PLoS ONE: Genome Wide hypometylering i hoved- og halscancer er mere udtalt i HPV-Negative tumorer og er forbundet med Genomisk Instability

Abstrakt

Tab af genom-dækkende methylering er et fælles træk for kræft, og graden af ​​hypometylering er blevet korreleret med genomisk ustabilitet. Global methylering af repetitive elementer muligvis opstod som en forsvarsmekanisme mod parasitære DNA elementer, herunder retrotransposoner og virale patogener. I betragtning af de ændringer af den globale methylering i både viral infektion og cancer, undersøgte vi genom-dækkende methylering niveauer i hoved og hals pladecellecarcinom (HNSCC), en cancer kausalt forbundet med human papillomavirus (HPV). Vi analyseret globale hypometylering niveauer i 26 HNSCC prøver sammenlignet med deres matchede normale tilstødende væv, ved hjælp Pyrosequencing-baserede methylering analyser til LINE gentagelser. Derudover undersøgte vi cellelinjer afledt fra en række solide tumorer til LINE og SINE (

Alu

) gentages. Graden af ​​LINE og

Alu

hypometylering varierede mellem forskellige cancer cellelinjer. Der var kun moderat korrelation mellem LINE og

Alu

methylering niveauer, med den række af variation i methylering niveauer bliver større for LINE elementer. LINE hypometylering var mere udtalt i HPV-negative end i HPV-positive tumorer. Desuden genomisk ustabilitet, som målt ved genom-dækkende tab af heterozygositet (LOH) enkelt-nukleotid polymorfisme (SNP) analyse, var større i HNSCC prøver med mere udtalt LINE hypometylering. Global hypometylering var variabel i HNSCC. Dens korrelation med både HPV-status og graden af ​​LOH som et surrogat for genomisk instabilitet kan afspejle alternative onkogene veje i HPV-positive versus HPV-negative tumorer

Henvisning:. Richards KL, Zhang B, Baggerly KA, Colella S , Lang JC, Schuller DE, et al. (2009) Genom-Wide hypometylering i hoved- og halscancer er mere udtalt i HPV-Negative tumorer og er forbundet med genomisk instabilitet. PLoS ONE 4 (3): e4941. doi: 10,1371 /journal.pone.0004941

Redaktør: Sebastian D. Fugmann, National Institute on Aging, USA

Modtaget: September 17, 2008; Accepteret: 13 februar 2009; Udgivet: 18 mar 2009

Copyright: © 2009 Richards et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet delvist af Kleberg Foundation, State of Texas Tobak forskningsmidler, en institutionel forskningsbevilling fra Texas Tobak Settlement Funds (University of Texas MD Anderson Cancer center), og DoD W81XWH-05-2-0027 til RK. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

DNA methylering er en epigenetisk DNA modifikation, der opstår via virkningen af ​​DNA methyltransferaser på CpG-dinukleotider. Methylerede områder af DNA er forbundet med chromatin remodeling, almindeligt forekommende i områder med mere kondenseret kromatin og nedsat transkriptionelle aktivitet [1], [2]. Fornyet interesse for denne proces opstod efter at det blev erkendt, at to typer af afvigende methyleringsmønstre er til stede i cancerceller [1], [3]. Den første er genspecifik hyper-methylering, hvor CpG-øer i promotoren regioner af gener erhverve forøget methylering, generelt fører til reduceret ekspression af den nedstrøms genet. Den anden er hele genomet hypo-methylering, en stor procentdel af som forekommer i repetitive DNA-elementer. I malignitet, er global methylering ofte afvigende reduceret, mens gen-specifikke methylering er ofte afvigende øget. Mens virkningerne af gen-specifikke hypermethylering (

f.eks

, reduceret ekspression af et gen, som er vigtigt for vækstkontrol) er let værdsat, virkningerne af reduceret global methylering, er mere vage [1], [3].

Det er blevet antaget, at DNA-methylering oprindeligt udviklet som en forsvarsmekanisme mod virale og andre DNA patogener som en måde at lukke munden fremmede DNA-sekvenser [4] – [6]. Dette stemmer overens med den observation, at LINE og SINE (

Alu

) elementer, der stammer fra transposoner, er stærkt methylerede i normale celler. Methylering af HPV virale genom på en integration i værtsgenomet er blevet rapporteret, og ændringer i methylering af HPV-DNA er blevet forbundet med tumorigenese [7], [8].

