PLoS ONE: AKT Inhibitors Fremme celledød i livmoderhalskræft gennem Forstyrrelse af mTOR Signaling og Glucose Uptake

Abstrakt

Baggrund

PI3K /AKT pathway ændringer er forbundet med ufuldstændig reaktion på chemoradiation i menneskelig livmoderhalskræft. Denne undersøgelse blev udført for at teste for mutationer i PI3K pathway og evaluere effekten af ​​AKT inhibitorer på glukoseoptagelse og cellernes levedygtighed.

Eksperimentel Design

Mutationsanalyse af DNA fra 140 forbehandling tumorbiopsier og 8 humane cervikale cancercellelinier blev udført. C33A celler (

PIK3CAR88Q

og

PTENR233 *

) blev behandlet med stigende koncentrationer af to allosteriske AKT hæmmere (SC-66 og MK-2206) med eller uden glukose analog 2-deoxyglucose (2 -DG). Cellelevedygtighed og aktiveringsstatus af AKT /mTOR pathway blev bestemt som reaktion på behandlingen. Glukoseoptagelse blev evalueret ved inkubering med

18F-fluordeoxyglucose (FDG). Cellemigrering blev vurderet ved bunden assay.

Resultater

Aktivering

PIK3CA

(E545K, E542K) og inaktivere

PTEN

(R233 *) mutationer blev identificeret i human livmoderhalskræft. SC-66 inhiberes effektivt AKT, mTOR og mTOR substrater i C33A celler. SC-66 inhiberede glucose optagelse via reduceret afgivelse af Glut1 og GLUT4 til cellemembranen. SC-66 (1 ug /ml-56%) og MK-2206 (30 pM-49%) behandling faldt cellelevedygtighed gennem en ikke-apoptotisk mekanisme. Fald i cellelevedygtighed blev forbedret, når AKT-hæmmere blev kombineret med 2-GD. Bunden assay viste en betydelig reduktion i cellemigrering ved SC-66 behandling.

Konklusioner

mutations spektrum af PI3K /AKT pathway i livmoderhalskræft er kompleks. AKT-hæmmere blokerer effektivt mTORC1 /2, fald glukoseoptagelse, glycolysen, og mindske cellernes levedygtighed

in vitro

. Disse resultater tyder på, at AKT-hæmmere kan forbedre respons på chemoradiation i livmoderhalskræft

Henvisning:. Rashmi R, DeSelm C, Helms C, Bowcock A, Rogers BE, Rader J, et al. (2014) AKT hæmmere Fremme celledød i livmoderhalskræft gennem Forstyrrelse af mTOR Signaling og glukoseoptagelse. PLoS ONE 9 (4): e92948. doi: 10,1371 /journal.pone.0092948

Redaktør: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA

Modtaget: August 22, 2013; Accepteret: 27 februar 2014; Udgivet: April 4, 2014

Copyright: © 2014 Rashmi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra NIH (US NIH 5K12HD00145910) til Julie K. Schwarz, MD, PhD. CD blev støttet af Research Medical Student Grant (# RMS113) fra Radiologisk Society of North America (Julie K. Schwarz mentor). Den Siteman Cancer Center er støttet af NCI Cancer Center Support Grant # P30 CA91842. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Globalt livmoderhalskræft er den tredje mest almindelige kvindelige kræft, og det rangerer fjerde i form af dødelighed [1]. Samtidig chemoradiation (bækken bestråling med den samtidige administration af cisplatin kemoterapi) er standard for pleje af patienter med lokalt fremskreden livmoderhalskræft. Vi har tidligere vist, at resultaterne af post-terapi [

18F] fluor-deoxy-glucose-positronemissionstomografi (FDG-PET) er prædiktive for progressionsfri og samlet overlevelse resultater efter chemoradiation [2] – [4 ]. I øjeblikket er der ingen effektive behandlingsmuligheder til rådighed for patienter, hvis tumorer ikke reagerer på traditionel chemoradiation.

For nylig identificerede vi PI3K /AKT pathway ændringer i tumorer fra patienter med en positiv post-terapi FDG-PET. Vi har også observeret høje P-AKT ekspression i forbehandling biopsiprøver, og patienter, hvis tumorer udtrykte høje niveauer af p-AKT havde nedsat overlevelse udfald og øget metastatisk sygdom efter standard chemoradiation [5]. Genetiske ændringer, der fører til aktivering af PI3K /AKT /mTOR pathway er knyttet til behandling resistens i forskellige faste tumorer [6]. Flere PI3K /AKT-hæmmere er blevet evalueret i kliniske forsøg for brystkræft og andre kræftformer med positive reaktioner hos patienter med PI3K /AKT ændringer [7]. Der er forlydender om, at kræft med

PIK3CA

mutationer er mere følsomme over for AKT eller PI3K /mTOR-hæmmere [8], [9].

