PLoS ONE: Sonic Hedgehog-Gli1 signalvejen Regulerer Epithelial Mesenchymale Transition (EMT) ved at mediere en ny Target Gene, S100A4, i kræft i bugspytkirtlen Cells

Abstrakt

Mål

pindsvin signalering vej spiller en vigtig rolle i EMT af bugspytkirtelkræftceller, men de præcise mekanismer forblive undvigende. Fordi S100A4 som et centralt EMT moleculer markør blev fundet at være opreguleret på Gli1 i bugspytkirtelkræftceller, vi fokuserede på forholdet mellem Shh-Gli1 signaler og S100 gener familie.

Metoder

På base af cDNA microarray data, vi undersøgte reguleringsmekanisme af Gli1 til nogle medlemmer af S100A gener familie i bugspytkirtelkræft cellelinier for det første. Derefter blev reguleringen af ​​Gli1 til S100A4 gen undersøgt af molekylærbiologiske analyser og pro-metastaser effection af Gli1-afhængige S100A4 blev undersøgt in vitro. Endelig blev udtryk for Shh, Gli1, S100A4 og E-cadherin i bugspytkirtelkræft væv undersøgt ved hjælp af immunhistokemi analyser.

Resultater

Fem medlemmer af S100 gener familien, S100A2, S100A4, S100A6, S100A11, og S100A14 viste sig at være nedreguleret betydeligt på Gli1 knockdown. Gli1 forstærker forudsigelse kombinerer med in vitro-data viste, at Gli1 regulerer primært S100A familiemedlemmer via cis-virkende elementer. Faktisk er de data indikerer S100A4 og vimentin gener blev opreguleret markant med Shh /Gli1-udtryk stigende og E-cadherin var signifikant reduceret samtidig. Migration af PC celler var signifikant forøget på en dosis-afhængig måde af Gli1 ekspression (P 0,05) og siS100A4 vendte markant reaktion PC celler induceret af L-Shh transduktion (P 0,01).

Konklusion

Vores data etablere en ny forbindelse mellem Shh-Gli1 signalering og S100A4 regulering, der indebærer, at S100A4 kan være en af ​​de vigtigste faktorer i EMT medieret af Shh-Gli1 signalering i kræft i bugspytkirtlen.

Henvisning : Xu X, Su B, Xie C, Wei S, Zhou Y, Liu H, et al. (2014) Sonic Hedgehog-Gli1 signalvejen Regulerer Epithelial Mesenchymale Transition (EMT) ved at mediere en ny Target Gene, S100A4, i bugspytkirtelkræftceller. PLoS ONE 9 (7): e96441. doi: 10,1371 /journal.pone.0096441

Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, USA

Modtaget: Marts 9, 2013; Accepteret: April 8, 2014; Udgivet: 29 juli 2014

Copyright: © 2014 Xu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (81072005, 81172312 og 81.101.839). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen er en af ​​de førende årsager til kræft-relaterede dødsfald i industrialiserede lande [1]. Den dårlige prognose af denne sygdom skyldes hovedsagelig sin tidlige systemiske metastaser [1] – [3]. Et stort antal undersøgelser har vist, at epitelial mesenkymale overgang (EMT) kan være en vigtig mekanisme af bugspytkirtelkræftceller aftagning fra det primære tumorsted og spredning til fjerne organer. Men EMT-initierende signalveje forblive undvigende nu i bugspytkirtelkræftceller. For nylig har hedgehog (hh) signalvejen blevet påvist at være en vigtig promotor af tumorvækst i flere mavetarmkanal cancere [4], [5]. Med hensyn til kræft i bugspytkirtlen, er det blevet vist, at afvigende aktivering af Hh signalvej blev ført fra sonisk pindsvin (Shh) overekspression i de fleste tilfælde [6] – [8]. Et stort antal undersøgelser har vist, at de vigtigste mekanismer i Hh signalvej i kræftceller var at fremme epitel mesenkymale overgang (EMT) [9] – [11]. Endvidere er det blevet vist, at blokering denne vej signifikant inhiberede metastase af tumorceller in vivo og in xenograftmodeller [12], [13].