Global methylering er også klinisk relevant, da påvist ved sammenhænge mellem det kliniske resultat og globale methylering niveauer i en række cancertyper [9] – [11]. Fra et mekanistisk synspunkt, synes den globale methylering at være relateret til kræft progression, da tab af global methylering tendens til at blive mere udtalt som forstadier til kræft fremskridt [12], [13]. Desuden i colon cancerceller, tab af LINE methylering er omvendt korreleret med mikrosatellit ustabilitet og er direkte korreleret med kromosom ustabilitet [14], [15].

Vi antager, at de globale methylering niveauer i kræft, repræsenteret ved niveauer af LINE og SINE (

Alu

) methylering kan være korreleret med virusinfektion. Vi har derfor undersøgt LINE methylering i relation til HPV-status i hoved og hals kræft. I modsætning til livmoderhalskræft, som næsten alle er forbundet med HPV-infektion, er HNSCC viralt medieret i kun en delmængde af tilfælde (25-30%) [16]. For at fastslå virkningen af ​​virusinfektion på globale methylering niveauer i HNSCC, vi udviklede pyrosekventering-baserede methylering analyser for repetitive DNA elementer og sammenlignet HPV-positive med HPV-negative kræftformer. Tidligere udgivelser har foreslået, at LINE methylering er variabel i HNSCC, men fandt ikke en sammenhæng mellem HPV DNA status og LINE methylering niveauer [17], [18]. Her viser vi, at den globale hypometylering er variabel i HNSCC og korrelerer med både HPV-status og genomisk instabilitet.

Resultater

LINE /SINE (

Alu

) analyser er præcise og reproducerbare , men viser kun moderat korrelation mellem LINE-1 og

Alu

methylering niveauer

for at analysere globale methylering niveauer, vi tilpasset vores Pyrosequencing-baserede methylering Analysis (PMA) assay [19] til at vurdere methylering af gentagne LINE og SINE (

Alu

) elementer, der svarer til genom-dækkende methylering analyser rapporterede tidligere [20]. At validere de assays, udførte vi en række tests: (1) blanding af eksperimenter med kendte mængder af methyleret /methyleret DNA; (2) methylering undersøgelser af en række cancer cellelinjer at sammenligne LINE til SINE methylering og at undersøge globale methylering tværs af en bred vifte af maligniteter; og (3) methylering af prøver fra forskellige aldre og køn at eliminere disse faktorer som mulige konfoundere globale methylering målinger.

Trinvis intervaller af methyleret DNA blev fremstillet ved blanding universelt umethyleret (U2M.L) DNA med universelt methyleret (UM.L) DNA i forskellige forhold. De blandede prøver blev derefter bisulfitbehandlet og udsat for vores PMA LINE-1 (LINE) og

Alu Hotel (SINE) analyser. Lineær regressionsanalyse viste, at LINE-1 og

Alu

methylering niveauer blev meget tæt forbundet med niveauer forudsagt af input brøkdel af denatureret DNA (

r

= 0,995,

s

– værdi 0,0005 for LINE-1, og

r

= 0,980,

s

-værdi 0,0005 for

Alu

, figur S1). Det skal bemærkes, at selv når input DNA var fuldstændigt methyleret, den maksimale globale methylering procent som målt ved PMA-assayet er lidt over 50%, ikke 100%. Dette er, fordi individuelle repetitive elementer har afveget i rækkefølge over tid; og CpG-dinukleotider, hvis muteret til TpG-dinukleotider, ikke skelnes fra ikke-methylerede CpG’er efter bisulfitbehandling. Dette niveau af baggrundsstøj tages i betragtning ved at normalisere hver resultatet til universelt methylerede kontrol (

dvs

, rapportering procent methylerede reference, eller PMR).