Vi hypotese, at PI3K /AKT-hæmmere vil forbedre respons på chemoradiation i cervikale tumorer med PI3K /AKT pathway ændringer. For at teste for mutationer i PI3K /AKT pathway, analyserede vi 140 forbehandling cervikale tumor biopsier og 8 humane cervikale cancercellelinier [10]. Vi valgte derefter livmoderhalskræft cellelinie C33A, som er muteret til både

PIK3CA

PTEN Hotel (

PIK3CA

R88Q,

PTEN

R233 *) og udtrykker høje niveauer af p-AKT ved baseline, for at vurdere respons på to allosteriske AKT-hæmmere, SC-66 og MK-2206.

Materialer og Metoder

Patienter

undersøgelsespopulationen omfattede 140 patienter prospektivt indskrevet i tumor bank undersøgelser på tidspunktet for diagnosen livmoderhalskræft (marts 1998 til juli 2011). Godkendelse fra det institutionelle menneskelige forskningspotentiale Protection Office blev opnået for denne undersøgelse, og alle patienter underskrevet informeret samtykke. Klinisk opfølgning, herunder FDG-PET-billeddannelse blev udført for hver patient i henhold til institutionelle retningslinier som beskrevet tidligere [3]. På tidspunktet for sidste opfølgning, 76 patienter havde ingen tegn på sygdom, og 8 patienter i live i sygdom; 7 patienter døde på grund af samtidig sygdom; 2 patienter døde på grund af behandlingsrelaterede toksicitet, og 47 patienter døde på grund af livmoderhalskræft. Median opfølgning for patienter i live på tidspunktet for sidste opfølgning var 41 måneder (spændvidde 4 til 161 måneder).

Statistisk analyse

Overlevelse og tumor tilbagefald blev målt fra afslutningen af ​​behandlingen. Kaplan-Meier (produkt-grænse) fremgangsmåde blev anvendt til at udlede estimater for overlevelse [11]. Test af ligestilling af estimater for overlevelse mellem patientgrupper blev udført af den generaliserede Wilcoxon log-rank test. Statview udgave 5.0.1 software (SAS Institute Inc., Cary, NC) blev anvendt til analysen.

Mutationsanalyse hjælp MALDI-TOF

tumorbiopsier blev snittet og gennemgået for tumor celleindhold som tidligere beskrevet [5]. Tumor-DNA blev fremstillet under anvendelse af standardmetoder ved Washington University vævsudtagningen Core Facility. Analyser for en delmængde af 32 udvalgte onkogene mutationer (

Akt1

,

AKT2

,

PIK3CA

PTEN

) fra [10] blev redesignet i tre genotypebestemmelse multiplex, ved hjælp Sequenom s Assay Designer software version 3.1.2.2. (Sequenom Inc, San Diego, CA). De multiplex blev designet til at bruge IPLEX kemi. Det Sequenom MassARRAY systemet (https://www.sequenom.com) beskæftiger MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption /ionisering – Time of Flight) massespektrometri til at måle masse forskelle efter single-base tilføjelser til udvidelse primere. Spectral toppe svarende til de forventede masser for hver forlængede primer omdannes til prøve genotype opkald. Brug af standard IPLEX protokollen, Genotypning kerne ved Washington University (St. Louis, MO, USA) behandlet 15 ng prøve DNA pr multiplex gennem MassARRAY systemet. Toparealer svarende til normale og mutante uædle tilsætninger blev opnået fra hver prøve er massespektrum. En mutation blev betragtet stede i en prøve, når mutant spids var ansvarlig for 25% eller mere af de samlede toparealer, og fraværende, når mutanten topareal var mindre end 25% af totalen. Liste over OncoMap mutationer, der blev testet i vores multiplex er OM_00970-Akt1-E17K, OM_00032-AKT2-S302G, OM_00033-AKT2-R371H, OM_00241-PIK3CA-R88Q, OM_00242-PIK3CA-N345K, OM_00243-PIK3CA-C420R, OM_00246A-PIK3CA -E545K, OM_00248-PIK3CA-H701P, OM_00249-PIK3CA-H1047L, OM_00250A-PIK3CA-H1047R, OM_00250B-PIK3CA-H1047R, OM_00251-PIK3CA-H1047Y, OM_01017-PIK3CA-E545A, OM_01018B-PIK3CA-N1068fs*4,OM_0102-PIK3CA-Y1021C,OM_00839-PTEN-R173C,OM_00840-PTEN-R173H,OM_00841-PTEN-R233*,OM_00842-PTEN-R335*, OM_01038-PTEN-K267fs * 9 OM_01039-PTEN-V317fs * 3, OM_01069-PTEN-K6fs * 4.

