PLoS ONE: CD40-aktiverede B celle kræft Vaccine Forbedrer Anden klinisk remission og overlevelse i privatejede Hunde med Ikke-Hodgkins Lymphoma

Abstrakt

Cell-baserede aktiv immunterapi for kræft er en lovende ny strategi, med første dendritiske celle (DC) vaccine opnå myndighedsgodkendelse til klinisk brug sidste år. Produktion er fortsat vanskelig, især for DC-vacciner, og udsigten til at bruge cellebaserede immunterapi i adjuverende eller i kombination med kemoterapi er stort set uprøvet. Her anvendte vi en komparativ onkologi tilgang til at teste sikkerheden og den potentielle effekt af tumor RNA-påfyldte, CD40-aktiverede B-celler i privatejede hunde præsenterer sig med non-Hodgkins lymfom (NHL), en klinisk scenarie, der repræsenterer ikke kun et stort problem i veterinærmedicin, men også en bona fide spontan dyremodel for den menneskelige tilstand. Ved indgivelse til NHL hunde i remission efter induktion kemoterapi, CD40-B-celler elektroporeres

ex vivo

med autolog tumor RNA sikkert stimuleret immunitet

in vivo

. Selvom kemoterapi plus CD40-B-vaccination ikke forbedrede tid til progression eller lymfom-specifik overlevelse sammenlignet med hunde behandlet med kemoterapi alene, vaccination potenserede virkningen af ​​salvage terapi og forbedret hastigheden af ​​varige anden remissioner samt efterfølgende lymfom-specifikke overlevelse efter salvage terapi. Flere af disse tilbagefald hunde er nu langsigtede overlevende og fri for sygdom i mere end et år. Samlet set har disse kliniske og immunologiske resultater antyder, at celle-baserede CD40 cancer vaccination er sikker og synergistisk med kemoterapi for at forbedre det kliniske resultat hos hunde NHL. Mere generelt, vores resultater understreger den unikke værdi af kliniske undersøgelser i tumor-bærende kæledyr

Henvisning:. Sorenmo KU, Krick E, Coughlin CM, Overley B, Gregor TP, Vonderheide RH, et al. (2011) CD40-aktiverede B celle kræft Vaccine Forbedrer Anden klinisk remission og overlevelse i privatejede Hunde med non-Hodgkins lymfom. PLoS ONE 6 (8): e24167. doi: 10,1371 /journal.pone.0024167

Redaktør: Eric J. Bernhard, National Cancer Institute, USA

Modtaget: April 15, 2011; Accepteret: August 1, 2011; Udgivet: 31 August, 2011

Copyright: © 2011 Sorenmo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Alliancen for Cancer Gene Therapy (RHV), Onyx og Breezy Foundation (KUS), Barry og Savannah Poodle Memorial Fund og Mari Lowe Comparative Oncology center (NJM), den Immunobiology Program for Abramson Cancer center på University of Pennsylvania (NIH tilskud P30 CA016520, RHV), og Oncology Research fond på Veterinary Hospital fra University of Pennsylvania (KUS). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

med den seneste FDA godkendelse af den dendritiske celle vaccine sipuleucel-T til behandling af fremskreden prostatacancer [1], der er blevet fornyet indsats for yderligere at optimere andengenerations cellebaserede behandlingsformer formål at stimulere anti- tumor immunitet til behandling af cancer [2] – [3]. Da anvendelsen af ​​hvile eller ikke-aktiverede antigen præsenterende celler (APC) faktisk kan udløse antigen-specifikke T-celle tolerance og derfor være meget bagslag, hvis det gives til patienter, er det afgørende at udvikle og afprøve APC formuleringer, der er udtrykkeligt designet til at aktivere APC enten

