PLoS ONE: Naturlig Produkt Celastrol destabiliserer tubulin heterodimer og Letter Mitotisk Cell Død udløst af mikrotubuli-Målretning Anti-Cancer Drugs

Abstrakt

Baggrund

mikrotubuli lægemidler er effektive anticancer-midler, primært på grund af deres evne til at inducere mitosestandsning og efterfølgende celledød. Men nogle cancerceller er uløseligt resistente eller erhverve en modstand. Mangel på apoptose efter mitosestandsning menes at bidrage til resistens, som begrænser effektiviteten af ​​mikrotubulus-målretning anticancerlægemidler. Genetiske eller farmakologiske midler, der selektivt letter apoptose af mitotiske anholdt celler til stede muligheder for at styrke den terapeutiske virkning.

Metode og vigtigste resultater

Vi rapporterer et naturprodukt Celastrol henvender tubulin og fremmer mitotisk celledød forårsaget af mikrotubuli lægemidler. Først i et lille molekyle screening indsats, vi identificerer Celastrol som en inhibitor af neutrofil kemotaxi. Efterfølgende time-lapse imaging analyser afslører, at hæmning af mikrotubuli-medieret cellulære processer, herunder celle migration og mitotisk kromosom tilpasning, er de tidligste begivenheder ramt af Celastrol. Desorganisering, ikke depolymerisering, af mitotiske spindler fremkommer ansvarlig for mitotiske defekter. Celastrol direkte påvirker de biokemiske egenskaber af tubulin heterodimer

in vitro

og reducerer dets proteinniveau

in vivo

. På det cellulære niveau, Celastrol inducerer en synergistisk apoptose, når det kombineres med konventionelle mikrotubulus målretning narkotika og manifesterer en effekt i retning af Taxol-resistente kræftceller. Endelig ved time-lapse billeddannelse og sporing af mikrotubuli lægemiddelbehandlede celler, viser vi, at Celastrol fortrinsvis inducerer apoptose af mitotiske standsede celler i et caspase-afhængig måde. Denne selektive effekt er ikke grund af hæmning af generelle celleoverlevelsesforløb eller mitotiske kinaser, der har vist sig at forbedre mikrotubuli lægemiddel-induceret celledød.

Konklusioner og Betydning

Vi leverer bevis for nye cellulære veje at når urolig, selektivt inducerer apoptose af mitotiske anholdt cancerceller, identificere en potentiel ny strategi for at forbedre den terapeutiske virkning af konventionelle mikrotubuli-targeting kræftlægemidler

Henvisning:. Jo H, Loison F, Hattori H, Silberstein LE, Yu H, Luo HR (2010) Natural Product Celastrol destabiliserer tubulin heterodimer og Letter Mitotisk Cell Død udløst af mikrotubuli-Targeting kræftlægemidler. PLoS ONE 5 (4): e10318. doi: 10,1371 /journal.pone.0010318

Redaktør: Nils Cordes, Dresden Teknologiske Universitet, Tyskland

Modtaget: November 17, 2009; Accepteret: 4 mar 2010; Udgivet 23. april, 2010

Copyright: © 2010 Jo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. H. Jo er støttet af National Institutes of Health (NIH) Uddannelse Grant HL066987. H. Luo er støttet af NIH tilskud HL085100, AI076471, HL092020 og GM076084 og en Research Scholar Grant fra American Cancer Society. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mikrotubuli (MTS), trådformede polymerer af alfa- og beta-tubulin heterodimer, er væsentlige cytoskeleton strukturer, der styrer grundlæggende cellulære processer, såsom celledeling, migration, intracellulær transport og signaler (for gennemgang [1]) . MT’er er dynamisk karakter og konstant undergår faser af svind og genvækst, en proces kendt som ‘dynamisk ustabilitet «. Denne dynamiske egenskab ligger til grund for langt størstedelen af ​​MT-baserede cellulære processer [1]. De overordnede dynamik MT’er varierer i forskellige celletyper og cellulære sammenhænge og er reguleret på flere niveauer, herunder post-translationelle modifikationer af selve tubulin og interaktioner med en bred vifte af MT bindende proteiner [2], [3], [4] , [5], [6].