Cell kultur og reagenser

Livmoderhalskræft cellelinjer blev opretholdt i IMDM medier (Life teknologier, CA) med 10% varmeinaktiveret FBS og inkuberet ved 37 ° C i 5% CO

2. SC-66 blev indkøbt fra BioVision (Milpitas, CA) og MK-2206 fra Selleck Chemicals (Houston, TX). 2-deoxy glucose, protease og phosphatase inhibitor cocktails blev indkøbt fra Sigma (Saint Louis, MO). Alle lægemidler til cellekultur blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO, Sigma). siRNA oligoer mod

Akt1

,

AKT2

Rictor

blev købt fra Sigma (Saint Louis, MO).

Western blotting og membran isolation

Phosphorylering af AKT og nedstrøms mål for AKT og mTOR pathway med eller uden SC-66 (6-10 ug /ml) og MK-2206 (0-2,5 uM) blev bestemt ved western blotting med primære antistoffer mod phosphoryleret og samlede former for mTOR, p70S6k, 4E-BP1, S6, GSK3-Ø, FOXO Pakt

Thr308, Pakt

Thr450 og Pakt

Ser473 (1:1000; cellesignalering Technology, MA), alt former for AKT, mTOR og 4-EBP1 (1:1000, Cell Signaling Technology, MA), alt former for p70S6k og β-actin HRP fra Santa Cruz Biotechnology, Californien og totale former for PRAS40 og FOXO fra Millipore (1:5000, Santa Cruz Biotechnology, CA). p-actin blev anvendt som intern kontrol. Blots blev probet med HRP-konjugeret anti-kanin (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) eller anti-muse polyklonale IgG sekundære antistoffer (Santa Cruz Biotechnology, CA) i 1 time ved stuetemperatur. Til detektion Pierce West Dura-substrat (Pierce Biotechnology) blev anvendt ifølge producentens protokol og eksponeret på røntgenfilm.

Cellelevedygtighed og Annexin farvning

I de celleviabilitetstest C33A celler blev behandlet med allosterisk AKT inhibitorer SC-66 (0.0001 ug /ml-5 ug /ml) og MK-2206 (125 nM-30 uM) med eller uden glucoseanalog 2-deoxyglucose (2-DG) (5-20 mM) hjælp dosistitrering og tidsforløb. For siRNA eksperimenter blev C33A celler transient transficeret og vurderet til proteinekspression efter 48 timer. Cellelevedygtighed blev testet under anvendelse af Alamar Blå fra Life Technologies, ifølge producentens instruktioner. Annexin /7-AAD farvning blev udført 24 timer efter behandling, ved hjælp af en kit fra BD, Biosciences efter producentens anvisninger, og cellerne blev analyseret ved flowcytometri.

FDG uptake analyser

FDG uptake assay blev udført som tidligere beskrevet [5]. Kort beskrevet blev celler podet og forbehandlet med blokken (Cytochalasin B) i 30 minutter efterfulgt af AKT-inhibitorer i yderligere 30 min. Efter dette,

18FDG blev tilsat til glucose medium i 1 time. Celler blev vasket, høstet og talt på en gammatæller.

Immunofluorescens

I et kammer glider (8 brønde) 25.000 celler blev udsået og behandlet med SC-66 1 pg /ml for 3 h og fikseret ved anvendelse af 4% p-formaldehyd fra Electron Microscopy Sciences (Hatfield, PA) i 10 minutter. Objektglassene blev derefter blokeret i 5% normalt gedeserum (Jackson ImmumoResearch, West Grove, PA) i 1 time, efterfulgt af omfattende gange vask med PBS. Derefter primære antistoffer Glut1 og GLUT4 (Abcam, Cambridge, MA) blev tilsat efterfulgt af sekundært antistof konjugat med Alexa Fluor 488 (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY). Objektglassene blev til sidst monteres ved hjælp Prolong Gold anti-fade (Life Technologies, Inc. Grand Island, NY).