in vivo

eller

ex vivo

. En fremgangsmåde, der er opstået, er farmakologisk tværbinding af CD40 udtrykt på overfladen af ​​APC [4] for at opregulere MHC og co-stimulatoriske molekyler, stimulere sekretion af inflammatoriske cytokiner, såsom IL-12, og opregulere anti-apoptotisk molekyler – en fremgangsmåde kollektivt kendt som “APC licens”, der muliggør priming af naive CD4 + og CD8 + T-celler og boosting robuste hukommelse T-cellereaktioner [5]. Kliniske reagenser, der aktiverer CD40 er blevet udviklet til systemisk anvendelse og har vist klinisk løfte [6] – [8], men disse midler ikke nødvendigvis køre T-celle responser

in vivo

grund restriktive funktioner i tumor mikromiljø [8]. Her studerer vi en

ex vivo

tilgang til APC licens. Selv dendritiske celler i de fleste modeller er cellerne hovedansvarlige for fysiologisk T-celle-priming

in vivo

, B-celler kan også fungere som APC og kan også licenseret af CD40-aktivering [9] – [10]. CD40-aktiverede B-celler (CD40-B), ligesom DC, kan prime naive T-celle responser mod neoantigener

ex vivo

og kan øge hukommelsen T cellereaktioner [9] – [11], hvilket antyder, at antigen-loaded kan CD40-B udgør et levedygtigt alternativ til DC i strategier cellebaserede vaccination. I skarp kontrast til DC, men B-celler kan let udvides

in vitro

hjælp CD40 ligation, fjerne nødvendigheden af ​​stort volumen leukaferese (som er nødvendig for at fremstille sipuleucel-T) for at skaffe tilstrækkeligt antal APC for tilbagevendende vaccinationer [9] – [10], [12]. Selvom CD40-B kan forstærke antigenspecifikke effektor T-celle responser

in vitro

mod virale og tumorassocierede antigener, lidt er kendt om disse alternative APC kan stimulere effektive anti-tumor immunrespons

in vivo

.

for at løse dette spørgsmål, har vi udført et klinisk forsøg med en CD40-B-vaccine i privatejede hunde (kæledyr) med non-Hodgkins lymfom (NHL). Canine NHL udgør en væsentlig sundhedsproblem hos hunde og aktier lignende kliniske, adfærdsmæssige, genetiske og cytogenetiske karakteristika til NHL hos mennesker. Det er nu bredt accepteret som et klinisk relevant modelsystem til at evaluere sikkerhed og effekt af nye terapeutiske midler forud for deres oversættelse til humane kliniske forsøg [13]. Som i humane patienter med NHL, standarden for pleje af den indledende behandling af hunde NHL består af kombinationen kemoterapi protokoller. Selvom induktion kemoterapi er yderst effektiv og 60% -85% af de behandlede hunde opnå fuldstændig klinisk remission efter induktion terapi, næsten alle hunde tilbagefald inden for et år med multiresistent sygdom og dør af lymfom [14] – [15]. Kuren satser for hunde NHL har ikke ændret sig væsentligt i de seneste årtier på trods af brugen af ​​flere dosis-intense protokoller.

I denne undersøgelse har vi klinisk testet en terapeutisk platform, som vi tidligere har beskrevet i prækliniske studier [12 ], hvori B-celler fra NHL hunde ekspanderes

in vitro

hjælp CD40L-transficerede K562-celler (KtCD40L) og derefter fyldt med autolog tumor-RNA for at generere en celle-baseret vaccine. RNA-loaded CD40-B afledt fra hunde perifere blod B-celler stimulerer funktionelle, antigenspecifikke T-cellereaktioner

in vitro

fra sunde hunde og fra hunde med spontan forekommende NHL [12]. Anvendelsen af ​​hele tumor RNA som den antigene nyttelast giver mulighed for en HLA-uafhængig, hel antigen tilgang, der har til formål at fremme en polyklonalt anti-tumor-T-celle respons. Her rapporterer vi det første kliniske forsøg i enhver art af en tumor RNA indlæst CD40-B cancervaccine, der udføres i fastsættelsen af ​​minimal residual sygdom. Vores resultater viser, at CD40-B kan stimulere immunreaktioner

in vivo Hoteller, som indvirkning anden remission og overlevelse i en spontan, stor dyremodel af NHL. Disse resultater tyder på, at tumorantigen indlæst CD40-B kan tjene som et praktisk alternativ til DC i cellebaserede strategier vaccine for både hunde og mennesker med kræft.

