PLoS ONE: Strukturel modellering og DNA Binding autohæmning Analyse af Ergp55, en kritisk transskription faktor i prostata Cancer

Abstrakt

Baggrund

Ergp55 protein tilhører Ets familie af transskription faktor. ETS-proteiner er stærkt bevaret i deres DNA-bindende domæne og involveret i forskellige udviklingsprocesser og regulering af kræft stofskifte. At studere strukturen og DNA-bindende autohæmning mekanisme Ergp55 protein, har vi produceret fuld længde og mindre polypeptider af Ergp55 protein i

E. coli

og karakteriseret ved hjælp af forskellige biofysiske teknikker.

Resultater

Ergp55 polypeptider indeholder store mængder af a-helix og random coil strukturer som målt ved cirkulær dichorism spektroskopi. Den fulde længde Ergp55 danner en fleksibel og langstrakt molekyle som afsløret ved molekylær modellering, dynamik simulering og strukturelle forudsigelse algoritmer. De bindende analyser af Ergp55 polypeptider med mål-DNA-sekvenser af E74 og økonomidirektører initiativtagere viser, at længere fragmenter af Ergp55 (uden for Ets-domæne) viste tegn på auto-hæmning. Denne undersøgelse viste også de dele af Ergp55 protein, der formidler auto-hæmning.

Betydningen

Den aktuelle undersøgelse vil støtte i udformningen af ​​de forbindelser, der stabiliserer hæmmede form af Ergp55 og hæmmer dets binding til promotor DNA. Det vil bidrage til udviklingen af ​​lægemidler rettet mod Ergp55 for prostatakræft behandling

Henvisning:. Gangwar SP, Dey S, Saxena AK (2012) Strukturel modellering og DNA Binding autohæmning Analyse af Ergp55, en kritisk transskription faktor i Prostatakræft. PLoS ONE 7 (6): e39850. doi: 10,1371 /journal.pone.0039850

Redaktør: Vladimir N. Uversky, University of South Florida College of Medicine, USA

Modtaget: 5 maj 2012; Accepteret: 31. maj 2012; Udgivet: 28 juni 2012

Copyright: © 2012 Gangwar et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet blev støttet af bevilling fra Ministeriet for Videnskab og Teknologi (DST) New Delhi, Indien (No-SR /SO /HS-05/2009). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

ETS familie proteiner deler meget konserveret bevingede helix-turn-helix DNA-bindende domæne og binder sig til konsensus DNA kerne sekvens 5′-GGA (A /T) -3 “[1]. ERG proteiner tilhører Ets familie af transskription faktor. Erg genet omlejret i human myeloid leukæmi [2], 5-10% af patienter med Ewings sarkom [3]. I begge tilfælde kromosomale translokationer resulterer i ekspressionen af ​​onkogene fusionsproteiner sammensat af Erg og medlem af Tet-underfamilien af ​​RNA-bindende proteiner. Erg protein er essentiel for definitiv hæmatopoiese, voksen hæmatopoietisk stamcelle funktion og vedligeholdelse af normale perifere blod blodplade tal [4]. De TMPRSS2-Erg fusion onkogen udskrifter observeret i prostata cancer celler er signifikant associeret med aggressiv cancer, metastatisk spredning og øget sandsynlighed for at dø [5].

Erg genet koder fem proteiner, Erg-1, Erg-2 , Ergp55, Ergp49 og Ergp38 som følge af forskellig splejsning, polyadenylering eller initieringskodon. Den Ergp55 isoformen indeholder fire funktionelle domæner, der er involveret i DNA-binding, transkriptionel aktivering og negativ regulering af transaktivering [6]. De Ergp55 protein former dimer med sig selv og med to andre isoformer Ergp49 og Ergp38 via PNT og Ets domænet [7]. Den centrale domæne Ergp55 opfører sig som hæmmende domæne på dimerisering og dens fjernelse forbedrer transaktiveringsfunktion ejendommen (7). De kritiske rester af Ets domæne af Ergp55, der medierer Ergp55-jun /fos-DNA ternære kompleksdannelse, er blevet identificeret og karakteriseret [8].