Metaboliske assays

lactat assay blev udført under anvendelse af et kit fra (Sigma, Saint Louis , MO) ifølge producentens instruktioner ved anvendelse dyrkningsmedier opsamlet efter deproteinisering under anvendelse af 10 kDa spinsøjle filtre. ATP og NADP /NADPH-assays blev udført under anvendelse af kommercielt tilgængelige kits fluorometriske fra (Abcam, Cambridge, MA) i overensstemmelse med producentens instruktioner ved anvendelse cellelysater. Salg

Sårheling assay Salg

En million C33A celler blev udpladet i en 35 mm vævskulturskål og dyrket til konfluens. To parallelle ridser blev foretaget med en 200 pi pipettespids pr skålen og ridse bredde blev målt til basislinjen [12]. Såret bredde blev målt på et minimum på seks forskellige punkter for hvert sår. SC-66 (1 og 2,5 ug /ml) og MK-2206 (2,5 og 5 uM) blev tilsat i 24 timer. Bredden af ​​ridser blev målt ved hjælp af Qcapture Pro software og ses med OLYMPUS 1 × 70 mikroskop. Procent sårheling blev beregnet ved at dividere ridse bredde efter lægemiddeltilsætning af kontrolsystemet bredde minus 100%. Resultaterne præsenteret er gennemsnit ± SEM.

Resultater

PI3K /AKT /mTOR pathway er aktiv i livmoderhalskræft cellelinjer

Et panel af humane livmoderhalskræft cellelinjer blev testet til ekspression mønster og aktiveringsstatus af PI3K /AKT /mTOR pathway molekyler. Cellelysater blev fremstillet uden nogen behandling og baseline western blots blev udført. P70S6k, markøren for aktivering af mTOR pathway, blev phosphoryleret i størstedelen af ​​de cellelinier undtagen HeLa, C41 og C33A, hvor det blev fundet at være svagt phosphoryleret (fig. 1a). Phosphorylering af 4E-BP1 og S6 fandtes at være lav i de fleste af de cellelinier undersøgt. I SiHa og SW756, ekspressionsniveauerne af ikke-phosphorylerede former af mTOR, p70S6k, 4E-BP1 og S6 var lave sammenlignet med de andre cellelinier. På den anden side blev phosphorylering af mTOR fundet at være den samme i de cellelinier (fig. 1a). Baseline udtryk for phosphorylerede former af AKT såsom Ser473, Thr308 og Thr450 blev bestemt. C33A udtrykte alle de tre former for p-AKT. For at bestemme status for opstrøms regulatorer af AKT såsom PI3K og PTEN, baseline p-PI3K og p-PTEN niveauer blev undersøgt. Phosphoryleret PTEN niveau var ens på tværs af cellelinjer, bortset C33A, hvor niveauet af den samlede PTEN band var minimal. PI3K blev aktiveret i de fleste cellelinjer undersøgt her. SiHa udviste PI3K-aktivering meget lav (fig. 1B). Alle disse resultater antyder, at cervikal cancer cellelinjer har aktiveret mTOR pathway under basale betingelser og store forskelle fandtes i p-AKT niveauer.

(A-B) mTOR pathway komponenter og phosphorylerede former af AKT blev testet under anvendelse af kommercielt tilgængelige antistoffer på otte livmoderhalskræft cellelysater fremstillet uden behandling. (C)

PIK3CA

,

AKT

, og

PTEN

gen mutationsstatus af 8 humane livmoderhalskræft cellelinjer.

Sequenom mutationsanalyse af PIK3CA, PTEN og AKT gener i livmoderhalskræft

for at teste for mutationer i PI3K /AKT-vejen, vi gennemført en Sequenom mutationsanalyse for onkogene mutationer i gener

PIK3CA

,

PTEN

AKT

. Vi har ikke afsløre eventuelle

Akt1

eller

Akt2

mutationer i livmoderhalskræft cellelinjer. C33A nærede en R88Q

PIK3CA

mutation. R88Q er en aktiverende mutation findes i ABD domæne af p110α underenhed af

PIK3CA

gen. Denne defekt er associeret med forøget enzymatisk aktivering af PI3K protein og AKT-aktivitet

in vitro

[13], [14]. Vi fandt, at E545K

PIK3CA

mutation var til stede i ME-180 og CaSki-celler (Fig. 1C).

PIK3CA

E545K mutationen er en aktiverende mutation i den spiralformede domæne af p110α underenhed af PI3K protein. Denne mutation er kendt for at bibringe forøget kinaseaktivitet og konstitutivt aktiverer AKT [15]. Vi fandt også en R173C

PTEN

genmutation i CaSki og en

PTEN

R233 * mutation i C33A celler (Fig. 1C).