Resultater

Privatejet hund protokol

Tredive privatejede hunde med NHL blev indskrevet på sygdom præsentation i denne præklinisk feasibility studie og gennemgik induktion kemoterapi (Gruppe 1; hensigt at behandle). Patient karakteristika er vist i tabel 1. Nitten hunde (63%) blev bekræftet at være i fuldstændig cytologiske og klinisk remission i slutningen af ​​kemoterapi og derfor var berettiget til vaccination med autologe CD40-aktiverede B-celler (hver anden uge i tre intradermale injektioner i flanken), der var blevet fyldt med total RNA tidligere isoleret fra autologe lymfomceller (Metoder og materialer og supplerende metoder) (gruppe 2). Et lige antal autologe CD40-B fyldt med hundesygevirus hæmagglutinin mRNA blev injiceret i den modsatte flanke som immunologisk kontrol. Sixty-fire hunde med NHL blev udvalgt fra en gruppe af 130 hunde som kontrol for uvaccinerede gruppe (gruppe 3). Disse hunde blev udvalgt baseret på det faktum, at de blev behandlet med den samme induktion kemoterapi som den vaccinerede gruppe (gruppe 2) og blev bekræftet at være i fuldstændig klinisk og cytologisk remission ved slutningen af ​​kemoterapien protokol, men de har ikke modtaget CD40 -B-celle vacciner. Der var ingen incitamenter for hunde i enhver gruppe til at modtage kemoterapi og dermed undgå enhver skævhed i behandlingen tilgang eller intensitet af behandlingen. Selvom antallet af hunde i kontrolgruppen (gruppe 3) var større end den vaccinerede hunde (gruppe 2), var der ingen statistisk signifikante forskelle i prognostiske faktorer, herunder immunofænotype mellem gruppe 2 og 3 (tabel 1).

Toksicitet

Vaccination med RNA indlæst CD40-B blev særdeles veltolereret. En hund udviste tegn på en akut systemisk reaktion, herunder svaghed, hypotension og opkastning i løbet af få timer efter modtagelse af den første vaccine. Behandling med intravenøs væske, diphenhydramin og antiemetika resulterede i en begivenhedsløs opsving. Denne særlige hund blev forbehandlet med diphenhydramin lige før de 2 efterfølgende vaccinationer, og ingen yderligere systemiske reaktioner forekom. Milde reaktioner på injektionsstedet, herunder erytem og hævelse forekom i flere hunde. Der var ingen signifikante ændringer i komplette blodkemi under eller efter vaccination i nogen af ​​hundene. Desuden blev ingen langsigtede komplikationer af vaccination såsom autoimmunitet identificeret klinisk, clinicopathologically (overvåget af seriel CBCs) eller ved obduktion.

Kliniske resultater

Median tid til sygdomsprogression (TTP) var 236 dage (konfidensintervaller 95% [CI], 158-314 dage) i gruppe 1 (intent to treat), 366 dage (95% CI, 349-383 dage) i gruppe 2 (vaccinerede hunde), og 327 dage (95 % CI, 223-431) i gruppe 3 (ikke-vaccinerede hunde). Der var ingen statistisk signifikante forskelle i TTP mellem gruppe 1 og 3 (p = 0,16) eller gruppe 2 og 3 (p = 0,34). Kaplan Meier-kurver for TTP er vist i fig. 1A og 2A. Median lymfom specifik overlevelse (LSS) var 489 dage i gruppe 1 (95% CI, 309-669 dage), 809 dage i gruppe 2 (95% CI, 289-1335 dage), og 594 dage i gruppe 3 (95% CI, 536-652 dage). Kaplan Meier-kurver for LSS er vist i fig. 1B og 2B. Selv om der var en forbedring på 36% i det midterste LSS i den vaccinerede gruppe 2 sammenlignet med uvaccinerede kontrolgruppe 3, forskellen var ikke statistisk signifikant (p = 0,18). Ligeledes var der ingen statistisk signifikant forskel i median LLS mellem gruppe 1 og gruppe 3 (p = 0,37). Den samlede overlevelsesrate i gruppe 2 og gruppe 3 hunde på 1 år var 89,5% og 74,1%, henholdsvis og ved årets 2 var 41,4% og 25,4%, hhv. Der var ingen statistisk signifikant forskel i den samlede overlevelse, hvilket indikerer, at vaccination ikke øgede dødelighed.