Da målgener af Gli1 var de centrale mekanismer Hh signalvej, vi forsøgt at forstå dens pro-metastatiske mekanismer identifing målene i Gli1 i bugspytkirtelkræftceller. Som en vigtig pro-metastatisk målgen af ​​Gli1 i bugspytkirtelkræft det skal have følgende karakteristika: For det første, der er effektive Gli1 cis-virkende elementer i dets gensekvens; For det andet, var dens transskription reguleres positivt af Gli1; For det tredje blev det opreguleret i de fleste af pancreascancer væv og dets ekspressionsniveau var positivt korreleret med Hh-signalering; For det fjerde skal dens være et centralt pro-metastatisk funktionel faktor. I tidligere undersøgelse har vi udført en systematisk forskning om target gen profiler upon Gli1 i høj metastatisk bugspytkirtelkræft cellelinje gennem cDNA microarray og fandt, at 5 medlemmer af dette gen familie blev opreguleret af Gli1. Især blev S100A4 som et centralt moleculer markør fremme EMT-processen i bugspytkirtelkræft fundet at være opreguleret mere end 3 gange i denne undersøgelse. På basis af disse undersøgelser, vi fokuserede på forholdet mellem Shh-Gli1 signaler og S100 genfamilien.

I denne undersøgelse analyserede vi Gli1 afventende steder inden DNA-sekvenser fra S100 gener familie med bioinformatik værktøjer og databaser. Desuden har vi forsøgt at finde nye forbindelser Shh-Gli1 signalvejen med S100 gener familie og til at demonstrere pro-metastatisk funktion af S100A4 genet medieret af Shh-Gli1 signaler i bugspytkirtelkræft.

Materialer og metoder

cell kulturer

de humane PC cellelinier, BxPC3, AsPC-1 og Panc-1, var alle kommercielle cellelinjer og vi opnåede disse cellelinjer fra Institut for Cytologi kinesiske Academy of Science.These celle linjer blev meget udbredt i bugspytkirtelkræft forskning [14] – [18]. Tre cellelinjer blev alle dyrket i RPMI-1640 suppleret med 10% føtalt kalveserum ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO2 i luft.

Vektorer konstruktion og celler infektion

Lentiviral transfer vektorer til human Gli1 shRNA eller Shh cDNA blev bygget af Genechem Co., Ltd, Shanghai, Kina. Dette system omfatter lentivirusvektoren pLVTHM, indhylle plasmidet pMD2G, og emballagen plasmid pRSV-REV og pMDlg-pRRE. Lentivirus-Shh (L-Shh) indeholdt et 3,3 kb kodende sekvens for Shh og lentivirus-Gli1i (L-Gli1i) indeholdt Gli1 lille hårnåle-RNA (5′-CTCCACAGGCATACAGGAT-3 ‘) til den målsøgende sekvens af shRNA som tidligere beskrevet [19]. Den lentivirus-kontrol (L-C), der ikke omfatter de Gli1 interferens sekvenser eller Shh cDNA sekvenser tjente som kontrol. Endelig lentivirale konstruktioner blev verificeret via DNA-sekventering for at sikre nøjagtighed. Rekombinant lentivirus blev produceret ved transient transfektion af 293T celler efter en standardprotokol. Når BxPC3, AsPC-1 og Panc-1-celler var omkring 50% sammenflydende i RPMI-1640 indeholdende 2% FCS, blev de inficeret med lentivirus konstruktioner på MOI 5. Cellerne blev høstet efter 72 timer for yderligere forsøg. For at identificere funktionelle L-Shh og L-Gli1i konstruerer, vi rutinemæssigt analyseret Shh og Gli1 udtryk ved QRT-PCR og western-blotting.

S100A4 Forbigående Knockdown

Vi brugte en RNAi-sekvens (siS100A4 ) og en negtive kontrol sekvens (siS100A4 MIS), som har vist effektiv knockdown af S100A4 i humane coloncancer HT29-celler i en tidligere rapport [20]. S100A4 knockdown blev overvåget ved at bestemme dets mRNA og protein-niveauer efter 48 timer ved siRNA transfektion hhv. Og derefter blev cellerne anvendt til Transwell assays. Celler blev lipoficeredes med siRNA’er anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i overensstemmelse med producentens anvisninger.