PTEN

R173C mutation er forbundet med nedsat phosphatase aktivitet mod PIP

3 [16].

PTEN

R233 * mutation i exon 7 inducerer en tidlig stopkodon i genet, hvilket forklarer manglen på

PTEN

proteinekspression i C33A celler [17] (fig. 1B).

Brug af Sequenom analysen, vi derefter testet for mutationer i

PIK3CA

,

AKT

PTEN

gener i 140 forbehandling biopsier indsamlet på vores tumor bank. Vi har ikke afsløre eventuelle analyseret mutation i

AKT

gen i vores patientpopulation. Vi fandt, at tumorer i 7 ud af 140 patienter nærede en

PIK3CA

E545K mutation og en ud af 140 havde en

PIK3CA

E542K mutation. Vi fandt også, at en tumor nærede en

PTEN

R233 * mutation. Patienter med E545K og E542K mutationer i

PIK3CA

blev fundet til at vise dårlig prognose og kortere sygdomsfri overlevelse efter standard chemoradiation (bækken bestråling og samtidig cisplatin kemoterapi) (p = 0,05, fig. 2).

Kaplan Meier kurve for progressionsfri overlevelse for livmoderhalskræft kræftpatienter med vildtype PIK3CA versus E545K eller E542K mutant tumorer (p = 0,05).

AKT-hæmmere SC-66 og MK-2206 fremkalde ikke-apoptotisk celledød i PIK3CA og PTEN mutant C33A celler

Brug C33A celler som en model for PI3K /AKT mutant livmoderhalskræft, vi fastslået, om tumor celle overlevelse var afhængig af AKT-signalering. C33A celler blev inkuberet med stigende doser af SC-66 og MK-2206 og blev bestemt levedygtigheden efter 24 og 48 timer. Cellernes levedygtighed faldt startende fra 1 pg /ml SC-66 efter 24 og 48 timer, til 55% og 43%. Levedygtigheden ved 5 ug /ml SC-66 blev fundet at være 15% efter 24 timer (fig. 3A). C33A celler blev også følsomme for en anden allosterisk AKT-inhibitor, MK-2206. Cellelevedygtighed blev anset for at mindske startende med koncentrationen af ​​15 uM (58%) og faldende til 2% ved 48 timer (fig. 3B). For at bekræfte, der påvirker på cellelevedygtighed skyldtes AKT hæmning frem forbi mål effekter af SC-66 og MK-2206, blev udført siRNA eksperimenter. Som vist i figur 3C, C33A cellelevedygtighed faldt til et tilsvarende omfang, når celler blev transficeret med siRNA’er medfører knockdown af

Akt1-

,

AKT2

, og

Rictor

(Fig . 3D).

(A-B) C33A celler blev podet på plader med 48 brønde og behandlet med stigende doser af SC-66 (0,0001-5 ug /ml) og MK-2206 (1.25-30 uM ) i triplikater i 24 og 48 timer. Levedygtighed blev målt ved anvendelse af Alamar Blå. Procent levedygtighed blev beregnet på grundlag vehikelbehandlede kontroller. (C) C33A celler blev podet på brøndsplader 48 og transficeret med oligoer mod

Akt1

,

AKT2

Rictor

og behandlet med SC-66 (1 pg /ml) og MK-2206 (20 pM) i triplikater for 24. levedygtighed blev målt ved anvendelse af Alamar Blå. Procent levedygtighed blev beregnet på grundlag vehikelbehandlede kontroller og kontrol siRNA transficeret kontrol, p 0,001 til sammenligning af kontrol siRNA versus siRNA for

Akt1

,

AKT2

Rictor

, SC-661 pg /ml, MK-2206 20 uM. (D) C33A celler blev podet på brøndsplader 48 og transficeret med oligoer mod

Akt1

,

AKT2

Rictor

og lysater blev forberedt efter 48 h og western blots blev udført. (E) C33A celler blev behandlet med SC-66 (2,5 ug /ml) og MK-2206 25 uM i 24 timer og derefter farvet med Annexin /7-AAD og analyseret ved flowcytometri. Grafen repræsenterer levedygtighed% celle. (F) C33A celler blev behandlet med SC-66 (0,0001 ug /m-0,1 pg /ml) med eller uden 20 mM 2-DG i 48 timer.

