyneladende fuldstændig translokation til den indvendige side af plasmamembranen. Fhit overekspression blokeret Annexin 4 translokation fra cytosol til plasmamembranen, observeret efter indgift af paclitaxel. For at vise, at effekterne specifikt blev drevet af Fhit-Annexin 4 interaktion, blev et lignende eksperiment udført i betragtning af den subcellulære lokalisering af Annexin en og MDR (multiresistens protein), som begge er involveret i resistens mod kemoterapi [37] , [38]. Som vist i figur 2B og 2D, blev hverken Annexin I eller MDR subcellulære lokaliseringer påvirket af Fhit overekspression. Taget sammen indikerer disse data, at Fhit protein specifikt interfererer med Annexin 4 translokation fra cytosol til plasmamembran, observeret i paclitaxel-behandlede A549 og Calu-2-celler.
A-C. A549 og Calu-2 lungekræft celler blev inficeret med Ad
GFP
eller Ad
FHIT dele på MOI50; 48 timer senere blev celler mock-behandlet eller behandlet med paclitaxel (800 nM) i yderligere 24 timer. Proteiner fra cytosoliske og membranfraktioner blev separeret på en polyacrylamidgel, overført til nitrocellulose filter, og probet med Annexin 4-antistof. GAPDH og E-cadherin blev anvendt til at normalisere protein lastning af cytosoliske og plasma membranproteiner hhv. B-D. A549 og Calu-2 lunge cancer celler blev inficeret med Ad
GFP
eller Ad
FHIT
-Wild-typen; 48 timer senere blev celler behandlet med paclitaxel (800 nM) i yderligere 24 timer. Proteiner fra cytosoliske og membranfraktioner blev separeret på en polyacrylamidgel, overført til nitrocellulose filter, og probet med Annexin 1 og MDR (multiresistens protein) antistoffer. GAPDH og E-cadherin blev anvendt til at normalisere protein lastning af cytosoliske og plasma membranproteiner, henholdsvis.
Annexin 4 depletion kombineret med Fhit overekspression og paclitaxel behandling synergistisk inducerer proliferation inhibering og udløser apoptose af lungecancerceller
for at undersøge den rolle, som Fhit-medierede blok af Annexin 4 translokation fra cytosolen til plasmamembranen i mekanismen af lægemiddelresistens, udførte vi celle vækstkurver under forskellige betingelser. Som vist i figur 3A og 3B for A549 og Calu-2 lungecancerceller, blev celleantallet reduceret i Ad
FHIT- Salg inficerede celler sammenlignet med kontroller; en lidt stærkere hæmning af cellevækst blev observeret i celler behandlet med paclitaxel. Endelig er i overensstemmelse med tidligere rapporter [26], observerede vi en synergistisk effekt på celledelingen sats hæmning i A549 celler behandlet med paclitaxel plus Ad
FHIT
. I et repræsentativt eksperiment er vist i figur 3C, flowcytometri blev anvendt til at undersøge celle cyklus forstyrrelser i A549-celler inficeret med Ad
FHIT
, med (800 nM i 24 timer) eller uden paclitaxel behandling; A549 celler inficeret med Ad
FHIT
viste en sub-G1 peak kunne påvises (13%), i overensstemmelse med vores tidligere resultater [26]; en lignende effekt blev opnået efter 800 nM paclitaxel administration. En synergistisk effekt blev opdaget efter at kombinere annonce
FHIT
og paclitaxel behandling (25% af sub-G1 fraktion).
A-B. A549 og Calu-2-celler blev mock-inficeret, Ad
GFP
eller Ad
FHIT
inficerede celler ved MOI10 i 24 timer, derefter behandlet med eller uden 800 nM paclitaxel til yderligere 6 timer og talt . Søjlediagrammer viser middelværdi ± SEM for værdier fra tre forskellige eksperimenter (* P 0,05). Chou-Talalay methos blev påført beregne arten af kombinationerne (CI 1, synergisme). C. A549 celler blev enten mock-inficeret eller inficeret med Ad
GFP
eller Ad
FHIT
eller venstre ubehandlet eller behandlet med 800 nM paclitaxel, og derefter analyseret ved flowcytometri.