Hidtil tertiære struktur af enhver fuld-længde Ets protein er ikke bestemt. Imidlertid strukturer af DNA-bindende domæner af adskillige Ets-proteiner er blevet bestemt under anvendelse af røntgenkrystallografi og kernemagnetisk resonans-teknikker [9] – [16]. Den Gonome hele analyse af Ets-familie-DNA-bindende

in vitro

in vivo

er blevet undersøgt for nylig [17].

Den præcise mekanisme, hvormed, Ergp55 protein virker på transskription er ikke forstået. For at forstå strukturen og DNA-bindende autohæmning mekanisme Ergp55, vi udførte cirkulær dichorism, molekylær modellering og teoretisk strukturel forudsigelse analyse på Ergp55 polypeptider. For at forstå det DNA-bindende autohæmning mekanisme blev bindingsundersøgelser af Ergp55 polypeptider med DNA-sekvenser af E74 og økonomidirektører promotorer gennemføres. Vores resultater viste, at (i) Ergp55 polypeptider indeholder høj procentdel af α-helix og random coil struktur (ii) fuld længde Ergp55 er en fleksibel og langstrakt molekyle (iii) længere fragmenter ud over den kanoniske Ets domæne Ergp55 viste tegn på autohæmning.

Materialer og metoder

Konstruktion af Ergp55 plasmider

Den fulde længde Erg

1-479 og Erg

112-399 gener blev klonet i pET28a (+ ) vektor. ERG

1-399 og Erg

307-399 gener blev klonet i pRSETA og pET21a (+) ekspressionsvektor. Alle deletionsmutant gener blev amplificeret fra fuld-længde Erg

1-479 plasmid anvendelse af polymerasekædereaktion.

(A) Vist her aminosyresekvenserne fuld længde Ergp55 uden 6xHis-tag og spaltningssted. Resterne blev fremhævet efter størrelsen af ​​Ergp55 domæner, NTD (gul), PNT (grøn), CAE /CD (blå /cyan), Ets (rød) og CTD (sort). (B) Vist her de Ergp55 konstruktioner anvendt i forsøgene (farvesammensætning samme som i fig. 1A). De mærkede rester definerer sekvensen af ​​begyndelsen og slutningen af ​​konstruktioner.

Aestericks

betegne position 6xHis tag på forskellige Ergp55 konstruktioner.

Rensning af Ergp55 polypeptider

Erg

1-479, Erg

1-399, Erg

112-399 og Erg

307-399 plasmider blev omdannet til

E. coli

. BL21 (DE3) celler. Cellerne blev dyrket i 3 liter Luria Bertani medier indeholdende passende antibiotika ved 37 ° C, indtil OD

600 nået til 0,6. 0,125 mM IPTG blev induceret ved 37 ° C og kultur yderligere omrystet i 4 timer ved 220 rpm. Cellerne blev høstet ved centrifugering ved 6000x

g

i 10 ° minutter ved 4 ° C. Cellerne blev suspenderet i 50 ml lysepuffer indeholdende (25 mM Tris-HCI pH 8,0, 300 mM NaCl, 1 mM benzamidin-HCI, 0,1% Triton X-100, 5% glycerol, 3 mM 2-mercaptoethanol, 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid fluorid og 0,5 mg /ml lysozym) og sprængt ved sonikering ved 4 ° C. Det rå lysat blev centrifugeret ved 25000 x