Fire puljer af normale DNA-prøver ( fra perifert blod leukocytter) blev genereret for at vurdere indflydelsen af ​​alder og køn på LINE-1 og

Alu

methylering niveauer. Hver pulje (kvinder ≤ 40 år gamle, mænd ≤40 år, hunner 40 år, mænd 40 år) indeholdt DNA fra mindst fem personer. Der var ingen køns- eller aldersbetinget forskelle mellem puljer i LINE-1 eller

Alu

methylering niveauer (data ikke vist).

Hver LINE-1 og

Alu

methylering assay blev testet på et panel af 23 cancercellelinjer. Forskellige CpG sites blev sammenlignet ved hjælp af tre forskellige line-1 assays og tre forskellige

Alu

analyser, hver hidrører fra forskellige regioner i LINE-1 og

Alu

konsensussekvenser (tabel 1). Som kontrol vi også testet syv normale lymfoblastoide cellelinjer, som viste normale niveauer af methylering (alle 80% i vores LINE-1-assays). I modsætning hertil som forventet fra tidligere rapporter [12] – [14], [21], mange af tumorcellelinier viste global hypometylering, der mest blev udtalt i LINE-1 assays (figur 1). For at kontrollere overensstemmelsen mellem LINE og SINE methylering niveauer (repræsenteret ved vores LINE-1 og

Alu

analyser, henholdsvis), vi sammenlignet graden af ​​korrelation mellem resultaterne fra de tre LINE-1-assays, mellem resultaterne fra tre

Alu

analyser, og mellem de forskellige LINE-1 og

Alu

analyser. Lineær regressionsanalyse viste, at de enkelte LINE-1 analyseresultater var stærkt korreleret med hinanden, for eksempel

r

= 0,93 for sammenhængen mellem L1-2 og L1-3 analyseresultater (figur S2A). Den samme høje grad af korrelation var til stede mellem resultaterne fra

Alu

analyser, for eksempel

r

= 0.82 for sammenhængen mellem Alu-1 og Alu-3 analyseresultaterne (Figur S2B) . Imidlertid blev LINE-1 analyseresultaterne kun moderat korreleret med

Alu

analyseresultaterne, for eksempel

r

= 0,33 sammenligne L1-1 og Alu-1; Figur S2C). Et tilsvarende niveau af moderat korrelation mellem LINE-1 og

Alu

analyser blev rapporteret tidligere i neuroendokrine tumorer [22].

A.

Alu

methylering under anvendelse af Alu-3-assay. B. LINE-1 methylering under anvendelse af L1-3 assay. Resultaterne er rapporteret som PMR (procent methylerede reference) normaliseret til det universelt methylerede reference-dna. Universelt methylerede (U2M), universelt methylerede (UM) kontrol, og normal kontrol DNA fra PBL vises også.

LINE-1 hypometylering af HNSCC patientprøver

Matching normal, primær tumor, og hvor det er muligt, lymfeknudemetastaser af hoved og hals patientprøver (tabel S1) blev testet ved hjælp af vores PMA LINE-1 assays (figur 2). På grund af den større dynamikområde LINE-1 assay og begrænsede prøvemængde blev kun LINE-1 analyser udført i resten af ​​denne undersøgelse. Generelt blev HNSCC primære tumorer og metastatiske lymfeknuder hypomethylated forhold til deres matchende normale tilstødende væv. Med LINE1-1 assay middel primær tumor PMR var 65,5%, medens den gennemsnitlige normale PMR var 90,0% (

s

-værdi = 6,7 × 10

-8 under anvendelse af en parret

t

-test). Men der var ganske lidt af variabilitet i de primære tumorer, der spænder fra 31,2% (alvorlig hypometylering) til 90,8% (normal). Den gennemsnitlige PMR i lymfeknudemetastaser (73,8%; interval 31,8% -93,8%) var også meget variabel, selv i forhold til den tilsvarende primære tumor, gange lavere og nogle gange højere end PMR af den primære tumor, med hvilket det er forbundet.

Parret tumor og normale prøver og, hvor det er muligt, lymfeknudemetastaser blev analyseret for LINE-1 methylering. PMR-værdier er plottet ved anvendelse af normale prøve PMR som x-værdi og primær tumor (cirkler) eller metastase (trekant) PMR som y-værdi. Vandrette linier repræsenterer PMR-værdier for universelt methylering (UM) og umethylerede (U2M) kontrol, normale lymfocytter (grøn) og i fire HNSCC cellelinjer (gul). Box plots til højre viser middelværdien og distribution af primære tumorer og metastaser i den delmængde af prøver, hvor matchede metastaser og primære tumorer var til rådighed.