Disse data antyder, at genoprettelsen af Fhit funktion til Fhit-negative maligne celler, i kombination med paclitaxel, kunne udgøre en potentiel hidtil ukendt tilgang til behandlingen af patienter med lungecancer. Faktisk ved at sænke tærsklen for følsomhed over for narkotika administration Annexin 4-medieret kemoterapi tumorer, kan Fhit restaurering repræsenterer en spændende tilgang til at opnå en bedre patienter resultat.
For at afgøre, om samspillet mellem Fhit og Annexin 4 kunne have en rolle på den Fhit-medierede cellevækstinhiberingen og apoptose, blev Annexin 4 tavshed med små interfererende RNA’er (siRNA’er) designet til at blokere Annexin 4 proteinekspression. Som vist i figur 4A, blev Annexin 4-protein ekspressionsniveauer væsentligt reduceret efter Annexin 4 siRNAs transfektion i fravær eller nærvær af paclitaxel. I overensstemmelse med tidligere undersøgelser [36], mock-transficerede celler og celler transficeret med scrambled siRNA’er viste Annexin 4-protein opregulering efter indgift af paclitaxel sammenlignet med kontroller, hvorimod der ikke blev observeret nogen ændringer i A549 Annexin 4-udtømte prøver enten i fravær eller nærvær af paclitaxel. Kombinationen af paclitaxel behandling med Annexin 4 depletering havde en synergistisk virkning på celleproliferation hæmning, med celletallet er væsentligt lavere i forhold til behandlingen med paclitaxel eller Annexin 4-specifikt siRNA alene (figur 4B). blev ikke observeret nogen effekt på proliferation efter transfektion med scrambled siRNA’er. Vi testede også A549 proliferation sats efter Annexin 4 lyddæmpning eller infektion med Ad-
FHIT dele på MOI25 eller kombinerede behandlinger (figur 4C). Annexin 4 udtømning og Fhit overekspression forårsagede en signifikant reduktion i celle nummer i forhold til kontroller; en yderligere dramatisk reduktion i celleantal blev observeret ved tilsætning af paclitaxel, hvilket indikerer en synergistisk virkning.
A. A549-celler blev mock-transficeret eller transficeret med Annexin 4 siRNAs (50 nM) eller krypterede siRNA’er (50 nm) i 72 timer. Celler lysater blev immunblottet med Annexin 4 og GAPDH-antistoffer. B. A549 celler blev mock transficeret eller transficeret med Annexin 4 siRNAs (50 nM) eller krypteret siRNA (50 nM), inficeret med Ad
FHIT dele på MOI25 for 72 timer, og derefter til venstre ubehandlet eller behandlet med paclitaxel ( 800 nM). Celler blev først talt efter 12 timer efter paclitaxel behandling. Bar grafer viser middelværdi ± SEM for værdier fra 3 forsøg (* P 0,05). Chou-Talalay methos blev påført beregne arten af kombinationerne (CI 1, synergisme). C. A549-celler blev mock transficeret eller transficeret med Annexin 4 siRNA (50 nM) eller krypterede siRNA’er (50 nM) i 72 timer, derefter ubehandlede eller behandlet med paclitaxel. Celler blev først talt 12 timer efter paclitaxel behandling. Bar grafer viser middelværdi ± SEM for værdier fra 3 forsøg (* P 0,05). Chou-Talalay methos blev påført beregne arten af kombinationerne (CI 1, synergisme). D. A549 celler, behandles som beskrevet i B og C, blev analyseret ved TUNEL-analysen.
En TUNEL analyse bekræftede, at alle sub-G1 befolkninger, der er beskrevet i figur 3C overvejende bestod af apoptotiske celler (figur 4D). Desuden også virkningerne på celleproliferation hæmning blev parallelt med resultaterne af en TUNEL assay; i virkeligheden, apoptose nåede sit højeste grad i Annexin 4-udtømte celler inficeret med Ad
FHIT
og behandlet med paclitaxel (figur 4D).