g

i 20 minutter ved 4 ° C. Supernatanten blev fyldt på Ni-NTA-søjle, præ-ækvilibreret med bindingspuffer (25 mM Tris-HCI pH 8,0, 300 mM NaCl, 1 mM benzamidin-HCI, 5% glycerol, 2 mM 2-mercaptoethanol, 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid og 10 mM imidazol). Proteinerne blev elueret fra søjlen med elueringspuffer (25 mM Tris-HCI pH 8,0, 300 mM NaCl, 1 mM benzamidin-HCI, 5% glycerol, 3 mM 2-mercaptoethanol, 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid og 250 mM imidazol). De eluerede fraktioner blev samlet, koncentreret og fyldt på Sephacryl S-200 HR gelfiltrering søjle præ-ækvilibreret i puffer (25 mM Tris-HCI pH 8,0, 150 mM NaCl, 3 mM 2-mercaptoethanol og 5% glycerol). De oprensede proteiner blev koncentreret til 10 mg /ml under anvendelse af Amicon ultra centrifugal filterindretning (Mw afskæring 10 kD). Proteinkoncentrationen blev målt ved UV-stråling ved 280 nm ved anvendelse af ekstinktionskoefficienten beregnes med ExPASy software (https://us.expasy.org/tools/protparam.html).

kromatogram af (A) fuldstændig længde Erg

1-479 (B) Erg

1-399 (C) Erg

307-399 polypeptider vises

112-399 og (D) Erg. SDS-PAGE analyse og beregnet molekylvægt på hvert protein er angivet på hvert kromatogram.

N-terminal proteinsekventering og ionspray massespektrometri bekræftede identitet og renhed af Ergp55 polypeptider. Proteinkoncentration blev bestemt under anvendelse af absorbans ved 280 nm. Coomassie brilliant blue-farvet SDS-PAGE-analyse viste, at alle Ergp55 polypeptider oprenset mere end 95% renhed. Alle proteiner blev opbevaret ved -20 ° C.

overfladeplasmonresonans eksperimentindstillinger

Biosensor undersøgelser blev udført under anvendelse af BIAcore 2000 (Biacore Pharmacia Biosensor AB, Uppsala Sweeden) udstyr [18]. Alle eksperimenter blev udført ved 25 ° C i HBS-buffer indeholdende [10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 50 mM EDTA, 0,005% P20 som overfladeaktivt middel). Eftersom alle Ergp55 polypeptider indeholder 6xHis tag enten N- eller C-terminal, sensor chip, der indeholder høj densitet af immobiliseret Ni-NTA er et ideelt tag at immobilisere disse proteiner. Indledningsvis blev flowcellerne chippens aktiveres ved at passere nikkelchlorid opløsning over det. 40 ul af hver Ergp55 polypeptid

f.eks

., Erg

1-479 (0,14 ug /ul), Erg

1-399 (0,19 ug /ul), Erg

112-399 (0,92 ug /ul) og Erg

307-399 (0,17 ug /ul) injiceret i forskellige flowceller af Ni-NTA-chip ved strømningshastighed på 10 ul /min.

i tal (A ) Erg

1-479 (B) Erg

1-399 (C) Erg

112-399 og (D) Erg

307-399 polypeptider blev immobiliseret på Ni-NTA chip. Tre koncentration (1, 2, 3 uM) af DNA-sekvensen af ​​E74-promotoren injiceret på hver immobiliseret Ergp55 polypeptid.

I forskellige flowceller af Ni-NTA-chip, efter RU enhed af hver Ergp55 polypeptid immobiliseret

f.eks

., Erg

1-479 (2904 RU), Erg

1-399 (2848 RU), Erg

112-399 (2825 RU) og Erg

307-399 (247 RU), hvor 1 RU svarer til immobiliseret protein koncentration -1 pg /mm. Bindingsforsøg blev udført med tre forskellige koncentrationer [1, 2, 3 uM) af DNA-sekvensen af ​​E74-promotoren (5 ‘TACCGGAAGT 3’) i HBS-buffer og injiceres over immobiliserede Ergp55 polypeptider ved flowhastighed på 10 pl /min. Lignende forsøg blev udført under anvendelse af DNA-sekvensen af ​​økonomidirektører promotorsekvens (5’GACAGGATGTG 3 ‘). Den Sensogrammet lov til at køre for en anden 4 min. Regenerering af biosensoroverfladen blev udført under anvendelse af 30 s puls af 1 mM NaOH ved strømningshastighed på 10 ul /min. Associate og dissociation kinetiske konstanter blev beregnet ved BIAeveluation 3,0 software ved hjælp af simple 01:01 Langmuir model med den antagelse, at tætheden af ​​Ergp55 polypeptider på sensoren chippen var ikke høj nok til at understøtte bivalent DNA-binding.