Under fysiologiske betingelser, den mest dramatiske reorganisering af MT’er forekommer ved starten af ​​mitose, når interfasen MT’er er depolymeriseret og repolymerized til dannelse mitotiske spindler. Den spatio-temporale montage og dynamiske opførsel af mitosespindler er kritisk vigtige for korrekt justering og adskillelse af duplikerede kromosomer, svigt fører til celledød eller genomisk instabilitet (til gennemsyn [7]). De mitotiske spindler er særlig følsomme over for forskellige naturlige og syntetiske MT narkotika, der forringer deres samling og funktioner, hvilket fører til mitosestandsning og efterfølgende celledød. På grund af denne aktivitet, er MT narkotika mest almindeligt anvendt til behandling humane cancere. Men nogle kræftceller er uløseligt resistente og narkotika-eksponerede cancerceller ofte erhverve en modstand.

Discovery og udnyttelse af strukturelt forskellige nye typer af antimikrotubulus midler kan overvinde sådanne problemer. For eksempel har den kliniske anvendelighed af strukturelt forskellige MT stabilisatorer at overvinde Taxol-resistens er rapporteret [8], [9], [10]. De komplementære metoder kan omfatte et kombineret hæmning med andre cellulære faktorer, såsom mitotiske kinaser og motoriske proteiner [11]. Ikke desto mindre, på grund af de væsentlige funktioner i MTS i forskellige cellulære processer, nogle grader af cytotoksicitet til normale celler synes uundgåelig.

Det er blevet rapporteret, at den relative modstand af forskellige humane cancer cellelinjer til almindelige antimitotiske midler er korreleret med manglende celledød snarere end mitosestandsning [12]. Dette fund er i overensstemmelse med både kliniske observationer og dyr modelforsøg, der identificerede graden af ​​celledød efter Taxol behandling bestemmes det samlede resultat af dets effektivitet [13], [14]. Derfor genetiske eller farmakologiske midler, der selektivt letter apoptose af mitotiske anholdt celler (dvs. prolifererende kræftceller) nuværende muligheder for at styrke effekten af ​​MT narkotika, med ringe indflydelse på lægemiddel-eksponerede interfase celler (dvs. ikke-dividere normale celler).

i løbet af små molekyler screening indsats (ikke offentliggjort resultat), identificerede vi et naturligt produkt Celastrol, traditionelt kendt for sine anti-inflammatoriske og anti-cancer aktiviteterne, som en inhibitor af neutrofil kemotaxi. Ved at anvende en række forsøg, der omfatter time-lapse billeddannelse af celle migration og kromosom tilpasning samt biokemiske og cellebiologiske metoder, afslørede vi, at hæmning af MT funktioner var en af ​​de tidligste cellulære begivenheder, der berøres af den nye tubulin-targeting aktivitet af Celastrol. Vi påviste yderligere, at denne enestående aktivitet kunne udnyttes til at inducere apoptose af Taxol-resistente cancerceller, og til selektivt at lette den mitotiske celledød af MT lægemiddelrelaterede standset cancerceller. Disse resultater giver en molekylær forklaring på den anti-inflammatoriske og anti-cancer aktivitet Celastrol, og udgøre en potentiel strategi til at forbedre mitotiske celledød induceret af konventionelle mikrotubuli-targeting anti-cancer medicin.

Materialer og metoder

Cellekultur og generering af Taxol-resistent cellelinje

Både HEK293 og HeLa cellelinier blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC), og blev opretholdt i DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin og streptomycin under 5% CO

2.

for at generere en Taxol-resistent cellelinje, HeLa-celler stabilt udtrykker EGFP fusioneret til Histon 2B blev genereret. Disse celler blev derefter udpladet i 60 mm-dyrkningsskål (1 × 10

6) i nærvær af 0,5 nM af Taxol. Efter 72 timer blev de levende celler opsamlet og re-udpladet i nærvær af den samme koncentration af lægemiddel. Denne procedure blev gentaget mindst tre gange for en given lægemiddelkoncentration. Koncentrationen af ​​Taxol blev gradvist forøget til en endelig koncentration på 5 nM. De resistente celler er udpeget som H2B-TXR blev opretholdt og opformeret i nærvær af 5 nM Taxol.