Fhit /Annexin 4 interaktion plus paclitaxel inducerede tumorregression i en præklinisk model af lungekræft
for at undersøge virkningerne af Fhit /Annexin A4 interaktionen
in vivo
med eller uden paclitaxel i en præklinisk model for lungekræft, vi udførte et eksperiment på 11 grupper af mus (n = 5 mus /gruppe). Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) ved Ohio State University godkendt denne undersøgelse. Tre grupper blev subkutant injiceret med 1 × 10
7 A549 celler. Når tumorerne nåede en diameter på 15 mm, mus mock-behandlet, behandlet med DMSO eller behandles med en enkelt intravenøs administration af 40 mg /kg paclitaxel; mus blev overvåget regelmæssigt. Tre dage senere blev musene aflivet, og tumorerne blev evalueret efter vægt. Tumorer fra mus behandlet med paclitaxel viste en reduktion på 50% sammenlignet med kontroller. Denne korte tidspunkterne tillod os at forstørre virkningerne af både enkelte tretaments og deres kombination, som med længere tidspunkter virkningerne af Fhit behandling ville være omfattet af paclitaxel. To grupper af mus blev injiceret med 1 × 10
7 A549 celler præ-inficeret med Ad
GFP
eller Ad
FHIT dele på MOI50, og yderligere to grupper blev injiceret med 1 × 10
7 A549 celler præ-inficeret med Ad
FHIT
ved lav mangfoldighed af infektion (MOI5); en af de sidstnævnte grupper blev også behandlet med paclitaxel, som beskrevet ovenfor. Tumor vægt viste 83% reduktion i forhold til kontroller i mus injiceret med Ad
FHIT
MOI50 pre-inficerede celler versus 27% reduktion i mus injiceret med Ad
FHIT
MOI5; interessant, Ad
FHIT
MOI5 xenografter behandlet med paclitaxel viste tumorregression til 7% af kontrol tumorer, hvilket indikerer en synergistisk effekt af Fhit og paclitaxel.
For at fuldende panelet, to grupper af mus injiceret med Annexin 4-udtømte celler (hvoraf den ene blev behandlet med paclitaxel, som beskrevet ovenfor) og to flere grupper med Annexin 4-udtømte celler præ-inficeret med Ad
FHIT
MOI5 (én behandlet med paclitaxel). Annexin 4-udtømte celler viste en lille, men ikke signifikant tumor reduktion sammenlignet med kontroller, mens en højere reduktion blev observeret i Annexin 4-udtømte xenotransplantater behandlet med paclitaxel versus xenotransplantater behandlet med paclitaxel alene (70% og 50%, henholdsvis). Endelig næsten ingen tumorer blev påvist i mus med xenografter med bankede-down Annexin 4 pre-inficeret med Ad
FHIT
MOI5 plus paclitaxel. Resultaterne af disse eksperimenter er angivet i figur 5A og 5B. Tilsammen disse data understreger betydningen af den Fhit /Annexin 4 interaktion
in vivo
og fremhæve værdien af kombineret Fhit genterapi og kemoterapi i prækliniske kræftmodeller.
A. Nøgne mus blev subkutant injiceret med 1 x 10
7 A549-celler. Nogle grupper (n = 5 mus /gruppe) blev injiceret med mock behandlede celler, andre med celler transficeret med Annexin 4 siRNA eller inficeret med Ad
FHIT
(MOI5 eller MOI50) eller kombinationer af begge. Når tumorerne nåede en diameter på 15 mm, mus mock-behandlet, behandlet med DMSO eller behandles med en enkelt intravenøs administration af 40 mg /kg paclitaxel; mus blev overvåget regelmæssigt. Tre dage efter PTX blev musene aflivet, og tumorerne blev evalueret efter vægt. Bar grafer viser middelværdi ± SEM for værdier fra 5 mus (* P 0,05). Chou-Talalay methos blev påført beregne arten af kombinationerne (CI 1, synergisme). B. Tumor mængder rapporteres over tid.