I tal ( A) Erg

1-479 (B) Erg

1-399 (C) Erg

112-399 og (D) Erg

307-399 polypeptider immobiliseres på Ni-NTA-chip. Tre forskellige koncentration (1, 2, 3 uM) af DNA-sekvensen af ​​økonomidirektører promotor injiceret på hver immobiliseret Ergp55 polypeptid.

Circular dichorism

CD-målinger blev registreret ved hjælp Chirascan

TM CD spektropolarimeter (Applied Photophysics) med et vandbad for at opretholde den konstante temperatur. De Ergp55 polypeptider blev fortyndet til 0,2 mg /ml i 10 mM natriumphosphatpuffer, pH 8,0 og sat på 0,1 cm kvarts kuvette. Emnet i alle eksperimenter var 10 mM natriumphosphatpuffer, pH 8,0. Den endelige spektret var i gennemsnit tre sekventielle scanning.

(A) CD spektre af Erg

1-479, Erg

1-399, Erg

112-399 og Erg

307-399 polypeptider registreret fra 200 nm til 260 nm. (B) Temperatur inducerede udfoldning af fuld længde Ergp55 protein. Plottet (indre) indeholdende gennemsnitlig rest ellipticitet versus temperatur angiver denaturering af a-helixer af foldet fuld længde Ergp55.

I termisk denaturering undersøgelse af fuld længde Ergp55, CD-spektre blev registreret ved 10 ° C tilvækst startende fra 10 ° C til 90 ° C. Før måling blev prøvekuvetten ækvilibreret ved hver temperatur. Temperaturmålinger blev taget inden kuvetteholderen aftalt med temperatur vandbad. Alle cd-data blev konverteret til at betyde restkoncentrationer ellipticitet (deg. Cm

2 /dmol). Den Dichroweb serveren [19] blev anvendt til at estimere mængden af ​​sekundær struktur i Ergp55 polypeptider fra cd spektre.

Sekundær struktur forudsigelse

SOPMA [20], GOR [21] og PSIPRED [ ,,,0],22] algoritmer blev anvendt til at forudsige den sekundære struktur indholdet i fuld længde Ergp55, som viste ~21% α-helix, 12-15% β-sheet og 65-69% random coil strukturer.

(A) PSIPRED program analyse af fuld længde Ergp55. (B) Strukturel model af fuld længde Ergp55 efter molekylær modellering og dynamik simulering analyse under anvendelse GROMACS program (C) den forstyrrede forudsigelsen af ​​DISOPRED for (a), NTD (b), PNT (c), CAE /CD (d), ETS og (e), CTD regioner Ergp55.

Modellering af Ergp55 polypeptider

Phyre server [23] blev anvendt til at opnå strukturen i fuld længde Ergp55 protein (1-479 rester). Serveren gav strukturen af ​​PNT domæne (95-221 rester) af Ergp55 hjælp skabelon FBF-2YTU (opløsning struktur SAM-PNT domæne af humant ven leukæmi integration faktor-1 transskription faktor, endnu ikke offentliggjort). NMR-løsningen struktur PNT domæne (108-201 rester) blev opnået fra Protein Data Bank (FBF-1SVO) [24]. Den Phyre server gav også strukturen af ​​Ets domæne (284-412 rester) af Ergp55 ved hjælp af skabelonen FBF-2NNY (forordning af transskription faktor Ets-1 ved DNA medieret homodimerisering) [13]. NMR-struktur Ets domæne Fli1 (306-403 rester) blev opnået fra Protein Data Bank (FBF-1FliA) [25]. Den strukturelle modellering af N- terminal (1-94 rester), centrale domæne (222-283 rester) og C-terminal (413-479 rester) af Ergp55 blev ikke forsøgt på grund af manglende input model.

den Modeler [26] og LOMETS gevindskæring [27] programmer blev brugt til at bygge strukturen i fuld længde Ergp55 bruger følgende indgange (i) strukturelle model af PNT domæne (95-221 rester) af Ergp55 (ii) strukturelle model af Ets domæne ( 284-412 rester) af Ergp55 (iii) NMR struktur PNT domæne (108-201 rester) af Ergp55 og (iv) NMR struktur Ets domæne (306-403 rester) af Fli1. Energi minimering blev udført på modelleret Ergp55 hjælp Gromacs programversion 4.0.5 [28]. 100 trin stejleste anstændigt og 500 trin konjugerede gradient algoritmer blev anvendt i energi minimering beregning.