Reagenser og antistoffer

Celastrol blev købt fra EMD Biosciences og alle andre kemikalier medmindre andet er angivet var fra Sigma Aldrich og Tocris Bioscience. Muse monoklonale antistoffer til gamma-tubulin (T3320), alpha-tubulin (T6199), og beta-tubulin (T4026) var fra Sigma Aldrich; Kanin polyklonale antistoffer til alfa tubulin (ab18251) og beta-tubulin (ab6046) var fra Abcam. De HRP-konjugerede anti-kanin- og anti-mus-sekundære antistoffer var fra Amersham Biosciences; alle andre antistoffer blev indkøbt fra Cell Signaling Technology.

Neutrofil oprensning og EZ-taxiscan kemotaksiassay

Humane blodneutrofiler perifere blev oprenset som tidligere beskrevet [15]. EZ-taxiscan kammer (effektorcelle Institute, Tokyo, Japan) blev samlet med en 260 um bred × 4 um tyk silicium chip ifølge producentens instruktion. Inhibitoren-behandlede neutrofiler (3 × 10

6 /ml) blev blandet i RPMI (0,1% BSA) og påført til det nedre kammer (3000 celler per brønd). En mikroliter af fMLP (100 nM endelig) blev tilsat til det øvre kammer. De migrerende neutrofiler mod det øvre kammer blev afbildet hvert 30. sekund i 20 minutter. Filmen blev analyseret ved hjælp af DJF software (Solltech, Oakdale, IA) for at beregne hastigheden.

Western blot og immnunostaining.

Udarbejdelse af totale cellelysater, Western blot, og andre standard molekylærbiologiske teknikker var stort set de samme som tidligere [16] beskrevne. Til analysen af ​​mitotiske kerner blev celler fikseret i nærvær af 3% PFA (forvarmet) i 5 minutter før DAPI-farvning. For immunfarvning af mikrotubuli blev celler udpladet i en 35 mm-glasbund skålen (Mattek Corp.) og fikseret i 5 minutter i præ-afkølet (-20 ° C) methanol. Efter vask tre gange i PBS-Triton X-100 (0,05%) blev de fikserede celler permeabiliseret i 30 minutter i 5% normalt gedeserum indeholdende 0,3% Triton X-100. Den fortyndede antistof (1:2000 til primær og 1:1000 for sekundært antistof) i den samme opløsning tilsat og inkuberet i 3 timer ved stuetemperatur. Efter vask tre gange i PBS-Triton X-100 blev Alexa Fluor dye-konjugeret sekundært antistof tilsat og inkuberet i 1 time ved stuetemperatur. Den farvning blev visualiseret under fluorescerende mikroskop (Olympus IX71), og billedet blev taget med 100 x objektiv. For at undersøge Manglerne ved positioneringen af ​​to centrosomer med hensyn til underlaget i Celastrol-behandlede mitotiske celler, to billeder med forskellige fokale planer, fokuseret på gamma-tubulin farvning af hver pol, blev taget sammen med alfa-tubulin farvning i spindlerne (Figur S1B).

Biokemiske analyser for tubulins

De eksponentielt voksende HEK293 celler blev opsamlet og vasket en gang i PBS. Cellepelleten blev frosset på tøris i 15 minutter og lyseret i assaybuffer indeholdende 0,3% CHAPS, 200 uM GTP og proteaseinhibitorcocktail (Sigma Alderich) i PBS. Lysatet blev holdt på tøris i 15 minutter og optøet ved stuetemperatur. Efter optøning blev cellelysatet straks centrifugeret ved 14.000 rpm i 5 minutter ved 4 grader. Kun den frisk fremstillede cellelysat (2-4 ug /ml) blev anvendt i

in vitro

oligomeriseringsassay, typisk i et 50 pi reaktionsvolumen. Efter præinkubation i nærvær af lægemiddel i 10 minutter på is blev lysatet inkuberet ved 37 ° C i 15 til 60 minutter. Reaktionen blev stoppet ved tilsætning af et tilsvarende volumen af ​​2 X LDS puffer og kogt i 5 minutter før SDS-PAGE. Ved forsøg med det oprensede tubulin ( 99% fra Cytoskeleton, Inc) blev tubulin opløsningen fortyndet til en koncentration på 10 ug /ml i assaybuffer, og reaktionen blev udført i det væsentlige den samme som cellelysatet. For immunopræcipitation blev HEK293-celler lyseret i den samme buffer som ovenfor (typisk 1 ml pr 60 mm-dyrkningsskål). Lysatet blev klaret ved centrifugering og inkuberet på is i 10 minutter i nærværelse af forskellige lægemidler. Det polyklonale alfa tubulin-antistof (ab18251, Abcam) blev tilsat (5 pg antistof pr 1 mg protein per prøve) og inkuberet i 1 time i det kolde rum før tilsætning af protein G /A-agarose-opslæmning (30 pi per prøve) . Efter inkubation i yderligere 2 time blev immunecomplex vasket tre gange i iskold assaypuffer ved 4 ° C før SDS-PAGE.