For at udforske den mekanisme, gennem hvilken AKT inhibitorer inducerer celledød, udførte vi Annexin /7-AAD-farvning. Ved SC-66 (2,5 ug /ml) og MK-2206 (25 pM) behandling var der meget få celler med Annexin kun farvning og fraktionen af ​​celler med både farvning var 35% og mindre end 20%, hhv. 7-AAD kun Farvning blev tæt på 80% i MK-2206 behandlede celler (fig. 3E). Yderligere at forbinde virkninger af SC-66 gennem glucoseoptagelse inhibering, vi kombineret SC-66 med 2-deoxy glucose (2-DG), en kompetitiv inhibitor af glukoseoptagelse. Med 48 timer efter behandling med SC-66 (0,01 ug /ml) levedygtigheden var på 107%, men med tilsætning af 2-DG, cellelevedygtighed faldt til 72% p 0,001 (. Figur 3F). MK-2206 udstillet synergistiske virkninger med 2-DG. Efter 24 timer, levedygtighed MK-2206 behandlede celler var 78%, hvilket faldt op til 40% efter tilsætning af 20 mM 2-DG (p 0,001, Data A i File S1).

SC-66 og MK-2206 hæmmede mTOR /AKT-vejen effektivt i C33A celler

for at udforske virkningerne af AKT hæmning på mTOR og dens downstream mål i C33A celler, vi undersøgte phosphorylering status mTOR pathway komponenter ved Western blot og brugte p70S6K som markør for mTOR aktivering [18]. SC-66 fuldstændigt inhiberet p70S6K phosphorylering af 3 timer (Fig. 4A). MK-2206 inhiberede p70S6K aktivering, men der var et let reaktivering af 4 timer. MK-2206 inhiberede mTOR pathway komponenter såsom mTOR, 4E-BP1 og S6 effektivt af 2 timer. MK-2206 hæmning af mTOR pathway synes at være forbigående som p70S6k stadig var aktiv efter 4 h (data D i File S3). SC-66 og MK-2206 inhiberede effektivt alle de tre phosphorylerede former af AKT (Thr308, Thr450 og Ser473) på en dosisafhængig måde, der antyder, at MK-2206 primært virker ved mTORC1 (fig. 4C og Data F i File S3). Dette understøttes af den iagttagelse, at SC-66 var mere effektive til at inhibere AKT substrater såsom PRAS 40, GSK3-β og FOXO1 (fig. 4B) sammenlignet med MK-2206, især PRAS40 som er i mTORC1 kompleks [19] (Data E i File S3). P70S6k blev phosphoryleret efter 4 timer af MK-2206 behandling tyder mTOR pathway inhibering var forbigående (Supplemental data).

(A-C) C33A celler blev behandlet med stigende koncentrationer af SC-66 (6-10 ug /ml) i 3 timer og lysater blev fremstillet til western blot.

Rapamycin, et mTOR inhibitor, lindrer feedback-hæmninger og inducerer AKT Ser473-phosphorylering i en mTORC2-afhængig måde der fører til yderligere AKT aktivering [20 ]. For at teste for denne effekt ved hjælp af vores hæmmere vi udført en længere inkubation af cellerne med SC-66 for 18-24 timer. Vi fandt, at p70S6K, markør af mTOR aktivering, faldt selv efter 18 og 24 timers behandling. SC-66 behandling faldt aktivering af Akt substrater, Thr308 og Thr450 by18 og 24 timer. Thr308 niveauer gik op i forhold til 3 timer prøve, men stadig viste en faldende tendens på 18-24 timer (data ikke vist). Alle disse resultater antyder, at SC-66 inhiberes effektivt både mTORC1 /2 og AKT. MK-2206 viste sig at handle hovedsageligt gennem mTORC1 vej med svag reaktivering af vejen efter 4 timer.

SC-66 hæmmede glukoseoptagelse og membran translokation af glukosetransportører

Glucose optagelse blev testet ved at udføre

in vitro Salg FDG uptake assays i nærvær og fravær af SC-66 (35 ug /ml). Vi fandt, at SC-66 inhiberede glucoseoptagelse betydeligt målt som reduceret tællinger per minut (fig. 5A). Yderligere vi bestemt effekten af ​​SC-66 på Glut1 og GLUT4 translokation til membranen. Til dette en membran cytoplasma fraktionering blev udført efter behandling af celler med SC-66 (5 ug /ml) i 24 timer. SC-66 inhiberede Glut1 og GLUT4 translokation fra cytoplasmaet til membranen som bestemt ved Western blot (fig. 5C). Vi bekræftede denne med immunfluorescensfarvning (fig. 5D). Alle disse resultater antyder, at mTOR inhibering med SC-66 resulterede i nedsat glucoseoptagelse gennem Glut1 og GLUT4 tilbageholdelse i cytoplasmaet.