Femten af ​​19 (79%) vaccinerede hunde i gruppe 2 til sidst tilbagefald, men 4 hunde (21 %) ikke og opnåede en holdbar ( 16 måneder) første remission efter kemoterapi og CD40-B vaccination. En af disse fire hunde døde af ikke-relaterede årsager på 492 dage uden tegn på lymfom bekræftet ved obduktion. De andre 3 hunde er i live uden tegn på lymfom ved 959, 1103, og 1287 dage efter starten af ​​kemoterapi (med klinisk opfølgning igangværende). Ti af de vaccinerede hunde (52,6%) er døde på grund af lymfom; seks forblive i live i slidstærkt første eller anden remission, og tre blev aflivet på grund af andre årsager. To af de tre hunde aflivet havde hemangiosarcoma, uden tegn på lymfom, og den anden hund blev aflivet på grund af “faldende sundhed.” Begrænset oparbejdning var tilladt på denne hund, men obduktion fandt ingen tegn på lymfom. Årsagen til faldende sundhed blev ikke identificeret; der var imidlertid ingen tegn på autoimmunitet og alle cellelinier med fuld modning var til stede i knoglemarven. I alt 7 hunde undergik obduktioner, da de døde eller blev aflivet. Med undtagelse af de 3 tidligere diskuterede hunde blev alle de andre hunde (4 hunde) aflivet på grund af fremskredent stadium lymfom og havde ingen tegn på sene toksiciteter fra vaccinen. Fire af de 64 hunde i kontrolgruppen (gruppe 3), blev tabt for opfølgning efter genopsætning, og resultatet information ikke var tilgængelig. Af de resterende 60 hunde, 46 (76,7%), recidiverende og 14 (23,3%) ikke gjorde. Der var ingen signifikant forskel i tilbagefald sats mellem gruppe 2 og 3 (p = 1,0).

Salvage terapi og dødsårsag

Ti af de 15 vaccinerede hunde (66,7%) i gruppe 2 at tilbagefald blev behandlet med cyclophosphamid, vincristin, og prednison (COP) som salvage terapi og fire af disse hunde (40%) opnåede holdbar anden klinisk remission ( 22 måneder) og ikke tilbagefald. De øvrige 5 vaccinerede hunde, recidiverende modtagne single-agent prednison som salvage-behandling, hvoraf den ene opnåede en holdbar anden remission og ikke tilbagefald. Tre af disse fire vaccinerede hunde med en kemoterapi-induceret holdbare sekunder remission er stadig i live uden tegn på lymfom på 689, 1209 og 1216 dage efter starten af ​​deres oprindelige kemoterapi. De to andre hunde (en behandlet med COP kemoterapi og 1 behandlet med prednison alene) blev aflivet ved 722 og 958 dage henholdsvis; som nævnt ovenfor, den første hund havde hemangiosarcoma og den anden hund var aflivet på grund af “faldende sundhed.” Hverken hund havde tegn på lymfom ved obduktion. De øvrige ti hunde fik tilbagefald under salvage terapi og blev aflivet på grund af deres lymfom

I uvaccinerede gruppe 3, 39 af 46 hunde (84%), der fik tilbagefald blev behandlet med bjærgning kemoterapi og én hund modtog prednison alene.; dog kun 3 (7,7%) af hundene i gruppe 3, der modtog salvage terapi opnået en holdbar anden remission, sammenlignet med 40% af vaccinerede hunde, der opnåede et varigt anden remission at redde terapi, en forskel, der var statistisk signifikant (p = 0,025). Denne forskel resulterede i en statistisk signifikant forbedring i overlevelse efter salvage terapi for tilbagefald Gruppe 2 hunde, der modtager salvage terapi i forhold til tilbagefald Gruppe 3 hunde, der fik salvage terapi (p = 0,038) (fig. 3). Vigtigere var der ingen signifikant forskel i brugen af ​​salvage terapi mellem hunde, der fik tilbagefald i gruppe 2 (66,7%) og gruppe 3 (84%), (p = 0,15).