caspaseaktivitet, cellelevedygtighed, og proteasomaktivitet assay

den kolorimetriske caspaseaktivitet assay blev udført under anvendelse af rå celleekstrakt i nærvær af caspase substrat, Ac-DEVD-pNA (Biomol International). De lægemiddelbehandlede celler blev opsamlet og vasket en gang i PBS. Celler blev lyseret på is i 10 minutter i en puffer indeholdende 0,1% CHAPS, 50 mM HEPES (pH 8,0), 12,5 mM NaCl, 0,1 mM EDTA og 5 mM DTT frisk tilsat. Lysatet blev centrifugeret i 5 minutter ved 14, 000 rpm ved 4 grader. Det klarede lysat (ca. 200-400 ug protein) blev blandet med Ac-DEVD-pNA (200 pM final) i 100 pi reaktionsvolumen i en 96-brønds assayplade. Pladen blev inkuberet ved 37 ° C, og enzymaktiviteten blev målt ved aflæsning af absorbansen ved 405 nm for hver 1 time med pladelæseren (TriStar LB 941, Berthold Technologies). Cellelevedygtigheden blev bestemt ved MTT-assay som tidligere [16] beskrevne. Til måling proteasomaktivitet, HEK293-celler (1 x 10

6) blev behandlet med hver kemikalier (5 uM) i 1 time, og lyseret på is i 15 minutter i 200 pi lysisbuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 150 mM NaCI; 1 mM EDTA; 1 mM EGTA; 1 mM p-glycerophosphat, 1% Triton- X100). Efter at rydde cellerester ved centrifugering ved 4 grader, blev ekstraktet udsat for proteasomalaktivitet under anvendelse af Proteasome-Glo ™ chymotrypsinlignende Assay (Promega).

Time-lapse levende celler

for cellemigrationsassay blev HeLa-celler, der udtrykker histon H2B EGFP (HeLa-H2B) udpladet i en 35-mm dyrkningsskål (4 × 10

5) og dyrket i 48 timer. Bunden blev foretaget med spidsen i midten af ​​skålen og vasket en gang i forvarmet Leibovitzs L15 medium suppleret med 0,5% FBS. Efter 10 minutters healing i samme medie, blev stoffet tilsættes, og time-lapse film blev taget hvert 15. minut i 150 minutter ved hjælp af IPLab software. Migrationen blev bestemt ved at subtrahere på arealet celler på tidspunktet 150 minutter med den for tiden 0 minut for hvert lægemiddel. Den relative migration område blev beregnet ved normalisering mod kontrol (DMSO-behandlet) gruppe. For mitotisk kromosom alignment, blev HeLa-H2B celler udpladet i en 35 mm-glasbund skål ved 20% konfluens og dyrket i 48 timer. Mediet blev erstattet med Leibovitzs L15 medium suppleret med 0,5% FBS. Umiddelbart efter tilsætning af hvert lægemiddel blev profasen celler identificeret under fluorescerende mikroskop og time-lapse film blev taget hvert 5. minut i 90 minutter. For apoptotisk død af mitotiske standsede celler, HeLa-H2B celler vokser eksponentielt (eller ca. 70% konfluens) i 35 mm-skål blev erstattet med 2 ml Leibovitzs L15 (0,5% FBS) medium indeholdende 10 nM vinblastin og dyrket i 4 timer. Efter tilsætning af hvert lægemiddel blev time-lapse film taget hvert 15. minut i 4 timer. Den apoptotiske død af kun de »pre-arresteret ‘mitotiske celler, som er identificeret ved runde morfologi til tiden 0 blev scoret og betegnet som” mitotisk død (se figur S4). Den ikke-mitotisk celledød blev defineret som de adhærente og flade celler (lægemiddel-eksponerede interfase celler) døde i de næste to rammer (inden for 30 minutter). Den apoptotiske død af ‘nyligt arresterede’ mitotiske celler under tidsforskudt billeddannelse blev ikke talt. For at bestemme virkningerne af Celastol på mitotiske celler, vi synkroniseret og beriget mitotiske HeLa-H2B celler ved ‘double-thymidin blok “[17]. Kort fortalt blev cellerne dyrket til 20-30% konfluens og dyrket i 19 timer i nærvær af thymidin (2 mM) og inkuberet i 10 timer uden thymidin. Den anden blok blev udført ved dyrkning i 17 timer med thymidin (2 mM). Celler blev vasket og inkuberet i 5 timer uden thymidin, og mediet blev erstattet med Leibovitzs L15 (0,5% FBS) medium. Celler blev dyrket i yderligere 4 timer, før du tilføjer Celastrol, og skæbnen for mitotiske celler blev spores af time-lapse film.