RNA-ekstraktioner og real time RT-PCR-assays

Total RNA-prøver blev ekstraheret med Trizol-reagens (Invitrogen ) ifølge producentens protokol og 100 ng total RNA blev revers transkriberet i 20 pi volumen og 2 pi cDNA anvendt til PCR i overensstemmelse med producentens anvisninger. (Takara Biotechnology, Dalian, Kina). Primersekvenserne blev set i tabel 1. CT (tærskel cyklus) værdier blev standardiseret til CT værdier GAPDH.

Protein ekstraktioner og vestlige-blotting analyser

I alt protein prøver blev udvundet med RIPA buffer ifølge standardmetoden og prøverne blev normaliseret for proteinindhold ved et kommercielt tilgængeligt kit (Bio-Rad Company). Lige store mængder af protein blev brugt til western-blotting analyser i henhold til standarden protokol for Shh, Gli1, S100A4, E-cadherin, VIM (vimentin) og GAPDH afsløring.

Transwell analyser

Cell invasion assay-24 prøver kits (Chemicon, Bedford, MA) blev anvendt til at undersøge invasion /migration af PC cellelinier. Efter 24 timer inkubation blev migration tællinger af PC celler opnået ved at fotografere membranen gennem mikroskopet. Tællinger blev taget i 5 højeste celler arealer til en stor forstørring (× 200). Middelværdien af ​​felterne talt blev betragtet som migration optælling af PC celler.

Den Formaldehyd Cross-linking chromatin Immunpræcipitation (XChIP) analyser

De XChIP analyser blev udført som de tidligere undersøgelser [21]. Kort fortalt kromatin af AsPC-1-celler (3 x 10

7) blev opsamlet med 1 ml IP buffer indeholdende protease inhibitor cocktails. Chromatin blev klippet ved anvendelse af en sonikator i et is boks (6 runder af 10s bælgfrugter, 350 W, 60 sekunders intervaller) og Tværbinding blev vendt ved tilsætning af 20 pi 5 M NaCl natten over ved 65 ° C. DNA blev ekstraheret under anvendelse af phenol /chloroform-assay. 20 pi DNA blev elektroforeret på en 1,5% agarosegel og resten blev anvendt som input DNA. Chip-grade gede polyklonalt Gli1 antistof (0,1 ug /mL) (Santa Cruz Company) blev anvendt til immunfældning blev musen IgG (0,1 ug /mL) (Santa Cruz Company) tilsat som en tilfældig kontrol, RNA-polymerase II-antistof (0,1 ug /ml) som en positiv kontrol og β-actin-antistof (0,1 ug /ml) som en negativ kontrol. Primeren af ​​promotorregionen af ​​GAPDH (Santa Cruz Company) blev anvendt som en negativ kontrol. (Tabel 2).

luciferasereporteren vektorer analyser

S100A4 promoter luciferase reporter vektorer blev bygget af Genechem Co., Ltd, Shanghai, Kina. Kort fortalt blev et 1,5-kb cDNA-fragmentet (fra -766 til 734 af humant S100A4 gen) med Xhol og HindIII-steder syntetiseret og klonet ind i Xhol og HindIII-stederne i pGL3-basisk luciferase vektor til frembringelse pGL3-1.5 S100A4 indeholdende tre Gli1 biding sites [ACCCACCAC (-349~-357), TGGGTGGTG (-227~-235) og CTGGTGGGG (126~134)]. I mutagenese vektorer blev Gli1 potentielle bindingssteder sekvenser erstattes af henholdsvis GATTCTTAA sekvens, der ikke har nogen kendt bindingssteder for eventuelle transkriptionsfaktorer [22]. De enkelte Gli1 biding websted mutagenese vektorer inkluderet pGL3-1.5 S100A4 Mut 1 [GATTCTTAA (-349~-357), TGGGTGGTG (-227~-235) og CTGGTGGGG (126~134)], pGL3-1.5 S100A4 Mut 2 [ACCCACCAC ( -349~-357), GATTCTTAA (-227~-235) og CTGGTGGGG (126~134)] og pGL3-1.5 S100A4 Mut 3 [ACCCACCAC (-349~-357), TGGGTGGTG (-227~-235) og GATTCTTAA (126~134)]. De mange Gli1 bindingssteder mutagenese vektorer inkluderet pGL3 1.5 S100A4 Mut 1-2 [GATTCTTAA (-349~-357), GATTCTTAA (-227~-235) og CTGGTGGGG (126~134)], pGL3 1.5 S100A4 Mut 1-3 [ ,,,0],GATTCTTAA (-349~-357), TGGGTGGTG (-227~-235) og GATTCTTAA (126~134)] og pGL3 1.5 S100A4 Mut 2-3 [ACCCACCAC (-349~-357), GATTCTTAA (-227~-235 ) og GATTCTTAA (126~134)]. De endelige vektorkonstruktioner blev verificeret via DNA-sekventering for at sikre nøjagtighed. AsPC-1-celler blev transficeret med 5 ug af enten pGL3-1500 S100A4 eller pGL3-1500 S100A4 mutante konstruktioner og 2 ug af renilla luciferase-konstruktion (pGL4.75, Promega) som en intern kontrol til normalisering under anvendelse af Lipofectin reagens metoden protokol. 48 timer efter transfektion blev AsPC-1-celler anvendes til de luciferaseassays ifølge protokollen fra den dobbelte luciferase reporter kit (Promega), og de volues blev readed anvendelse af et luminometer. Hvert forsøg blev gentaget mindst 3 gange, hver gang i tre eksemplarer.