Molekylære simuleringer

10 ns molekylær dynamik (MD) simulering blev udført på minimeret Ergp55 model med GROMACS program (version 4.0.5) med Gromacs43a2 kraftfelt [28]. Den Ergp55 model blev nedsænket i en kubisk kasse strækker 0,5 nm fra proteinet overflade og solvatiseret med eksplicitte SPC vandmolekyler. Chlorid- og natriumioner blev tilsat for at neutralisere de systemer, som derefter blev simuleret med periodiske randbetingelser. Den solvatiserede Ergp55 model består af 4832 protein-atomer omgivet af ~390, 000 vandmolekyler. Før du kører simuleringen, hele systemet var energi minimeres til 200 gentagelser af stejleste nedkørsler og derefter i ligevægt i 20 ps holde protein atomer behersket. Alle begrænsninger blev fjernet fra proteinet og temperaturen blev gradvist forøget i 10 særskilte trin af 5 ps simuleringer hver.

Berendsen kobling blev anvendt til at opretholde en konstant temperatur på 300 K med en koblingskonstant τ på 0,1 ps. Van der Waals interaktioner modelleret ved hjælp 6-12 Lennard-Jones potentialer med 1 nm cutoff. Coulomb afbrød var 1,0. Tiden trin anvendte var 2 fs og koordinater blev reddet hver 5 ps til analyse af MD baner.

stereokemi simuleret Ergp55 model blev kontrolleret af PROCHECK program CCP4 suite [29]. Sekundær struktur sammensætning blev målt ved DSSP programmet [30] og struktur visualisering af PyMOL programmet [31].

Resultater

Rensning af rekombinante Ergp55 polypeptider

Vi producerede fuld længde og mindre polypeptider (indeholdende delmængde af forudsagte domæner) af Ergp55 i

E. coli

og oprenset ved anvendelse af standard kromatografiske teknikker (fig. 1A-B). Under gelpermeationskromatografi, det oprensede Erg

1-479, Erg

1-399, Erg

112-399 og Erg

307-399 polypeptider elueres ved volumener svarende til deres molekylvægt (fig. 2A-D). Den fulde længde Erg

1-479 elueres ved størrelsen på 53,8 kD, Erg

1-399 polypeptid elueres ved 51,1 kD, Erg

112-399 elueres ved 44,9 kD og Erg

112-399 elueres ved 15,1 kD. ERG

1-479 og Erg

1-399 polypeptider har tendens til at nedbryde, hvis de holdes i 7 dage ved 4 ° C. ERG

112-399 og Erg

307-399 polypeptider ikke nedbrydes med tiden og mere stabil end Erg

1-479 og Erg

1-399 polypeptider.

DNA bindende undersøgelser med anvendelse af E74 og økonomidirektører promotorsekvenserne

funktionaliteten af ​​rensede Ergp55 polypeptider blev vurderet ved hjælp af DNA bindende eksperiment ved hjælp af overfladeplasmonresonans teknik. Den observerede

K

D

værdi Ergp55 polypeptider med DNA-sekvens af E74 promotor var

f.eks

., Erg

1-479 ~ 704 nM, Erg

1- 399 ~ 217 nM, Erg

112-399 ~ 115 nM og Erg

307-399 ~ 65 nM (fig. 3A-D). Disse resultater viste, at Ets domæne af Ergp55 (Erg

307-399) har den højeste affinitet for E74 promotor-DNA-sekvens. Det DNA-bindende affinitet aftager ~ 2 gange for Erg

112-399 polypeptid, -3 fold for Erg

1-399 polypeptid og -10 fold for fuldlængde Erg

1-479, sammenlignet med Erg

307-399 polypeptid (Ets domæne). Disse resultater indikerer, at N- samt C-terminale domæner med hensyn til Ets domæne er involveret i auto-inhibering af DNA-binding til Ergp55 protein.