Immunologisk vurdering

for at bestemme, om tumor RNA-loaded CD40-B-celler induceret funktionelle tumor-specifikke T-celle responser

in vivo

, perifere mononukleære blodceller (PBMC) opnået på tidspunktet for diagnosen og 3 uger efter den sidste vaccination blev analyseret for tilstedeværelse af IFN-γ producerende, tumor-specifikke T-celler ved ELISPOT. IFN-γ-ELISpot-analyse var tilgængelige for 9 hunde i gruppe 2 (fig. 4). En positiv IFN-γ respons på behandlingen blev defineret som 50% stigning i antallet af cytokin-secernerende celler efter vaccination sammenlignet med baseline og med en p-værdi 0,05. blev observeret positive immunreaktioner på CDV HA i 4 af 9 vaccinerede hunde; en positiv IFN-γ immunrespons på autologt tumorantigen blev også observeret i 1 hund og en tendens til signifikans (p 0,1) blev observeret i yderligere 2 hunde. I 2 andre hunde (hund 1 og hund 16) var der 50% stigning i antallet af cytokin-secernerende celler som reaktion på autolog tumor antigen efter vaccination sammenlignet med baseline, men statistisk signifikans kunne ikke tilskrives grund duplikere snarere end tre eksemplarer analyse. Der var ingen korrelation mellem immunologisk reaktion og det gennemsnitlige antal CD40-B-celler administreret til hver hund i løbet af de tre vaccinationer. Fordi kun 9 hunde var i stand til at blive analyseret (på grund af utilstrækkelig tilgængelighed af PBMC på alle tidspunkter), var vi ikke i stand til at påvise en statistisk signifikant korrelation mellem immunologiske respons og klinisk resultat.

PBMC’er blev opnået fra hunde ved diagnosetidspunktet (præ) og 3 uger efter vaccination (post) og antigen-specifikke immunresponser rettet mod (A) CDV-HA og (B) lymfeknude tumorantigener blev bestemt ved IFN-y ELISPOT. * P 0,1, ** p. 0,05

Diskussion

Formålet med denne undersøgelse var at bestemme, om tumor-RNA-transficerede CD40-aktiverede B-celler kunne sikkert fremkalde anti- tumor immunitet og påvirke den naturlige historie af spontan NHL i hunde efter remissionsinduktion med kemoterapi. I et klinisk forsøg af privatejede hunde, RNA-loaded autologe CD40-B-celler administreres intradermalt i fastsættelsen af ​​minimal sygdom fungerede som APC

in vivo

og stimuleret IFN-γ secernerende celler. Selvom vores vaccination tilgang ikke påvirke TTP eller LSS i forhold til en kontrolgruppe af hunde behandlet med kemoterapi alene, observerede vi en statistisk signifikant forbedring i den vaccinerede gruppe i hastigheden af ​​varige anden remissioner samt efterfølgende lymfom-specifik overlevelse i recidiverende hunde efter behandling med salvage terapi. Dette resultat er særligt spændende, fordi bjærgning terapi anvendte omfattede kun lægemidler, der allerede var blevet anvendt i den indledende kemoterapi. Det har længe været værdsat, at langt størstedelen af ​​hunde med NHL, at tilbagefald efter indledende remission lider hurtig tumorprogression og dø til trods bjærgning behandlinger [15]. Som en illustration af dette, i kemoterapi (ingen vaccine) gruppe i denne undersøgelse, var holdbare anden remission opnået i kun 7,7% af hundene. I modsætning til hunde, der tilbagefald efter kemoterapi plus CD40-B vaccination, 40% af hunde opnåede en anden, holdbar remission. Desuden lymfom-specifik overlevelse var længere i recidiverende hunde, der tidligere var blevet vaccineret end de hunde, der ikke har haft (med aktiv klinisk opfølgning igangværende). Selv om antallet af hunde i den vaccinerede gruppe er lille, er de kliniske fund i denne feasibility studie opmuntrende og garanterer yderligere test i en større, dobbelt-blindet, randomiseret klinisk forsøg. Samlet set vores kliniske og immunologiske resultater antyder, at celle-baserede CD40 kræft vaccination synergistisk med kemoterapi for at forbedre det kliniske resultat i denne sygdom.