Patientprøver

I dette arbejde, 102 krænges paraffinindlejrede kræft væv fra forskellige pc-patienter (fra 63 mænd og 39 kvinder , gennemsnitsalder 56,7 år, spændvidde 44-75 år) blev analyseret ved immunhistokemi. Alle patienter har aftalt denne forskning. Alle prøver blev indhentet fra de tiende folks hospital i Tongji Universitet, Kina og alle patienter har underskrevet en samtykkeerklæring dokument, hvor de blev enige om, at den kirurgiske fjernelse af malignitet ville blive anvendt i medicinsk forskning, før deres operationer. De etiske udvalg af Tongji universiteter godkendte godkendelsesproceduren og undersøgelserne.

Immunhistokemi analyser

De paraffinindstøbte PC væv blev anvendt til identifikation af Shh, Gli1, S100A4 og E-cadherin. Shh polyklonale antistof blev købt fra R 0,05 blev anset for at være statistisk signifikant

Resultater

Differentiel udtryk for S100 gen familie på Gli1 i aspC-1 celler

Til afgrænse genekspression induceret af Shh-Gli1 signaler i bugspytkirtelkræftceller blev AsPC-1 celler, der anvendes til cDNA microarray-analyser, der sammenligner lentivirus-kontrol vs lentivirus-Gli1i celler. Når fokus på de EMT-relaterede gener i cDNA-data, fandt vi det positive forhold mellem Shh signaler og S100 gener familie [21]. I vores skærm (udtrykket signalerne omfattede 23 medlemmer af S100 gener familie bortset S100A17 og S100A18) 10 gener, S100A10, S100A11, S100A13, S100A14, S100A16, S100A2, S100A4, S100A6, S100P og TCHH, blev udtrykt og 13 gener, S100A1 , S100A12, S100A3, S100A5, S100A7, S100A15, S100A8, S100A9, S100B, S100G, S100Z, RPTN og FLG blev ikke udtrykt i AsPC-1 celler. Sammenligning analyser fra lentivirus-kontrolgruppe vs lentivirus-Gli1i gruppe celler viste, at S100A2, S100A4, S100A6, S100A11 og S100A14 blev opreguleret på Gli1. (Figur 1A). De ti gener, S100A10, S100A11, S100A13, S100A14, S100A16, S100A2, S100A4, S100A6, S100P og TCHH blev plukket til validering af real-time RT-PCR. Som vist i figur 1B, S100A2, S100A4, S100A6 blev S100A11 og S100A14 fundet at være opreguleret, med ingen væsentlige ændringer i de andre fem gener. Disse data er i overensstemmelse med oplysningerne fra cDNA microarray

A:. CDNA microarray data om S100 gen familie; B: differential ekspressionsniveauer af delvise medlemmer af S100 genfamilien af ​​QRT-PCR. Ekspressionen af ​​GAPDH er som en kontrol. *