HPV-positive tumorer fastholde mere LINE-1 methylering end HPV -negative tumorer

Fordi der var så meget variation i HNSCC tumor PMR, vi hypotese, at niveauet for den globale hypometylering kan variere i forskellige undergrupper af HNSCC. At udforske forholdet mellem tab af LINE-1 hypermethylering og HPV-status, vi sammenlignet den gennemsnitlige LINE-1 methylering niveau på tre grupper, der afveg fra deres HPV-status. Den første gruppe (n = 8) blev HPV negative (- /-); den anden gruppe (n = 8) indeholdt HPV-DNA, men var transkriptionelt tavst med hensyn til E6 virale onkogen, hvilket indikerer mangel på ekspression af dette oncoprotein (+/-). Den tredje gruppe af tumorer (n = 8) var positive for HPV-DNA og E6 ekspression (+ /+). Det gennemsnitlige methylering niveauet for de tre grupper af tumorer er statistisk anderledes, med en

s

-værdi = 0,011 for tendensen (figur 3).

Box plots af methylering niveauer (PMR) af HNSCC primære tumorer (til højre i hvert par) og normal tilstødende væv (venstre i hvert par) er vist efter HPV-status. + /+, HPV-positive og udtrykker E6 viral mRNA; +/-, HPV-positive, men transkriptionelt stumt; og – /-, HPV negative

Vi sammenlignede også globalt methylering niveauer i matchede normale tilstødende væv fra de samme tre grupper.. I modsætning til resultaterne for de primære tumorer, var der ingen forskel i de globale methylering niveauer i matchende normale væv og derfor ingen sammenhæng med HPV-status (figur 3). Baseret på en tidligere rapporteret sammenhæng mellem LINE-1 methylering og TNM stadie [18], vi kiggede for en sådan sammenslutning i vores prøvesæt, men fandt ingen (

s

-værdi = 0,31).

Niveauer af LINE-1 hypometylering og LOH i HNSCC tumorer er korreleret

Tyktarmskræft cellelinjer med mere udtalt LINE hypometylering blev tidligere rapporteret til at have en højere grad af LOH [14], [15]. For at undersøge, om denne sammenhæng afholdt sandt i vores HNSCC patientprøver, vi udførte en global LOH analyse ved hjælp 10K SNPChip data. Genotyper blev sammenlignet mellem normal tilstødende væv og matchede tumorprøver; informative loci var dem, der var heterozygote i det normale væv. Figur 4 viser et plot af procentdelen af ​​informative loci for hver primær tumor med LOH versus graden af ​​LINE-1 methylering i samme prøve. Vi passer en lineær trend til de data, som viste en Pearson korrelation på -0,494, med en

s

-værdi = 0,017. Som kontrol af robusthed, vi også beregnet den Spearman (rang-baserede) korrelation, som også var betydelig. Den Spearman korrelationskoefficienten for dette forhold var -0,428 (

s

-værdi = 0,042), om oprettelse at LOH faktisk var signifikant korreleret med graden af ​​LINE hypometylering.

LINE-1 methylering er plottet som PMR, og LOH er den del af 10K SNP loci, der viser LOH forhold til alle informative loci. Pearson korrelationskoefficient er -0,494 (

s

-værdi = 0,01) for sammenhængen mellem de to værdier.