Diskussion
Tab af Fhit udtryk under tumorigenese er blevet rapporteret for de fleste typer af human cancer. Dens rolle i maligne sygdomme understreges af det faktum, at Fhit tab er en tidlig begivenhed i tumorer, som rapporteret for lunge forstadier til kræft. Også den succesfulde
FHIT
genterapi i en række prækliniske modeller af human cancer gør Fhit protein en god kandidat til at finde innovative behandlinger [1]. Trods bestræbelserne på at afklare, hvordan Fhit protein fungerer, definerer specifikke mekanismer, hvorigennem Fhit modulerer apoptotiske og andre tumor suppressor funktioner har været udfordrende. Dette skyldes primært det faktum, at indtil for få år siden, Fhit havde ingen bekræftede protein partnere identificeret ved konventionelle undersøgelser med henblik på isolering af protein-protein-komplekser. Vi har rapporteret isoleringen af Fhit-interagerende proteiner ved en proteomics tilgang [26]; undersøgelsen førte til isolering og karakterisering af et opløseligt Fhit proteinkompleks indeholdende Hsp10 /Hsp60 og ferredoxinreduktase (Fdxr) blandt andre mitokondrielle proteiner. I denne undersøgelse, vi viste, at Hsp10 /Hsp60-komplekset var involveret i translokation af Fhit protein i mitokondrier, hvor dens interaktion med Fdxr var involveret i modulering af produktionen af reaktive ilt arter, den tidligste skridt i Fhit-medieret apoptose. Denne tilgang, der tager sigte på identifikation af protein komplekser, foreslog opfølgende undersøgelser for at identificere andre Fhit interaktionskandidater og deres funktionelle signalveje. I subcellulære fraktioneringstrin undersøgelser blev Fhit protein påvist i alle cellekamrene men nucleus [26]. Således har vi isoleret hidtil ukendte Fhit proteinkomplekser fra A549 proteinlysater beriget med cellemembraner. Denne tilgang produceret en liste af kandidat Fhit partnere, hvoraf nogle blev også identificeret i vores tidligere analyse [26]. Blandt disse nye kandidater, havde Annexin A4 (ANXA4) blevet rapporteret at spille en rolle i medikamentresistens, med dets ekspression steget i kloner resistente over for paclitaxel [36], et lægemiddel almindeligvis anvendes til behandling af cancerpatienter. Som vi tidligere vist, at Fhit selv er involveret i at overvinde paclitaxel modstand [26], [27], besluttede vi at udforske dette potentiale sammenhæng nærmere.
Samspillet mellem Fhit og respons på kemoterapi har været tidligere undersøgt af Andriani et al [41]. Især Fhit ekspression resulterede i reduceret følsomhed over for etoposid, doxorubicin, og topotecan. Denne funktion blev forbundet med Fhit-induceret nedregulering af DNA-topoisomeraser I og II. I modsætning hertil Fhit udtryk produceret en lille stigning i følsomhed over for cisplatin, som det fremgår af kolonidannende analyser [41].
Inaktivering af både FHIT og TP53 gener ofte observeret i primære ikke-småcellet lungekræft ( NSCLC) og cellelinier og kan bidrage til resistens over for apoptotiske stimuli fremkaldt af forskellige antitumorlægemidler [42]. I denne undersøgelse viste vi, at paclitaxel administration fremkalder både Annexin A4 opregulering og ændring af dets intracellulære fordeling; i virkeligheden, efter paclitaxel behandling, annexin A4 bevæger sig fra cytosolen til cellemembranen. Interessant, Fhit overekspression i Fhit-negative lunge cancerceller forhindrer annexin A4 translokation fra cytosol til celle membran; desuden samtidig behandling af A549 cancerceller med Ad
FHIT
og paclitaxel er meget mere effektivt til at udløse apoptose af cancerceller sammenlignet med kontroller; lignende resultater blev opnået med indgivelsen af paclitaxel til annexin A4-depleterede A549-celler. Disse data antyder, at både annexin A4 overekspression og dens plasmamembranen subcellulære lokalisering i paclitaxel-resistente cancerceller er ikke en tilskuer-virkning, men snarere spiller en aktiv rolle i de mekanismer lægemiddelresistens; yderligere undersøgelser af funktionen af annexin A4 i cellemembranen kan kaste lys over de komplekse mekanismer resistens i kræftpatienter. Disse
in vitro
resultater fundet yderligere støtte i en præklinisk model for lungekræft; Faktisk er både
FHIT
genterapi og annexin A4 udtømning handlet synergistisk med paclitaxel til induktion tumorregression i mus sammenlignet med kontroller; denne kombination kunne være nyttige interesse i behandlingen af patienter med lungecancer. Afslutningsvis tidligere og nylige undersøgelse understreger Fhit tab, et fælles træk i human cancer, som en markør for dårlig prognose hos kræftpatienter, hvilket tyder på, at Fhit-negative tumorer er tilbøjelige til at udvikle resistens.