P

0,05, **

P

. 0,01

Predicted Gli1 biding sites og formodede Gli1 målgener inden S100A genfamilien

for yderligere at studere den mekanisme af Shh-Gli1 signalvejen om regulering af S100 gen familie, vi hentede DNA-sekvenserne i S100A gener fra Gene Bank og analyseret homologe sekvenser af Gli1 biding websted (GACCACCCA) ved at udnytte Blastz bioinformatik værktøj . Bioinformatik data viste, at næsten alle medlemmerne af S100A genfamilien indeholder mange højt konserverede homologe sekvenser (forskellen er ikke mere end én base), og disse formodede Gli1 biding sites udviste karakteristika klyngen arrangement. Tabel 3 viste den formodede Gli1 afventende lokaliteter i proksimale regulatoriske region, der indeholder intergeniske regioner, intrageniske regioner, untranscripted regioner og uoversatte regioner (ikke mere end 5,0 kb væk fra TSS). De data sandsynligvis confered en noget højere samlet grad af dokumentation for, at disse kandidater er faktisk forskelligt udtryk i fastsættelsen af ​​kræft i bugspytkirtlen, muligvis som efterfølgende mål for en afvigende genaktiveres.

Det nye mål genet og dets effektiv Gli1 bindingssteder identifikation i AsPC-1

PCR primere til XChIP analyser blev designet i henhold til 1,5 kb lange promotor-sekvenser af S100A2, A4 og A6 gener, som indeholder flere forudsagte Gli1 biding sites (64~72 , 326~334, 418~426 for S100A2; -349~-357, -227~-235, 126~134 for S100A4,. -246~-254, 786~794 for S100A6 homologi af hvert websted er 89%. ). (Tabel 3). Resultaterne af XChIP analyser viste, at transskription faktor Gli1 bundet til initiativtagerne til S100A2, 4 og 6 gener i henholdsvis dyrkede AsPC-1 celler (Figur 2)

M:. DNA Marker; PC: RNA-polymerase II-antistof til XChIP positiv kontrol; IP: Gli1 XChIP; IGG: muse-IgG til XChIP tilfældig kontrol; NC:. P-actin antistof til XChIP negativ kontrol

Resultater af luciferaseassays viste, at promotoraktiviteter af pGL3-1500 S100A4 steg med ekspressionsniveauer af Gli1 genet på en dosisafhængig måde (

P

0,05). Den pGL3-1.5 S100A4 Mut 2 eller 3 havde ingen signifikant effekt på luciferaseaktivitet (

P

0,05), dog pGL3-1.5 S100A4 Mut en nedsat luciferaseaktivitet betydeligt i forhold til pGL3-1.5 S100A4 (

P

0,05), hvilket tyder på, at site 1 kunne være forstærkere af Gli1. Den luciferaseaktiviteten af ​​plasmider indeholder site 1 steget markant (

P

0,01), og at af plasmider indeholder site 2 eller 3 ikke ændre sig væsentligt (

P

0,05). (Figur 3A, B, C). Rækkefølgen af ​​site 1, ACCCACCAC, var også blevet påvist at blive anerkendt og sis-aktiveret af Gli1 proteiner tidligere [24], [25]

A:. S100A4 luciferase aktivitet stiger med stigende udtryk niveau af SHh i AsPC-1-celler. De pGL3-1.5 S100A4 og Renilla luciferase vektorer blev transient transficeret ind i L-Gli1i smittet, L-C inficeret eller L-Shh inficerede AsPC-1-celler henholdsvis. Resultater blev normaliseret for transfektionseffektivitet ved anvendelse Renilla luciferase og L-C inficerede gruppe blev arbitrært givet en værdi på 1. B: Relativ luciferaseaktivitet af de S100A4 promotor Gli1 bindingsstedsmutanterne mutanter. AsPC-1-celler transficeret med L-Shh blev transient transficeret 5 mg hver reporter konstrukt herunder pGL3-1.5 S100A4, pGL3-1.5 S100A4 Mut1, Mut2 og Mut3 hhv. Den pGL3-1.5 S100A4 blev vilkårligt givet en værdi på 1 og aktiviteterne i de andre transfektioner var justeret i forhold til denne aktivitet. C: site 1 var ansvarlig for Gli1 transskription. Relativ luciferaseaktivitet fra forskellige AsPC-1 cellegrupper, L-Gli1i infektion, L-Shh-infektion eller LC-infektion, transficeret med forskellige konstruktioner, pGL3 1.5 S100A4 Mut 1-2, Mut 2-3 og Mut 1-3 med Renilla luciferase vektorer . Resultaterne blev normaliseret til transfektion effektivitet ved hjælp Renilla luciferase og LC inficerede gruppe blev vilkårligt givet en værdi på 1. *