Diskussion

Vi udviklede flere LINE (LINE- 1) og SINE (

Alu

) methylering analyser med PCR primere i bevarede dele af disse gentagne elementer. Disse analyser udnytte flere CpG sites (3-6) for at bestemme methylering niveauer og muliggør den samtidige amplifikation af mange individuelle LINE og SINE elementer i hele menneskelige genom som repræsentative genomiske vartegn til global methylering analyse. Som forventet, skyldes individuel LINE-1 assays var meget godt korreleret med resultater fra andre LINE-1-assays, trods måle methylering i forskellige regioner af LINE-1 sekvens. Det samme gælder for

Alu

assays med høj korrelation mellem resultaterne fra tre forskellige assays. Men når LINE-1 og

Alu

methylering niveauer blev sammenlignet med hinanden, korrelationen var mere beskeden, kun omkring 40%. Årsagerne til denne lavere korrelation kan være relateret blot forskelle i analysesensitivitet: LINE-1-assays varierede fra 0-50% denatureret i blanding studier, mens

Alu

analyser havde mindre amplitude, der spænder fra 0-30% methylerede, muligvis sekundært til højere inter-individuel baggrundsstøj pga sekvens variation mellem individuelle

Alu

elementer (Figur S1). En anden mulighed er, at der er en funktionel eller biologisk forskel mellem de to typer af repetitive DNA i deres vedligeholdelse methylering. LINE gentagelser er hyppigere i gen-fattige områder af genomet, mens

Alu

elementer er mere almindelige i gen-rige regioner [23]. Da den globale methylering kan måles ved en række forskellige metoder, bør betragtes disse inter-assay forskelle, når man sammenligner resultater ved hjælp af forskellige typer af analyser og undersøgelser.

Vores resultater viser fald i den globale methylering i cellelinjer fra en række cancercelletyper (figur 1), svarende til tidligere offentliggjorte resultater for en række forskellige tumortyper [12] – [14], [21]. Det er værd at bemærke, at cancercellelinier generelt havde lavere niveauer af methylering end HNSCC prøver, hvilket måske afspejler en længere tid til at akkumulere tab methylering eller den klonale natur af disse cellelinier. Men nogle cellelinjer (for eksempel RKO) havde, ringe eller slet ingen tab af methylering. Dette indebærer, som for de primære HNSCC tumorer, at der er variation i den underliggende biologi. Yderligere forskning i, hvad der forårsager denne variation kunne give vigtige oplysninger om veje og den rolle, epigenetiske ændringer i kræft progression.

Vores resultater viser en positiv sammenhæng mellem opretholdelse af normal LINE methylering og HPV-positivitet. Desuden blev opretholdelse af normal LINE methylering også korreleret med mindre LOH eller genom ustabilitet. Hvis LOH ses som et surrogat for kromosom ustabilitet (CIN), dette resultat er i overensstemmelse med den tidligere rapporterede resultat, at tyktarmskræft også har en associering mellem CIN og tab af LINE hypermethylering [14], [15]. Således er det fristende at spekulere, at LINE methylering og CIN er kausalt relateret, måske via methylering er kendt association med mere tæt kromatin emballage, som kan oversætte til mere troskab under kromosom adskillelse og derfor mindre LOH. Men vores resultater og tidligere rapporterede resultater er rent korrelative; funktionelle undersøgelser vil være nødvendige, før denne årsagssammenhæng kan etableres.

Den nye fund i vores resultater er, at HPV-positivitet er korreleret med vedligeholdelse af LINE methylering. En nylig epidemiologisk undersøgelse identificerer risikofaktorer for LINE-1 hypometylering rapporterede ingen signifikant sammenhæng mellem HPV-DNA-status og LINE-1 methylering niveauer [17]. Men der var metodologiske forskelle mellem dette og vores undersøgelse, herunder anvendelse af både HPV E6 DNA og RNA status i tildelingen af ​​HPV-status, anvendelse af en anden methylering assay, og brugen af ​​methylering niveau som en kontinuert variabel i analyse. Selvom Furniss og kolleger ikke viste en direkte sammenhæng, viste de, at resultaterne varierede med LINE-1 methylering niveauer for HPV-negative tumorer [23]. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at klarlægge sammenhængen mellem HPV status og LINE methylering. En mulig hypotese er, at i et forsøg på at lukke munden på HPV-virus, inficerede celler fremkalde en mere sprudlende methylering respons, harkening tilbage til oprindelsen af ​​methylering som en viral forsvarsmekanisme. Selv om dette igen vil kræve mekanistiske undersøgelser eller måske studier i andre typer af viralt medierede kræftformer (f.eks hepatitis B og C medieret HCC sammenlignet med ikke-viralt induceret HCC eller EBV + lymfom vs. EBV lymfekræft) at etablere kausalitet, vores resultater sammen med de Furniss og kolleger [17] helt sikkert give mere støtte til den hypotese, at HPV-positive HNSCC og HPV-negative HNSCC repræsenterer forskellige biologiske enheder, der opstår via separate onkogene veje.