Den observerede

K

D

værdi Ergp55 polypeptider med økonomidirektører promoter sekvens var

f.eks

., Erg

1-479 ~ 232 pM, Erg

1-399 ~ 196 nm, Erg

112-399 ~ 38 uM og Erg

307-399 ~ 0,45 uM (fig. 4A-D). Disse resultater indikerer også, at Ets domæne har den højeste affinitet til DNA-sekvenser af økonomidirektører promotor. Både N- og C-terminale domæner med hensyn til Ets domæne er involveret i hæmning af økonomidirektører DNA binding til Ergp55 protein.

CD målinger af Ergp55 polypeptider

For at identificere de sekundære struktur indholdet i Ergp55 polypeptider blev CD spektroskopi langt-UV anvendt (fig. 5A). Cd-data blev de-indviklede hjælp DICHROWEB webserver [19] og procentdelen af ​​α-helix, β-sheet og random coil strukturer blev estimeret. CD spektrene af fuld længde Erg

1-479 (Fig. 5A) viste to minima omkring 208 nm og 222 nm, en egenskab ved α-helical struktur. Udfoldning af data forudsiger ~35% α-helix, 15% β-sheet og 49% random coil strukturer i fuld længde Ergp55. CD data af Erg

1-399 polypeptid forudsiger -25% α-helix, 17% β-sheet og 57% random coil strukturer, der viser mindre α-helix og β-sheet struktur sammenligne med fuld længde Erg

1-479 struktur.

i tilfælde af Erg

112-399 polypeptid, cd-data anslår ~29% α-helix, 15% β-plader og 55% random coil strukturer. Dette polypeptid indeholder mindre α-helix, lignende β-arkstruktur sammenlignet med fuld længde Erg

1-479. For Erg

307-399 polypeptid, cd-data anslår -31% α-helix, 10% β-plader og 59% random coil strukturer, som har mindre α-helix og β-sheet struktur sammenligne med fuld længde Erg

1-479 struktur. Men disse værdier er tæt på sekundære strukturelementer indhold i krystalstrukturen af ​​Ets-domænet af Fli-1 (35,7% α-helix, 4,1% β-sheet, 60,2% random coil). ETS domæne Fli-1 er den nærmeste homolog med Ets domæne Ergp55 [32].

termostabilitet fuld længde Ergp55

For at vurdere termostabilitet fuld længde Ergp55, en langt UV- CD spektrum af protein blev målt fra 10 til 90 ° C (fig. 5B). Det fremgår af spektre, som sekundære struktur Ergp55 denaturerer som temperaturen steg. Når middelværdien rest ellipticitet ved 222 nm er afbildet mod temperatur, vendepunktet på sigmoid kurve angiver T

m på 45 ± 2 ° C i fuld længde Ergp55.

Molekylær modellering og dynamisk simulering af fuld længde Ergp55

Den sekundære struktur forudsigelse på fuld længde Ergp55 bruger PSIPRED program er vist i (fig. 6A). De Modeler og automatisk threading LOMETS programmer blev anvendt til at konstruere fuld længde Ergp55 model ved hjælp af (i) strukturen af ​​95-221 rester af Ergp55 ved hjælp af skabelonen FBF-2YTU (ikke offentliggjort), der har 57% sekvens identitet (ii) strukturen af ​​284- 412 rester af Ergp55 hjælp skabelon FBF-2NNY [13] med 40% sekvens identitet og (iii) NMR struktur 108-201 rester af Ergp55 og (iv) NMR struktur 306-403 rester af Ets domæne Fli-1, som har 90 % sekvensidentitet. Energiminimering og simuleringer analyse blev udført på konstrueret Ergp55 model, som gav en fleksibel og aflang struktur (fig. 6B). Den Ergp55 struktur fortsat meget stabil i hele simuleringen tid, hvilket bekræftes af alle indikatorer almindeligt anvendte til at analysere MD simulering.