Materialer og Metoder
Etik Statement
Mus blev opretholdt og dyreforsøg udført under institutionelle retningslinier fastlagt for Animal Facility på The Ohio State University. Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr i Ohio State University. Protokollen blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) ved Ohio State University (IACUC protokol nummer: 2010A00000146; godkendelse dato 2011/08/15). Alle operation blev udført under natrium pentobarbital anæstesi, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse.
Cell kultur og transfektionsforsøg
A549 celler blev opretholdt ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO
2 i det passende vækstmedium med kosttilskud tilsat som anbefalet. HEK-293-celler blev anvendt til generering og amplifikation af rekombinante adenovira [18]. Transfektioner af Annexin 4 små interfererende RNA’er (Smart pool, Dharmacon) blev udført under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
immunblotting og fraktionering analyse
Total proteiner blev ekstraheret med Nonidet P40 (NP-40 ) lyseringsbuffer; cytosoliske og plasmamembranen proteiner blev ekstraheret under anvendelse af FractionPREP-celle fraktionering systemet (BioVision). Total lysater med beriget plasma membranproteiner, der benyttes til både massespektrometri og immunbundfældninger analyser blev opnået ved anvendelse af Mem-PER eukaryot membranprotein Extraction Kit (Pierce).
I immunoblotting, proteiner (50 ug) blev separeret på polyacrylamid geler og overført til nitrocellulose filter membraner. Membraner blev blokeret i 5% fedtfri mælk, inkuberes med primær anti-Annexin 4, GAPDH og E-cadherin antistoffer (Santa Cruz Biotechnology), opdaget af de relevante sekundære antistoffer, og afsløret af forøget kemiluminescens (ECL; Amersham Inc .).
Protein Interaction Analysis
Co-immunopræcipitationsforsøg, med eller uden dithiobis- [succinimidylpropionat] (DSP), et tværbindingsmiddel fra Pierce, blev udført ved at inkubere 1 mg samlet proteinlysater (indeholdende beriget fraktion plasmamembranen) med enten NIN-TA agarose magnetisk nikkel perler (Qiagen) eller med anti-V5-antistof konjugeret med Sepharose-perler, natten over ved 4 ° C; Efter vask blev perlerne kogt i 1 × SDS-prøvebuffer og proteiner separeret på 4-20% polyacrylamidgeler (Bio-Rad).
Immunofluorescens
A549-celler, præ-inficeret med Ad
FHIT
, blev fikseret i PFA 4% (paraformaldeyde) i 10 minutter, permeabiliseret 4 min med Triton 0,05% og analyseret ved konfokal mikroskopi. Endogen Annexin 4 blev påvist med et primært antistof fra BD; sekundært antistof (594 nm) var fra Molecular Probes.
In vitro vurdering
vækstrate
A549 celler blev podet ved 1 × 10
5 celler pr skål og mock 60-mm inficeret eller inficeret med Ad
GFP
eller Ad
FHIT dele på MOI (infektionsmultiplicitet) 50 og behandles med 800 nM paclitaxel. Celler blev overvåget og talt på fireogtyve timers intervaller efter infektion. Paclitaxel (LC-Laboratories) blev opløst i DMSO som en 1 mM stamopløsning.
Generation af rekombinante adenovirusvektorer
Adenovira transporterer
FHIT
eller
FHIT-
His6 cDNA’er (Ad
FHIT
og Ad
FHIT-
His6 henholdsvis) under transkriptionel kontrol af en cytomegaloviruspromotor blev genereret ved homolog rekombination i HEK-293-celler som tidligere beskrevet [26] . Ad
GFP
vektor blev anvendt som kontrol.
Protein Digestion
Immunpræcipiterede proteinkomplekser blev fordøjet med sekventering trypsin fra Promega hjælp af Multiscreen Solvinert Filter Plader fra Millipore (Bedford ).
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.