Vaccinen anvendte strategi i denne undersøgelse bygger på vores tidligere prækliniske arbejde [10], [ ,,,0],12] hvilket viser at CD40-B kan anvendes som et alternativ til DC i cancer vaccinestrategier, med den ekstra fordel af

ex vivo

celleekspansion tillade flere vacciner, der skal genereres fra et lille rumfang perifert blod. Vores resultater bekræfter, at brugen af ​​hele tumor RNA transficerede CD40-B-celler som et alternativ til DC vaccination er både mulig og veltolereret

in vivo

. I denne undersøgelse anvendte vi hele tumor RNA som den antigene nyttelast, der leverer både muterede tumor /lymfom specifikke antigener og ikke-muterede selv-antigener.

In vitro

, RNA-transficerede CD40-B kan stimulere cytotoksisk T-celle responser mod tumorantigener, der er sammenlignelige med responser induceret af antigen-loaded DC [10], [16]. Her har vi omsat disse fund i den kliniske arena og viser, ligner antigen-loaded DC, CD40-B kan fremkalde immunrespons, når det administreres

in vivo

. Vigtigt er det, fandt vi, at autolog RNA indlæst CD40-B kunne administreres sikkert til hunde med kun lejlighedsvise og milde reaktioner på injektionsstedet noteret som akutte bivirkninger. En hund havde en enkelt anafylaktisk-lignende reaktion på den første vaccination, som ikke forekomme efter den anden eller tredje vaccination. Ingen langsigtede komplikationer ved vaccination, herunder autoimmunitet blev identificeret enten klinisk eller ved obduktion i nogen af ​​hundene. Desuden har vi også vurderet samlet overlevelse mellem den vaccinerede gruppe og kontrolgruppen og fandt ingen statistisk signifikant forskel, hvilket indikerer, at vaccination ikke øgede dødelighed.

Vores observationer, at der forud CD40-B vaccination positiv indvirkning satsen for anden remission og efterfølgende overlevelse i tilbagefald hunde behandlet med bjærgning terapi paralleller fund, der er på vej ud af seneste arbejde i vaccine forsøg menneskelige; nemlig at langvarig overlevelse [1] eller en uventet høj svarprocent redde terapi [17], uden nødvendigvis at forbedre progressionsfri overlevelse i humane patienter vaccineret med antigen-loaded DC. Disse humane undersøgelser dokumenteret en sammenhæng mellem tidlig immunrespons til vaccination og uventede og holdbare svar på senere kemoterapi, og foreslå et komplekst samspil mellem kemoterapi og immunterapi, som kan være terapeutisk udnytte. Skønt de underliggende mekanismer bag disse observationer ikke er fuldstændigt forstået, antages det, at brugen af ​​cytotoksisk kemoterapi i patienter, hvis immunsystemer er blevet behørigt primet til at genkende tumorantigen via cancer vaccination kan forstærke antitumor-immunitet [18] – [19] . Cytotoksiske midler såsom antracykliner kan fremkalde “immunogen” tumor celledød og frigivelsen af ​​potente pro-inflammatoriske molekyler, der fremmer DC aktivering og antigen bearbejdning og præsentation [20]. Endvidere kan de cytotoksiske virkninger af salvage terapi frembringe en immunologisk anti-tumor forstærkende virkning ved at nedbryde tumorceller og derved frigive tumorantigener til præsentation [21]. Meget seneste data tyder også på, at kemoterapi kan bevidstgøre tumor mål for drab ved specifikke T-celler induceret ved vaccination [22]. Cytotoksiske midler såsom cyclophosphamid kan også forøge anti-tumor immunitet gennem hæmning af regulatoriske T-celler [23] og ved at modulere balancen i dendritiske celle-undergrupper i lymfoide organer [24]. Således i vores undersøgelse, er det muligt at salvage terapi tjente til at forøge anti-tumor immunrespons, der var blevet behørigt primet ved forudgående CD40-B vaccination, hvilket fører til holdbare anden remission tider og forlænget samlet overlevelse.