De 93% rester af Egp55 model ligger i mest begunstigede region Ramachandran plot og en Prosa Z- score på -4,87. DISOPRED [33] analyse på Ergp55 model viste, at N-terminal (1-118 rester) og C-terminal (397-479 rester) er stort set uordnet (undtagen N-terminale 4-23 rester) og resterende Ergp55 struktur (119-396 rester) blev bestilt (fig. 6C). Den strukturerede PNT domæne indeholder tertiær arrangement af fire a-helixer, karakteristisk for store gruppe af SAM-domænet [34]. ETS-domænet består af fire a-helixer og fourβ-sheets, en karakteristik af Ets familiens proteiner. I N-terminale domæne, 15 rest stretch forudsagt at danne α-helix og 3 rester lang helix (219-221 rester) overholdes ii CAE /CD domæne Ergp55. De strækninger af rester i C-terminale domæne af Ergp55 forudsagt kun at have random coil struktur.

N-terminal og C-terminale domæne af Ergp55 er placeret væk fra Ets domæne. Det DNA-bindende fordybning af Ets domæne udsættes for opløsningsmiddel og frie til at binde promotor-DNA-sekvenser. CAE /CD-domænet er anbragt mellem PNT og Ets domæne til at regulere aktiviteten af ​​Ergp55. De N- terminal og C-terminale domæner af Ergp55 er placeret i et område, der ikke forhindrer DNA bindende aktivitet af Ets domæne og spiller en rolle i transkriptionel aktivering og lokalisering af Ergp55.

Diskussion

i aktuelle undersøgelse har vi givet udtryk for fuld længde og mindre polypeptider af Ergp55 i

E. coli

. Kombinationerne af to kromatografitrin (Ni-NTA affinitet og gelpermeationskromatografiprofiler) har givet mere end 95% ren Ergp55 polypeptider baseret på massespektrometri og SDS-PAGE analyse. Forud for strukturelle studier, blev aktiviteten af ​​oprensede Ergp55 polypeptider kontrolleres ved binding undersøgelser under anvendelse af DNA-sekvenser af E74 og økonomidirektører promotorer. Den overfladeplasmonresonans teknik blev anvendt til binding analyse. Disse resultater viste, at Ergp55 polypeptider produceret i

E. coli

var i god kropsbygning og binder specifikt DNA-sekvenser af E74 og økonomidirektører initiativtagere med forskellige tilhørsforhold.

DNA bindende autohæmning af Ergp55.

I tilfælde af E74 promoter sekvens, efter

K

D

værdier blev observeret for Ergp55 polypeptider (i) Erg

307-399, 65 nM (ii) Erg

112-399, 115 nM (iii) Erg

1-399, 217 nM og (iv) fuld længde Erg

1-479, 704 nM. Sammenligning af (i) og (ii) indikerede, at N-terminale region (PNT + CAE /CD-domæner) forud for Ets domæne inhiberer E74 DNA binding til Ets domæne. Sammenligning af (ii) og (iii) viste tegn på øget DNA bindende hæmning ved at have NTD domæne Erg

1-399 polypeptid. Sammenligning af (iii) og (iv) viser, at tilsætning af CTD domæne i Erg

1-399 polypeptid har forbedret inhibering i DNA-binding til Ets domæne. Disse resultater indikerer, at E74 DNA-binding til Ergp55 negativt påvirket af CAE /CD, PNT og NTD domæner placeret ved N-terminalen og CTD domæne placeret C-terminale område i Ergp55.

Med økonomidirektører promotor-DNA-sekvens, efter

K

D

værdier blev opnået for Ergp55 polypeptider (i) Erg

307-399, 0,4 uM (ii) Erg

112-399, 37 uM (iii) Erg

1-399, 196 uM og (iv) fuld længde Erg

1-479, 232 uM. Disse resultater indikerer, at økonomidirektører promotorsekvens binder med forskellige affinitet til Ergp55 polypeptider end E74 promotorsekvens, men mekanismen for DNA-bindende inhibering var den samme som observeret i tilfælde af E74 promotor-DNA-sekvens.