Resultater

Celastrol hæmmer cellemigration

Celastrol er en af ​​de aktive forbindelser afledt af planteekstrakter traditionelt anvendes til behandling af inflammatoriske symptomer [18]. Rekruttering af immunceller til stedet for inflammation går forud for en kaskade af cellulære begivenheder, der fører til inflammatoriske reaktioner, og hæmning af denne rekruttering kan dæmpe de inflammatoriske processer. Under et lille molekyle screening, blev Celastrol identificeret som en inhibitor af fMLP-inducerede neutrofil kemotaksi (upubliceret resultat). Celastrol er blevet vist at inhibere proteasomalaktivitet og modulerer varmechokprotein (HSP) 90 pathway [19], [20], [21]. Derfor har vi undersøgt virkningerne af kendte hæmmere af disse veje, 17AAG for HSP90 og MG132 for proteasom, under samme eksperimentelle indstilling. Sammenlignet med kontrolcellerne udviste Celastrol-behandlede neutrofiler en nedsættelse af migrerende hastighed mod en gradient kilde til fMLP (Film S1 og S2) ca. 50%. Imidlertid blev ingen påviselig effekt observeret i nærvær af andre kemikalier. Desuden Gedunin, som har vist sig at inhibere HSP90 pathway ligner Celastrol [20], viste heller ingen inhiberende virkning (figur 1A og B). Desuden, når testet i helcellelysat assay viste Celastrol en meget lidt inhibitorisk aktivitet over proteasom (figur 1B). Således er virkningen af ​​Celastrol på neutrofil kemotaxi ikke er forårsaget af inhibering af proteasomalaktivitet.

(A-B) Celastrol inhiberer fMLP-inducerede neutrofil kemotaksi. (A) Frisk isolerede humane blodneutrofiler perifere blev forbehandlet med hvert kemikalie i 30 minutter, og derefter underkastet fMLP-medieret kemotaksi i 20 minutter ved hjælp af EZtaxiscan. Den første og den sidste billeder af videoerne blev vist for hvert lægemiddel. fMLP (100 nM), Celastrol (2 uM), 17AAG (4 uM), MG132 (10 uM), og Gedunin (20 uM) blev anvendt i den angivne kombination. (B) Venstre panel er kvantificeringen af ​​vandrende hastighed på hvert lægemiddel behandling. Højre panel er det helcellelysat assay af proteasomalaktivitet behandlet med hvert lægemiddel i 1 time. Koncentrationen af ​​alle kemikalier var 5 uM. (C-D) Celastrol reducerer epitelcancer cellemotilitet. (C) Den konfluente HeLa-celler blev ridset ved hjælp af en spids. Efter 10 minutters nyttiggørelse, blev hvert lægemiddel tilsættes, og time-lapse billeder blev taget hver 15 minutter i 150 minutter. De repræsentative stillbilleder af det første (tid 0) og de sidste (tid 150) tidspunkter blev vist. For prøven af ​​”Celastrol-vask”, celler forbehandlet med Celastrol i 3 time før skrabe; og time-lapse film blev taget i et stoffrit medium. (D) Kvantificering af cellemigration. Den relative migration området over kontrol (DMSO-behandlet) blev præsenteret. * Angiver p. 0,05 af Student t-test