P

0,05, **

P

. 0,01

Regulering af Shh-Gli1 signaler til udtryk S100A4 og til invasion /migrering af PC celler gennem mægle S100A4 in vitro

for yderligere at studere pro-metastaser funktion Gli1-afledt S100A4 i pancreas kræftceller, fem grupper af PC celler, L-Gli1i, LC, L-Shh, L-Shh + siS100A4 MIS og L-Shh + siS100A4, blev brugt til at analize reguleringen af ​​Shh-Gli1 signaler til S100A4, E-cadherin og VIM gener ved real time RT-PCR og vestlige-blotting assays. Og så de samme fem gruppe celler blev anvendt til at vurdere invasion /migration af PC celler

in vitro

af Transwell analyser. Resultaterne af QRT-PCR og western-blotting viste, at ekspressionsniveauer af S100A4 og VIM gener blev øget væsentligt ved Shh /Gli1-udtryk stigende. I modsætning hertil blev ekspressionsniveauerne af E-cadherin reduceres væsentligt samtidig. (Figur 4A, C). Desuden S100A4 bankede-down signifiantly tilbageføres nedreguleret E-cadherin og opreguleret VIM induceret af L-Shh transduktion. (Figur 4B, D). Resultaterne af transwell analyser viste migration af PC celler blev signifikant reduceret i L-Gli1i gruppe og steg i L-Shh gruppe sammenlignet med L-C-gruppen (

P

0,05). (Figur 4E). Desuden siS100A4 vendte markant reaktion PC celler induceret af L-Shh transduktion (

P

0,01). (Figur 4F). Det ser således ud, at S100A4 medieret af abnomal aktiveret Shh-Gli1 signalvejen kunne være en af ​​de vigtigste faktorer, pro-migration i bugspytkirtelkræftceller

A:. De relative transskription niveauer af Shh, Gli1, S100A4, E- cadherin og vimentin blev reguleret af L-Gli1i /L-Shh transduktion. B: De relative transkriptionsniveauer af S100A4, E-cadherin og vimentin i L-Shh transficerede celler blev vendt ved siS100A4 transduktion. C: ekspressionsniveauerne af Gli1, S100A4, E-cadherin og vimentin proteiner reguleres af L-Gli1i /L-Shh transduktion. D: ekspressionsniveauerne af S100A4, E-cadherin og vimentin proteiner blev vendt ved siS100A4 transduktion. E: Invasionen /migration af bugspytkirtelkræftceller reguleret af L-Gli1i /L-Shh transduktion blev analyseret med Transwell analyser. F: Invasionen /migration af L-Shh transfekterede celler blev vendt ved siS100A4 transduktion. *

P

0,05, **

P

. 0,01

Sammenhæng mellem ekspression af Shh, Gli1, S100A4 og E-cadherin proteiner i PC væv

resultaterne af immunohistokemi viste, at de positive farvninger af Shh. Gli1 og S100A4 proteiner lokaliseret næsten udelukkende til de neoplastiske celler ved siden af ​​svagt positiv farvning af Shh i ø-cellerne og kroniske pancreatitic kanal komplekse lejlighedsvis blive set i pancreas væv bortset fra kræft. I modsætning hertil blev proteinet ekspression af E-cadherin markant nedreguleret i PC væv sammenlignet med normale tumor-tilstødende væv. Farvningsmønstrene af Shh og S100A4 var diffus cytoplasmatisk type, den af ​​E-cadherin var diffus cytomembrane typen og af Gli1 vise perinukleær cytoplasmatisk og nukleær farvning. Fordi Gli1 blev aktiveret efter indtastning kernen blev prøverne med kun cytoplasmatisk farvning tælles som negativ ekspression. (Figur 5). Immunoreaktivitet nøgletal var 78,43% for Shh (80 af 102), 51,96% for Gli1 (53 102), 81,37% for S100A4 (83 af 102) og 48,04% for E-cadherin (49 102) i pc-prøver. Den Spearman rank test viste, at betydelige positive korrelationer blev noteret mellem Shh, Gli1 og S100A4 på proteinniveauet i PC (Shh vs Gli1: CC = 0,697,