Vi brugte data fra hunde behandlet med den samme kemoterapi protokol ved samme institution som kontrol befolkning i TTP /LSS analyser. Ideelt set ville den kontrol befolkning har bestået af hunde randomiseret til at modtage kemoterapi alene, og sammenligningerne udført på intent-to-treat basis; Men så mange som 40% af hunde præsentere vores institution med NHL mislykkes induktion kemoterapi og ville derfor ikke være berettiget til vaccination eller optagelse i kontrolgruppen befolkning. Prøven størrelse, der kræves for at have tilstrækkelig strøm til en sådan undersøgelse ville være ganske stor, og derfor ikke praktisk for en forundersøgelse. Som alternativ valgte vi hunde med den samme sygdom, behandles med den samme 20-ugers kemoterapi regime, der førte til en fuldstændig remission af en større gruppe af hunde med NHL som en ikke-vaccineret kontrolgruppe. Vigtigere, ved at analysere tidligere er beskrevet negative prognostiske faktorer mellem gruppe 2 og 3 (tabel 1), bekræftede vi, at der ikke var nogen statistisk forskel i disse faktorer mellem gruppe 2 og 3. På grund af den lille populationsstørrelse af gruppe 2 og mangfoldigheden variabler er det muligt, at forskelle i negative prognostiske faktorer mellem grupperne kan have eksisteret.

Endelig vores resultater understreger værdien af ​​en komparativ onkologi tilgang [13], [25], hvori privatejede hunde med NHL repræsenterer ikke kun et stort klinisk problem inden for veterinærmedicin men også en spontan dyremodel for den humane tilstand. Afprøvningen af ​​nye immunterapier i høj risiko, men minimal residual sygdom indstilling i hunde er hensigtsmæssig og etisk, og potentielt afgørende for en vellykket udvikling af immunologiske metoder, der ellers ville blive undertrykt af store tumor byrder. Her, i stedet for at indsætte komplekse terapeutiske indsats for at imødegå problemer i immunosuppression i tumor mikromiljø, vi først brugt standard kemoterapi til massivt sænke tumorbyrde forud for immunterapi. I langt de fleste af fase I kliniske forsøg, der evaluerer immunterapier hos mennesker, patienter har signifikant tumorbyrde, fremskreden sygdom, og har lidt de immunosuppressive virkninger af flere runder af kemoterapi og andre behandlinger. Studiet af hunde med spontan NHL giver en unik mulighed for at evaluere den terapeutiske virkning af immun terapier i fastsættelsen af ​​minimal residual sygdom. Resultaterne fra denne undersøgelse tyder på, at synergistiske virkninger mellem kemoterapi og immunterapi forekomme, og at den optimale kombination af disse modaliteter kan medføre betydelige terapeutiske respons. Yderligere undersøgelser i privatejede hunde med naturligt forekommende kræftformer kan give mulighed for at forstå de underliggende mekanismer bag denne effekt, og at bestemme den optimale kombination og rækkefølge af kemo-immunterapi til terapeutisk succes. Denne fremgangsmåde kan fremskynde oversættelsen af ​​sådanne kombinationer til humane patienter.