Næste, vi undersøgt, om dette fund kunne udvides til andre celletyper. En nylig undersøgelse viste, at Celastrol inhiberede TNF-alfa-induceret tumorcelleinvasion gennem hæmning af genekspression kontrolleres af NF-κ B pathway [22]. På grund af en længere varighed af lægemiddeleksponering i denne undersøgelse, også Celastrol direkte berørt, kunne ikke bestemmes motiliteten af ​​epitelceller. Derfor undersøgte vi den direkte virkning af Celastrol på tumorcellemigration anvendelse af en sårhelende assay. De sammenflydende Hela celler blev ridset, og time-lapse billeder af migrering til de sårede område blev taget. I overensstemmelse med dens virkninger på neutrofil kemotaksi, Celastrol effektivt inhiberede cellemigrering i gennemsnit 60% nedsættelse over tidsforløbet på 150 minutter (Movie S3 og S4). For at udelukke den mulighed, at dette hæmmende virkning skyldtes den generelle celletoksicitet, vi pre-behandlede celler med Celastrol i 3 timer. Efter fjernelse af narkotika, blev migrationen kapacitet celler fuldt restaureret, hvilket indikerer denne hæmmende effekt var reversibel og blev ikke forårsaget af generel toksicitet (figur 1C og D). Tilsvarende med hvad der blev observeret i neutrofiler, inhibering af enten proteasom eller HSP90 pathway havde ingen inhibitorisk virkning under denne eksperimentelle betingelser (figur 1C og D). Disse resultater indikerer tilstedeværelsen af ​​cellulære mål (e) af Celastrol, ufølsom overfor hæmning af proteasomet eller HSP90 vej.

Celastrol svækker mitotisk progression ved at hæmme kromosom tilpasning

Den dynamiske og koordineret regulering af cytoskelet netværk, såsom actinfilamenter og mikrotubuli, er afgørende for at migrere celler. De hæmmende effekt på celle migration i både neutrofile kemotaksi og epitelial sårheling foreslå en mulighed for, at Celastrol kan interferere med cytoskelettet netværket. Under mitose, MT dynamik spiller afgørende roller i tilpasning og adskillelse af kromosomer. Derfor har vi undersøgt for abnormiteter i andelen af ​​mitotiske faser på Celastrol behandling. Mens DMSO-behandlede HeLa celler viste en lignende andel af prometafasen, metafase, og anafase /telofase kromosomer, over 70 procent af kromosomer i Celastrol-behandlede celler viste den “prometafasen-lignende” fænotyper (figur 2A). For yderligere at bekræfte dette resultat, vi udførte en prometafasen-anholdelse og frigivelse eksperiment (figur 2B). Vi først standsede celler ved prometafasen ved Nocodazole behandling, og de standsede celler blev opsamlet ved at trykke på pladen. Efter fjernelse af Nocodazole er de mitotiske spindler gensamlet, som tilslutter kromosomer til metafase planet for de efterfølgende mitotiske progressioner at forekomme. Denne udgivelse eksperiment blev udført i nærvær af forskellige kemikalier for at vurdere deres virkninger på mitosespindelen funktioner. I kontrolgruppen, har næsten halvdelen af ​​de anholdte celler udviklet sig til anafase løbet 30 minutter-release (inkubation) periode. Men i nærværelse af Celastrol blev størstedelen af ​​celler standset i prometafasen, mens inhibering af HSP90 havde ingen virkning. Proteasomet inhibering med MG132 lidt akkumulerede celler ved metafase (figur 2B). For yderligere at validere disse observationer, udførte vi en levende billeddannelse af mitotiske celler (figur 2C og D). Umiddelbart efter tilsætning af hvert kemikalie, profasen celler, som identificeret ved kondenserede kromatider, blev afbildet som de gennemgår kromosom tilpasning og segregation (Film S5 og S6). I kontrolgruppen, profasen celler skred til anafase inden for 60 minutter. , I overværelse af Celastrol, de undlod imidlertid at komme videre og opholdt sig i en prometafasen-lignende tilstand. I overensstemmelse med resultaterne fra prometafasen anholdelse og frigivelse eksperiment, hæmning af HSP90 havde nogen åbenlyse mangler. Det er bemærkelsesværdigt, at en langsigtet hæmning af HSP90 vil påvirke mitotisk progression ved at ændre de centrosomal funktioner [23], [24], [25]. Men under denne korte periode med hæmning tilstand, blev opdaget nogen åbenlys defekt. Som forventet, hæmning af proteasom forsinkede progression til anafase, eftersom dens aktivitet er påkrævet for kromosom separation (figur 2C og D).