A) C33A celler blev behandlet med SC-66 (35 ug /ml) eller blok (cytochalasin B) i 30 minutter før inkubering med

18F-fluordeoxyglucose som beskrevet i metodeafsnittet. Grafen repræsenterer tællinger per minut værdier, s 0,01 til sammenligning af FDG alene (celler alene) versus FDG + SC-66. B) C33A celler blev behandlet med SC-66 (0-5 ug /ml) i 3 og 24 timer og Glut1 niveauer blev analyseret ved western blot. C) C33A celler blev behandlet med SC-66 (0, 1 og 5 ug /ml) i 24 timer. Membran og cytosol fraktioner blev fremstillet under anvendelse af et kit (MemPER) fra Peirce Biotechnology. Disse subcellulære fraktioner blev derefter blandet med prøvepuffer og inkuberet ved 65 ° C i 20 minutter før de anbringes på gelerne for western blot for Glut1 og GLUT4. D) Immunofluorescens blev udført på C33A celler efter at behandle dem med SC-66 (1 ug /ml) i 3 timer i et kammer slide.

AKT-inhibitor SC-66 inhiberer glycolysen

For at afgøre, om AKT hæmning resulterede i reduceret glycolysen, vi målte ATP og NADPH-niveauer efter SC-66 behandling. Vi fandt, at ATP-niveauer blev reduceret signifikant efter SC-66 behandling, og NADPH-niveauer blev forøget, hvilket antyder, at alternative veje for glucosemetabolisme såsom pentosephosphat shunt, kan være mere aktiv i C33A celler, når AKT signalering undertrykkes (fig. 6A og 6B). Total lactat niveauer blev også faldet i C33A celler efter behandling med SC-66 (fig. 6C og 6D). Alle disse resultater viser, at inhibering af AKT undertrykker glykolyse i C33A celler. Til bedømmelse for downstream virkninger på tumor cellemetabolisme, monitorerede vi aktiveringsstatus af et substrat for AKT, ATP-citratlyase (ACL) efter SC-66 behandling. C33A celler blev inkuberet med stigende doser af SC-66 og Western blots blev udført. SC-66 inhiberede ACL phosphorylering med 5 og 24 timer, hvilket antyder, at inhibering af AKT kan også påvirke andre aspekter af tumor cellemetabolisme, herunder lipid syntese (fig. 6E).

(A-B) C33A celler blev udsået i T 25 cm

2 vævskulturkolber, behandlet med SC-66 og intracellulære NADPH-niveauer og ATP blev bestemt. Grafen repræsenterer ATP og NADPH uM niveauer baseret på en standard kurve, p 0,01 til sammenligning af kontrol versus SC-66 10 pg /ml 1 og 3 timer og p 0,001 for kontrol versus 30 pg /ml for ATP-niveauer; p 0,01 til sammenligning af kontrol versus SC-66 5 pg /ml 3 timer og p 0,01 kontrol versus 10 ug /ml 3 timer for NADPH-niveauer. (C-D) C33A celler blev podet i T 25 cm

2 vævskulturkolber, behandlet med SC-66 og udskilles lactat blev målt i nm koncentrationer under anvendelse af en standardkurve, s 0,001 til sammenligning af kontrol versus SC -66 5 og 10 ug /ml. (E) C33A celler blev behandlet med stigende koncentrationer af SC-66 (0-5 ug /ml) i 5 timer og 24 timer og lysater blev fremstillet til western blot.

SC-66 reducerer migrationen af C33A celler in vitro

Der er rapporter, der viser rolle AKT i metastatiske proces, herunder celle migration og invasion [21]. At undersøge virkningerne af SC-66 og MK-2206 på cellemigrering vi behandlede celler med 1 ug /ml SC-66 og 2,5 uM MK-2206 i 24 timer og udføres en ridse assay. Vi fandt, at SC-66 inhiberede migration af celler ca. 50% i forhold til kontrol henviser MK-2206 ikke havde nogen virkning (fig. 7).