A samvirkende virkende DNA-inhiberende region ( 468-510 rester) blev identificeret ved C-terminalen af ​​Ets-1 transskription faktor [34]. I tilfælde af ERM og PEA3 transkriptionsfaktorer, to domæner lokaliseret ved N- og C-terminalt i forhold til deres ETS- domæne inhiberer DNA-bindende affinitet [35] – [38]. Et domæne svarer til rest 280-360 rester af ERM transskription faktor, der er involveret i hæmning af ERM-DNA bindende kapacitet. Disse domæner er rige på prolinrester generelt devoid a-spiralformede strukturer. Den mekanisme, hvormed to domæner kooperativt hæmme ERM DNA-binding er anderledes end observeret i tilfælde af Ets-1 transskription faktor. DNA bindende aktivitet af Ets domæne er afhængig af autoinhibitory modul [39]. Den bindende affinitet Ets domæne Ergp55 til E74 og økonomidirektører promotor DNA var konsistent til observationslisten opnået i tilfælde af ovenstående transkriptionsfaktorer.

Circular dichorism analyse af Ergp55 polypeptider.

Den cirkulære dichorism teknik var anvendes til at identificere de sekundære og tertiære strukturer af Ergp55 polypeptider. Den fulde længde og mindre Ergp55 polypeptider indeholder høje α-helix og tilfældige coil strukturer. CD data anslår 35% α-helix og 49% random coil strukturer i fuld længde Ergp55 protein. Undersøgelser af termisk stabilitet og temperatur effekt på fuld længde Ergp55 protein indikerede, at protein undergik en ændring af sekundær struktur ved opvarmning. Den sekundære struktur er genvundet efter afkøling proteinet fra 80 ° C til 20 ° C. Kort temperaturændring er usandsynligt, at have nogen effekt på sekundære struktur Ergp55 protein.

Modellering og dynamik simulering af fuld længde Ergp55.

Den molekylære modellering og dynamik simulering analyse viste, at fuld længde Ergp55 erhverver en fleksibel og meget langstrakt struktur. Kun PNT og Ets domæner er struktureret i protein og lange fleksible regioner er observeret ved N- og C-terminale ende af Ergp55. Strukturen af ​​PNT domæne af Ergp55 består af fire-helix bundt Sam lignende struktur (34). ETS domæne Ergp55 er struktureret i en vinget helix-turn-helix med ordningen α

1β

1β

2α

2α

3β

3β

4α

4 [40] – [41]. De centrale CAE /CD-domæner indeholder en lille helix ved position 220. Den sekundære og uordentlig forudsigelse analyse på Ergp55 støttede også fund observeret i modellering og dynamik simulation studier af Ergp55. Alle disse observationer støttede fleksible, ikke-globularity og meget langstrakt struktur Ergp55 protein.

Som konklusion har vi karakteriseret det rekombinante fuld længde og mindre polypeptider af Ergp55 produceret i

E. coli

. De Ergp55 polypeptider oprenset mere end 95% renhed som bestemt ved massespektrometri og SDS-PAGE analyse. De strukturelle data præsenteres her viste tegn på fleksible og meget langstrakt struktur fuld længde Ergp55 protein. Bindingen analyse ved hjælp DNA-sekvenser af E74 og økonomidirektører initiativtagere viser, at længere fragmenter af Ergp55 (ud over den kanoniske Ets-domæne) viste tegn på autohæmning.

Tak

Forfatterne takker Sita R. Meena og Pratibha for deres forslag i aktuelle projekt. Vi anerkender den hjælp fra avanceret instrumentering forskning facilitet (Flyvev) og centrale instrumentering facilitet (CIF) af Jawaharlal Nehru University for at tillade os at udføre cd forsøget. Forfatterne takker SPR udstyr facilitet af AIIMS, Delhi for at tillade os at foretage DNA bindende eksperimenter.