(A) HEK293-celler blev behandlet med Celastrol (2 uM) i 1 time før fiksering og farvning med DAPI. De mitotiske celler blev talt og afsluttet efter deres kromosomale morfologi. Andelen af ​​hver mitotiske fase over den samlede antal optalte celler blev præsenteret. (B) HeLa-celler blev behandlet med Nocodazole (100 nM) i 6 timer. De standsede celler blev opsamlet ved at trykke på pladen, vasket i PBS, og genudpladet i en serumfrit medium. Efter 15 minutters vedhæftning (tid 0), blev hvert lægemiddel tilsættes og inkuberes i 30 minutter før fiksering og farvning med DAPI. Det gennemsnitlige antal celler i hver fase af de firdobbelte blev vist. ‘ND’ er den ikke-mitotiske eller døde celler. (C) Hela-celler over-udtrykkende EGFP-H2B protein blev behandlet med angivne lægemidler. Umiddelbart efter narkotika Desuden blev de profase celler identificeret og time-lapse billeder blev taget hvert 5. minut i 90 minutter. De forstørrede stillbilleder fra de repræsentative film blev vist. (D) Resuméet af time-lapse film til mitotisk kromosom tilpasning i C). Graden af ​​mitotisk progression af profase celler i 60 minutter under tilstedeværelse af hvert kemikalie blev bestemt på grundlag af kromosomal form, og er blevet identificeret af vandrette linje. Tal angiver antal celler undersøgt. De repræsentative kromosomale figurer af kontrol celler ved forskellige mitotiske stadier blev vist i nederste panel som reference.

Celastrol disorganizes mitosespindler

For bedre at forstå virkningerne af Celastrol på celleniveau , undersøgte vi, om strukturen af ​​MT blev påvirket i behandlede celler. Overraskende, ved koncentrationen Celastrol (2-4 uM), der inhiberede cellevandring og kromosom tilpasning, fandt vi en relativt intakt MT struktur i interfaseceller (figur 3A og B). Imidlertid blev en signifikant desorganisering af mitosespindelen ses i mitotiske celler (figur 3 A og B). Under prometafasen, de mitotiske spindler og de tilknyttede motor proteiner hjælpe med at rette kromosomer ved metafase flyet. På dette stadium, bortset fra centrosomal lokalisering, gamma-tubulin er også lokaliseret til spindlerne for at hjælpe deres samling [1]. I epitelceller, er mitosespindelen samlet i parallel med underlaget [26]. I overensstemmelse med denne rapport, i de fleste af kontrol- HeLa-celler (95%, n = 25), to centrosomer som visualiseret ved gamma-tubulin farvning blev observeret i det samme brændplan af 100 x objektiv linse (figur 3A og figur S1A). Men i Celastrol-behandlede celler, spindel lokalisering af gamma-tubulin blev signifikant afskaffet (93%, n = 42/45) og planet for to poler i forhold til substratet blev alvorligt fordrejet, efterlader to centrosomer næppe i samme fokale plan (78%, n = 35/45) eller positionering dem ved siden af ​​hinanden (22%, n = 10/45) (figur 3B og figur S1B). Disse defekter syntes at være forskellige fra dem, der skyldes vinblastin, en MT depolymerizer eller Taxol en MT stabilisator, som primært påvirker polymerisering /depolymerisering af MT (figur 3C og D). Denne observation tyder på, at Celastrol disorganizes de mitotiske spindler hjælp af en anden mekanisme.

Repræsentanten immunfarvning af mikrotubulus (alpha- tubulin) og centrosom (gamma-tubulin) i interfasen og spindel morfologi af mitotiske HeLa-celler behandlet i 1 time med de angivne narkotika; Celastrol (4 uM), vinblastin (10 nM), og Taxol (10 nM).