sammenfattende vi udviklet flere nye LINE (LINE-1) og SINE (

Alu

) hel-genom methylering assays, som vi anvendte til at bestemme status methylering af en bred vifte af kræft cellelinjer og HNSCC primær tumor prøver. Vi finder, at kræft cellelinjer generelt er faldet methylering niveauer af repetitive elementer. Endnu mere variation i LINE-1 methylering blev bemærket inden HNSCC prøver. Vigtigere er det, opdagede vi en sammenhæng mellem HPV-negativitet, øget genom ustabilitet og tab af genom methylering. Denne sammenhæng styrker konceptet, at HPV-positive og HPV-negative kræftformer er biologisk forskellige og giver et grundlag for fremtidige undersøgelser for yderligere at definere den biologiske mekanisme bag disse fund.

Materialer og metoder

Patient prøver og cellelinjer

Matchet tumor /normal tilstødende vævsprøver, og når tilgængelige cervikale lymfeknudemetastaser fra HNSCC patienter blev indsamlet ved Ohio State University, som beskrevet tidligere (tabel S1) [24]. Genomisk DNA blev ekstraheret fra DNA-protein fase af TriZol-ekstraherede væv ifølge producentens forslag (Invitrogen). DNA blev ekstraheret ved hjælp af Puregene kit (Gentra) på cellepellets fra fire HNSCC cellelinier (SCC-4, SCC-9, SCC-15 og SCC-25), fem lunge kræft cellelinier (H1395, H520, H2170, SK MES-1 og SW-900), en brystcancer-cellelinie (MCF7), en cervikal cancer cellelinje (HeLa), tre brain cancercellelinier (U251, SK-N-AS og M059K), en livmoderkræft cellelinje ( AN3CA), et sarkom cellelinje (HT1080), en nyre cancer cellelinje (HEK293), og seks kolon cancercellelinier (LoVo, SW48, HCT-15, DLD-1, COLO 320DM og RKO) ifølge producentens forslag. Desuden blev DNA fra lymfoblastoidcellelinie BL1395 anvendt som en tilsvarende kontrolgruppe til H1395. Alle cellelinjer er tilgængelige fra ATCC (Manassas, VA).

Normale pools og denatureret kontroller

Fire puljer af normale prøver blev genereret repræsenterer forskellige køn og aldre. DNA-prøver blev indhentet fra anonyme bloddonorer og var en gave fra Dr. Michael J. Siciliano (University of Texas M. D. Anderson Cancer Center). Tre af pools (kvinder ældre end 40 år, kvinder 40 år eller under, og hanner 40 år eller under) var hver består af fem personer pr pool. De fjerde pool (hanner ældre end 40 år) bestod af seks personer. Kommercielt fremstillet universelt methyleret og universelt umethyleret DNA (UM.C og U2M.C henholdsvis) blev opnået fra Chemicon. UM.L (universelt methylerede DNA) blev genereret som en positiv kontrol ved at behandle normale perifere blod leukocyt (PBL) DNA med CpG methylase

M.Sss

jeg (New England Biolabs) [25]. U2M.L (universelt umethyleret DNA) blev dannet som en negativ kontrol ved amplifikation af samme DNA anvendes til at generere den positive kontrol-DNA under anvendelse af GenomiPhi kit (GE Healthcare) som beskrevet af producenten.