C33A celler blev behandlet med A) SC-66 (1 og 2,5 ug /ml) og B) MK-2206 (2,5 og 5 uM) i 24 timer. Procent sårheling blev beregnet som beskrevet i fremgangsmåder sektion, s 0,0001 til sammenligning af kontrol versus 1 ug SC-66 og P 0,0001 til kontrol versus 2,5 ug SC-66

Diskussion

i denne undersøgelse udførte vi mutationsanalyse af 140 forbehandling tumorbiopsier og 8 humane cervikale cancercellelinier at screene for mutationer i PI3K /AKT pathway. Dette er den første undersøgelse, så vidt vi ved, at omfattende analysere mutationer i PI3K /AKT pathway i human livmoderhalskræft. Vi identificerede flere mutationer i PI3K /AKT-vejen i humane livmoderhalskræft prøver, herunder aktiverende mutationer i

PIK3CA

(E545K, E542K) og inaktivere mutationer i

PTEN

(R233 *). Mutationsanalyse af livmoderhalskræft cellelinjer afslørede yderligere defekter. C33A celler har både en R233 *

PTEN

mutation og en R88Q

PIK3CA

mutation [22].

Den foreliggende undersøgelse blev også designet til at teste hypotesen om, at livmoderhalskræft celler med ændret AKT aktivering vil være følsom over for AKT-hæmmere. SC-66 og MK-2206 effektivt induceret celledød i C33A celler gennem en ikke-apoptotisk mekanisme. SC-66 viste sig at være en potent mTORC1 /2-inhibitor. SC-66 inhiberede effektivt p70S6k og 4E-BP1 mTORC1 substrater, ud over at inhibere Ser473 og Thr308 phosphorylering af AKT, og aktivering af Akt substrater såsom PRAS40, GSK3-β og FOXO. SC-66 viste synergistiske virkninger med 2-DG, og SC-66 hæmmede yderligere downstream begivenheder såsom translokation af glukose transportører til membran, som resulterede i nedsat glukoseoptagelse. Desuden inhibering af AKT reduceret glycolyse som vist ved nedsat ATP og lactat niveauer og forøget aktivitet af alternative metaboliske veje resulterer i forøget cellulær NADPH. Disse resultater antyder, at AKT inhibitorer formindske livmoderhalskræft levedygtighed ved at interferere med cellulær glucosemetabolisme. Vi hypotesen, at livmoderhalskræft med PI3K /AKT pathway ændringer er afhængige høje glukoseoptagelse og glykolyse for overlevelse. Det skal bemærkes, at aktiveringen af ​​Akt af

PTEN

tab og /eller

PIK3CA

mutationer ville omgå behovet for aktiveringen af ​​vækstfaktorreceptorer (dvs. IGF-1R) at indlede PI3K /Akt /mTOR signaleringskaskade. På denne måde cervicale cancerceller er i stand til at opregulere glucose import og metabolisme selv i fravær af de passende eksterne signaler.

Tidligere er det blevet vist, at inhibering af mTORC2 fører til hurtig hæmning af AKT Ser473 phosphorylering, hvilket accelererer destabilisering processen med Thr308 websted phosphorylering [23]. I overensstemmelse med dette har vi også observeret, at SC-66 medierede en ledsagende reduktion i phosphorylering af Ser473 og Thr308 i C33A celler. Tidligere arbejde fra andre foreslog, at dephosphorylering af AKT på Thr308 stedet fører til mere dybtgående inhibering af AKT funktion end den ville ses fra dephosphorylering af AKT på Ser473 alene [23]. Thr308 er en rest i en tast T-sløjfe i AKT protein og betragtes som en bedre indikator for AKT kinaseaktivitet. Der er uharmoniske data om Ser473 phosphorylering og AKT kinaseaktivitet [24], [25]. Vores resultater viser, at SC-66 hæmmer alle de tre fosforylerede former for AKT.

Der er rapporter om, at mTORC2 er nødvendige for udviklingen af ​​visse kræftformer med

PTEN

tab [26]. C33A celler er

PTEN

defekt, og vi fandt, at SC-66 er en potent mTORC2 hæmmer.

PTEN

R233 * mutation findes i C33A celler kan føre til større intracellulær ophobning af PIP

3 resulterer i øget PI3K signalering og PDK-1-medieret AKT Thr308 phosphorylering [25], [27], [ ,,,0],28]. Vi spekulere at SC-66 udøver sin hæmmende effekt på AKT Thr308 fosforylering indirekte ved at fungere som en PDK-1 hæmmer. SC-66 er måske ikke så effektiv som en inhibitor af PDK-1 som det er for mTOR og AKT, og det forklarer de lidt højere Thr308 niveauer observeret efter længere inkubation. Desuden har vi observeret, at SC-66 er en potent celledød inducer af 24 timer, og dermed reaktivering af AKT kan ikke være et problem

in vivo

. I konkordans med dette begreb, fandt vi, at i mus behandlet med en kombination af cisplatin og SC-66 blev alle p-AKT former inhiberet sammenlignet med monoterapi modstykker.