Celastrol forårsager strukturelle defekter af tubulin

in vitro

og reducerer dens niveau

i vivo

De Celastrol-induceret funktionelle defekter MTS kunne være forårsaget af hæmning af mange cellulære faktorer. Vi testede en mulighed, at tubulin selv kunne være et direkte mål. Bortset fra sin veletablerede polymerisation

in vitro

, som kræver en høj koncentration (over 1-2 mg /ml) og GTP, tubulin heterodimer manifesterer en række andre biokemiske egenskaber, herunder GTP-uafhængig oligomerisering , intra- og inter-molekylære disulfidbinding, ikke-disulfidbindingen krydsbinding, og ikke-enzymatisk spaltning [27], [28], [29], [30], [31]. Vi undersøgte, om Celstrol kunne påvirke nogen af ​​disse biokemiske egenskaber. Som tidligere rapporteret, inkubation af oprenset tubulin ført til oligomerisering (eller højmolekylære komplekser) detekterbar på et ikke-reducerende betingelser (figur 4A). Størstedelen, men ikke alle disse oligomerer forsvandt i en reducerende tilstand (fig S2A). Mængderne af resterende tubulin oligomerer var variabel i hvert eksperiment og kan repræsentere SDS-resistente og ikke-disulfid tværbundne tubulins [31]. Tilsætningen af ​​GTP, som stabiliserer tubulin struktur, men ikke ATP, øget niveau af oligomerer i begge HEK293 cellelysater og oprensede tubulins, indikerer dette oligomerisering kan kræve en vis grad af strukturel stabilitet (fig S2B). Anvendelse af dette assay med HEK293 cellelysat, fandt vi, at Celastrol inhiberede dannelsen af ​​tubulin oligomerer, hvorimod 18 beta-glycyrrhetic acid (18-βGCA), en triterpen strukturelt ligner Celastrol, viste en meget svagere inhiberende virkning (figur 4A). En tilsvarende inhibitoriske virkning blev også observeret, når oprenset tubulin blev anvendt (fig S3).

(A) HEK293 cellelysater blev inkuberet i nærværelse af den angivne mængde Celastrol eller 18-beta GCA i 15 minutter før SDS-PAGE i ikke-reducerende betingelse. Membranen blev blottet med alpha-tubulin (øverst) eller beta-tubulin-antistof (nederst). (B) Cellelysaterne fra kontrol HEK293-celler blev fremstillet og fordeles ligeligt i fire forskellige rør, og immunpræcipitation blev udført med et polyklonalt a-tubulin-antistof i nærvær af DMSO eller angivet mængder af Celastrol. Efter SDS-PAGE blev immunkomplekset blottet med det monoklonale museantistof mod alfa-, beta- eller gamma-tubuln. Mængden af ​​alfa-tubulin (øverste panel) tjener som en loading kontrol. (C) Den immunfældning og Western blot blev udført som i B) i nærvær af forskellige kemikalier. (D) HEK293-celler blev behandlet med angivne mængder Celastrol i 1 time, og hele cellelysater blev analyseret for de angivne cellulære proteiner. De samme lysater blev blottet med phospho-CDK-substrat-antistof (højre panel).

Denne inhiberende virkning kan skyldes destabilisering (dvs. udfoldning) af tubulins i nærvær af Celastrol. Hvis dette er tilfældet, så Celastrol kan forstyrre den dimere interaktion mellem alph- og beta-tubulin. Til direkte teste denne mulighed, vi først fremstillet cellelysater fra kontrol HEK293-celler, og a-tubulin blev immunpræcipiteret med et polyklonalt antistof i nærvær af forskellige mængder af Celastrol. Niveauet for beta- og gamma-tubulin i den resulterende immunecomplex blev undersøgt. Interessant nok blev mængden af ​​beta-tubulin faldt i en Celastrol-dosisafhængig måde, medens den af ​​gamma-tubulin forblev stort set upåvirket (figur 4B). Når den testes under de samme forsøgsbetingelser tilstand, viste de andre MT lægemidler sådan virkning (figur 4C), hvilket indikerer, at Celastrol kan påvirke den strukturelle integritet af tubulin heterodimer.

biogenesen af ​​tubulin heterodimer reguleres stramt, og beskadigede tubulins udsættes for nedbrydning eller genanvendelse vej, der involverer tubulin-specifikke cofaktorer [32].