P

0,01; Shh vs S100A4: CC = 0,476,

P

0,01; Gli1 vs S100A4: CC = 0,510,

P

0,01). Omvendt blev de væsentlige negative korrelationer mellem de tre proteiner og E-cadherin bekræftet (Shh vs E-cadherin: CC = -0,278,

P

0,01; Gli1 vs E-cadherin: CC = -0,207,

P

0,05; S100A4 vs E-cadherin: CC = -0,285,

P

0,01)

A:. Stærk cytoplasmatisk farvning for Shh i bugspytkirtelkræft celler (× 400); B: Svagt positiv farvning for Shh i duktal kompleks af kronisk pancreatitis væv (× 400); C: Svagt positiv farvning for Shh i ø-celler med normal cancer side væv (× 200); D: negtive farvning for Shh i normale duktale epitel /acinære celler af cancer side væv (× 200); E: Kræftceller viser stærk nuklear farvning for Gli1 og normale kræft side væv blev negtive (× 400); F: Stærkt positiv perinukleær cytoplasmatisk og del nukleare farvning for Gli1 i bugspytkirtelkræftceller (× 400); G: Stærk positiv cytoplasmatisk farvning for S100A4 i bugspytkirtelkræftceller (× 400); H: Positiv cytoplasmatisk farvning for E-cadherin i bugspytkirtelkræftceller. Sorte pile peger på positiv farvning område og hvide pile peger på negtive farvning område.

Sammenhængen mellem ekspression af fire proteiner og klinisk-patologiske træk af pc-patienter

Den statistiske analyse af data viste, at ekspressionsniveauer af Shh (CC = 0,245,

P

0,05 og CC = 0,254,

P

0,05) og S100A4 (CC = 0,265,

P

0,01 og CC = 0,220,

P

0,05) proteiner blev positivt korreleret med tumor størrelse og lymfeknudemetastaser og af Gli1 protein blev positivt korreleret med lymfeknudemetastaser (CC = -0,370, P 0,05). Der blev dog ikke signifikant sammenhæng fundet mellem de fire proteiner og alder, køn, tumor placering og differentiering.

Diskussion

Under væv morfogenese aktivering af Hh signalvej næsten ledsage forekomsten af ​​EMT og dette fremgangsmåde er påkrævet for migration af Hh-responsive celler [26], [27]. Det blev rapporteret, at mekanismerne i Shh-Gli1 signalvej fremme maligne tumorer, der er involveret i mange aspekter af maligne biologiske adfærd, men dens vigtigste rolle i tumorer er at fremme EMT og vedligeholde tumor stamceller [28]. I denne undersøgelse, giver vi en systematisk forskning om mekanismen for Gli1 i en høj-metastase bugspytkirtelkræft cellelinje, AsPC-1. AspC-1-cellelinien indeholder både Ki-ras-gen mutation og DPC4 gendeletion som var typiske pancreascancer molekylær patologiske forandringer [29], [30]. Endvidere blev ekspressionsniveauet af Gli1 slået ned moderat ved hjælp af RNA-interferens-system, som var mere i overensstemmelse med den faktiske molekylære patologiske ændring af pancreascancer end kunstige gen knockout. Så målgenet spektrum opnået i vores screening var mere i overensstemmelse med den faktiske situation for bugspytkirtelkræftceller.