Primere og PCR-betingelser

PCR-primere og sekventeringsprimere blev konstrueret med anvendelse PSQ Assay design software (Biotage) [26]. Tre assays for SINE (

Alu

) elementer og tre analyser for LINE-1 elementer var designet (tabel 1). PCR blev udført i en 25 pi reaktion indeholdende Qiagen HotStart Taq Master Mix (Qiagen) under anvendelse af 1 pi bisulfit behandlede DNA (10 ng DNA-ækvivalenter). For at reducere omkostningerne pr assayet blev amplifikationen protokol udviklet under anvendelse af en biotinyleret universel primer tilgang. Endelige primerkoncentrationer var 10 nM af primeren tailed med den universelle primer, 100 nM af untailed primer og 90 nM af det almene biotinyleret primer i hver reaktion [19]. Amplifikationen blev udført ved følgende betingelser: denaturering ved 95 ° C i 5 minutter, efterfulgt af 45 cykler ved 95 ° C i 30 sek, 45 ° C (Sines) eller 53 ° C (linjer) i 1 min, 72 ° C i 45 sek, og en endelig forlængelse ved 72 ° C i 7 min [19].

PyroMethA (PMA) og methylering vurdering

bisulfit omdannelse af genomisk DNA blev udført som tidligere rapporteret [ ,,,0],19]. Kort beskrevet 0,5-1,0 ug genomisk DNA blev behandlet ved anvendelse af CpGenome DNA modifikation kit (Chemicon), herunder DNA sulfonering, deaminering, udblødning, desulfonering og genopretning. Bisulfit behandlede DNA blev opbevaret ved -20 ° C indtil anvendelse. PMA er et Pyrosequencing-baseret teknologi, der kan analysere CpG methylering på flere steder i en enkelt analyse. Efter en PCR-amplifikation under anvendelse af bisulfit behandlede DNA blev Pyrosequencing udført under anvendelse af PSQ96HS systemet (Biotage) ifølge producentens protokol herunder enkeltstreng-bindende protein (PyroGold reagenser). Resultaterne blev analyseret ved anvendelse af Q-CpG-software (Biotage), der beregner den procentvise methylering (

mC /(

mC + C)) for hver CpG-sted, tillader kvantitative sammenligninger. Den methylering indeks (kaldet MI) blev beregnet som den gennemsnitlige værdi af

mC /(

mC + C) for alle undersøgte CpG steder i analysen. Generelt var der meget god overensstemmelse i methylering niveauer blandt individuelle bindingssteder for CpG i det samme assay. Behandlet med bisulfit UM.L blev anvendt som universelt methylerede reference. PMA data for disse globale methylering assays er rapporteret som en procentdel af methyleret reference (PMR) værdi, normalisere MI af hver prøve til MI af universelt methylerede reference (UM.L) DNA [25].

Kommerciel universelt methylerede DNA (UM.C) og universelt umethyleret DNA (U2M.C) (Chemicon) blev også anvendt til at udføre denne analyse, og resultatet var lineær (

r

= 0,983,

p

-værdi 0,0005 for LINE-1, figur S1). Men kommercielt tilgængelig U2M var ikke helt methyleret, da en ren U2M.C prøve havde tilbageværende methylering af ca. 26%, forskellig fra U2M.L fremstillet i vores laboratorium, som havde den forventede 0% methylering. Vi brugte derfor vores egen universelt umethyleret DNA (U2M.L) for alle yderligere undersøgelser.

Påvisning af HPV 16 E6 DNA og E6-RNA til at bestemme HPV-status

Kvantitativ real-time PCR blev udført for at detektere enten HPV16 E6 DNA eller E6 cDNA under anvendelse af samme primer /probe sæt til begge. De primere blev designet ved hjælp af HPV 16 serotype, som tegner sig for ≥90% af alle HPV-positive HNSCC sager [27]. For at kontrollere for mulig genomisk DNA-kontaminering i cDNA blev amplificeringer af cDNA fra DNAse-behandlet RNA, som var blevet fremstillet ved anvendelse af SuperScript First Strand Synthesis System (Invitrogen) både med og uden tilsætning af revers transkriptase sammenlignet. PCR blev udført i en 25 pi reaktion indeholdende iQ Supermix mastermix (Biorad) under anvendelse af 25 ng af genomisk DNA eller 5 pi af cDNA. Forward primer (5′-CTGCAATGTTTCAGGACCCA-3 ‘) og reverse primer (5′-TCATGTATAGTTGTTTGCAGCTCTGT-3′) blev tilsat til en slutkoncentration på 200 nM hver. Texas Red mærkede realtid probe (5’-TR-AGGAGCGACCCAGAAAGTTACCACAGTT-3 ‘) blev tilsat til en slutkoncentration på 320 nM. Fluorescein blev tilsat til hver reaktion ved en endelig koncentration på 10 kl. Hver reaktion blev udført tre gange. Amplifikationen blev udført ved følgende betingelser: denaturering ved 95 ° C i 8,5 minutter efterfulgt af 50 cykler ved 95 ° C i 15 sek, 60 ° C i 1 min og analyseres i realtid ved hjælp af en iCycler PCR-maskine og software ( Biorad). Prøver, der ikke forstærker blev bedømt som negative, og alle prøver blev grupperet i 3 kategorier baseret på disse resultater: (+ /+), positive for både E6 DNA og E6 RNA; (+/-), Positive for E6-DNA, men er transkriptionelt tavst; og (- /-), negative for E6 DNA og RNA. HPV-status lykkedes bestemt for 24 af de 26 HNSCC prøver, og disse blev anvendt til efterfølgende analyser udnytter HPV-status.