Til dato, mindst 25 medlemmer er blevet rapporteret at tilhøre S100 familie i mennesker. Enogtyve af dem er kodet for af gener grupperet på kromosom locus 1q21, kendt som epidermal differentiation kompleks (EDC), der involverer i epitel-afledte celledifferentiering [31]. Det er blevet rapporteret nogle medlemmer af denne familie blev overudtrykt i forskellige cancertyper og deres funktioner kan inddrages metastase og EMT [32] – [34]. EDC indeholder to grupper af hinanden fordelt S100A gener. Den ene gruppe indeholder S100A1, S100A13, S100A14, S100A16, S100A2-S100A7, S100A15, S100A8, S100A12 og S100A9, og den anden indeholder FLG, HRNR (S100A18), RPTN, TCHH, TCHH1 (S100A17), S100A11 og S100A10. De andre gener, der tilhører underfamilierne af S100B, S100P, S100Z og S100G er henholdsvis placeret på kromosom loci 21q22, 4p16, 5q14 og Xp22. Det blev rapporteret, at S100A gener havde en fælles oprindelse i den molekylære evolution mens S100B, af S100P, S100Z og S100G havde forskellige oprindelser, så S100A gener kan have en universel bevarede regulatoriske sekvenser [35]. I betragtning af deres højt konserverede Gli1 bindende homologe sekvenser, er det spekuleret på, at de spiller samme rolle i relation til Gil1, om vi ikke kan udelukke, at de har forskellige funktioner relateret til Gil1. Vores resultater antyder, at ekspressionen af ​​S100A gener familie i PC celler har tre måder: For det første udtrykker og afhængigt Gli1; sekunder, udtrykke, men ikke afhængig af Gli1; tredje, som ikke udtrykker. Combinating Gli1 forstærker forudsigelse med microarray data, vi spekuleret på, at Gli1 reguleret S100A gener gennem cis-virkende elementer kan være en grundlæggende form for regulering. Tidligere undersøgelse havde rapporteret, at S100A7 og S100A9 transskription blev induceret af GlI1 behandling i epidermale celler [25]. Under evolutionær proces nogle S100A gener udtryk kan være slukket på grund af få ukendt repressorsekvens og derefter nogle af disse gener kan tændes igen, men ikke længere blev reguleret af Gli1 som følge af opnåelse af yderligere cis-virkende elementer. Denne hypotese kan til dels fortolke, hvorfor udtryk for S100A familien er præget af væv selektivitet selvom det stadig er mangel på tilstrækkelige beviser. Detaljerede sammenlignende genomforskning undersøgelser mellem forskellige arter, såvel som forskellige S100A gener kan bidrage til længere forstå de nøjagtige mekanismer. I vores mikroassay og de deraf følgende real-time PCR undersøgelser, flere S100A gener, herunder S100A2, S100A4, S100A6, S100A11, og S100A14, blev opreguleret i respons på Gil1. Flere af disse S100A gener, såsom S100A2, A4 og A6 er blevet vist at være involveret i bugspytkirtelkræft. I denne undersøgelse viste data fra XChIP analyser, transkriptionsfaktor Gli1 bundet til de regulatoriske sekvenser af S100A2, A4 og A6 generne henholdsvis AsPC-1 celler, der foreslog, at disse gener kan være cis-reguleret af Gli1.

Undersøgelser har vist, at de funktioner, S100 gen familiemedlemmer var komplekse og forskelligartede og Hidtil har kun S100A4 viste sig at være tæt forbundet med EMT-processen. Desuden er der i tidligere undersøgelser, vi har foreslået den hypotese, at S100A4 gen kan være en af ​​de vigtigste faktorer i EMT molekylære netværk reguleret af Shh-Gli1 signalvejen i bugspytkirtelkræftceller [19]. Derfor blev S100A4 gen anvendt som et eksempel til at udforske forholdet mellem Shh-Gli1 signaler og S100 genfamilien. Som en kendsgerning, har talrige undersøgelser indikerede, at S100A4 proteinniveauer i cancervæv, bugspyt og serum fra patienter med kræft i bugspytkirtlen blev signifikant forøget [36] – [38]. Nogle undersøgelser har antydet, at S100A4 kunne anvendes som en potentiel biomarkør for pancreascancer [39]. Imidlertid blev hvorfor S100A4 gen overudtrykt selektivt i PC var usikker. Måske S100A4 genet kunne reguleres af visse aktiveres selektivt signalvej samtidig i bugspytkirtelkræft. I den foreliggende undersøgelse, vi for første gang fundet, at ekspressionsniveauerne af S100A4 protein var korreleret positivt med aktiviteten af ​​Shh-Gli1 signaler i bugspytkirtelkræft væv og Gli1 protein opreguleret S100A4 mRNA gennem cis-aktivering måde PC celler, som etablerede en nøjagtig molekylær vej fra Shh-Gli1 signaler til S100A4 i PC celler.

Selvom aktivering af Hh signaler næsten ledsaget forekomsten af ​​EMT, til dato, var der ingen tegn på, at Gli1 direkte reguleret Snail /Slug transskription. Det er blevet rapporteret, at S100A4 og E-cadherin omvendt var reguleret i flere cellesystemer og S100A4 fremmet udtryk for væsentlige transkriptionsfaktorer, Twist og Snail, i EMT-processen, samt mesenkymale markører, herunder VIM og MMP [40] – [42].