10K SNPChip LOH analyse

HNSCC genomiske DNA blev ekstraheret under anvendelse af standard TriZol- udvinding protokollen; de blev yderligere oprenset ved ethanolpræcipitation før og efter hele genomet amplifikation under anvendelse af GenomiPhi kit (GE Healthcare). Den Affymetrix 10K

Xba

131 matrix indeholder ca. 11.500 SNPs med en gennemsnitlig afstand på 210 kb. Standard Affymetrix protokoller blev fulgt i disse assays. Kort fortalt blev ca. 250 ng genomisk DNA fordøjet med

Xba

I og derefter ligeret til adaptorer. Dernæst blev en primer forstærkning udøves ved hjælp af GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems). Efter oprensning med Qiagen MinElute 96 UF, i alt ca. 20 ug PCR-produkt blev fragmenteret og mærket med biotin. Hybridisering blev udført i Affymetrix GeneChip hybridiseringsovn ved 48 ° C i 16-18 timer. Arrays blev vasket og farvet med Affymetrix GeneChip Fludics Station 400 og blev scannet med Affymetrix GeneArray 2500 Scanner. Billedbehandling blev udført med GCOS 1.0 software og genotyper blev genereret med GTYPE 2.0 eller højere software.

Statistisk analyse

For at vurdere sammenhængen mellem niveauet af methylering og niveauer af HPV belastning (en lignende analyse blev også anvendt til at vurdere sammenhængen mellem niveauet af methylering og TNM stadie), fortsatte vi som følger. Alle prøve methylering værdier blev konverteret til rækker. En manglende værdi for LINE1-1 analysen, for prøve P2, blev regnet ved hjælp af P2 værdien fra LINE1-3 (sammenhæng mellem LINE1-1 og LINE1-3 analyser er 0,98). Disse rækker blev derpå skaleret (vægtet) ved HPV belastning, med vægte på 0, 1 og 2 til – /-, +/-, og + /+ hhv. Det endelige forening “score” var summen af ​​disse vægtede rækker. Den null fordeling for denne score blev vurderet ved simuleringer, hvor vi gentagne gange tildelt prøver til HPV grupper tilfældigt. Vi løb en million simuleringer, og defineret vores

s

-værdien som to gange andelen af ​​sager, hvor simuleringen score var så stor eller større end den, vi faktisk så. Vores simuleret

s

-værdi var 0,011.

Støtte oplysninger

tabel S1. Salg Kliniske og molekylære funktioner i HNSCC prøver

doi:. 10,1371 /journal.pone.0004941.s001

(0,12 MB DOC)

Figur S1.

dynamikområde på PMA LINE-1 og Alu Analyser. Mixing eksperimenter blev udført for at bestemme PMA methylering niveauer målt med varierende forhold mellem universelt methyleret og umethyleret DNA. UM.C og U2M.C repræsenterer kommercielt tilgængelige (Chemicon) universelt methylerede og umethylerede DNA hhv. UM.L og U2M.L blev genereret fra den samme DNA ved in vitro modifikation i vores laboratorium

doi:. 10,1371 /journal.pone.0004941.s002

(0,10 MB TIF)

Figur S2.

Korrelation analyse af sinus og LINE global methylering assays.