Materialer og metoder

Etik Statement

Undersøgelsen blev godkendt af vores universitetets Institutional Animal Care og brug Udvalg ( protokol 800.900) og det privatejede Animal protokol udvalg fra University of Pennsylvania School of Veterinary Medicine (protokol POAP-197).

protokol studiepopulation, støttekriterier og studiedesign

Hunde med nyligt diagnosticeret, var ubehandlet multicentrisk NHL, der vejede mere end 5 kg screenet for berettigelse til at deltage i denne undersøgelse. På tidspunktet for diagnosen, komplet iscenesættelse, herunder CBC, serum kemi profil, urinanalyse, thorax røntgenbilleder, abdominal ultralyd, immunfænotype, knoglemarvsaspirater, lymfeknude og biopsier, blev udført. Kriterier omfattede ingen alvorlige samtidige sygdom, mindre end 30% lymfoblaster på knoglemarvsaspirater, sjældne for fraværende lymfoblaster detekteret på perifert blod smear gennemgang, og skriftligt informeret samtykke fra ejeren.

Før induktion kemoterapi en enkelt, perifer lymfeknude blev kirurgisk fjernet, og perifert blod blev indsamlet til vaccine generation og baseline immunforsvar undersøgelser. Induktion kemoterapi bestod af en kort, 20-ugers kombinationskemoterapi protokol herunder cyclophosphamid, doxorubicin, vincristin, L-asparaginase, og prednison, som tidligere beskrevet [14]. Den samme induktion kemoterapi protokol blev brugt til hunde i gruppe 2 og 3. Alle hunde blev komplet genopsætning, herunder fine nåle aspirater og cytologisk vurdering af en perifer lymfeknude, to uger efter afslutningen af ​​protokollen. Kun hunde, der blev bekræftet at være i fuldstændig remission var berettiget til vaccination og kun disse hunde undergik yderligere blod trækker for PBMC kollektion.

autolog vaccine bestod af de samlede tumor RNA-loaded CD40-B-celler og vaccinen kontrol bestod af CD40-B-celler fyldt med CDV-HA mRNA. Vaccinationer blev påbegyndt 3 til 4 uger efter afslutning af kemoterapi. Vaccinerede områder blev barberet og aseptisk udarbejdet forud for vaccination. Vacciner blev givet intradermalt (tumor RNA CD40-B i ét slag; CDV-HA CD40-B i den modsatte flanke) hver 2. til 3. uge i i alt tre vaccinationer. Blood for immun studier og toksicitet overvågning blev indsamlet umiddelbart før hver vaccination og 3 uger efter sidste vaccine blev givet.

Hunde, der har undladt at opnå remission og derfor ikke modtage vaccinen, og hunde, der blev vaccineret, men tilbagefald senere blev tilbudt standard-of-care salvage terapi i henhold til deres ejeres præference og dyrlæge anbefalinger. Alle vaccinerede hunde blev overvåget for tilbagefald gennem månedlige undersøgelser for det første år, hver anden måned for 2

nd år og hver 3. måned for tredje år. Tilbagefald blev bekræftet af fine nål aspirater i alle hunde.

RNA og mRNA forberedelse

Manufacturing informationer til CD40-B forberedelse, RNA isolering og elektroporation er tidligere blevet rapporteret [12]. Kort fortalt blev totalt RNA ekstraheret fra malignt lymfeknudevæv taget på tidspunktet for diagnosen og før kemoterapi under anvendelse af RNAeasy (Qiagen, Valencia, CA). RNA mængde blev bestemt ved at måle OD ved 260 nm og RNA kvalitet blev bestemt ved gel electophoresis. RNA blev opbevaret ved -80 ° C før brug. mRNA, der koder fuld-længde CDV-HA eller GFP blev fremstillet ud fra template plasmider ved in vitro-transkription som beskrevet tidligere [12]. Transkriberede RNA blev polyadenyleret ved 3′-terminalen ved hjælp af Escherichia coli Poly (A) Polymerase I (E-PAP), behandlet med DNAse til fjernelse af plasmidsekvenser og oprenset ved sur phenol /chloroform ekstraktion og RNeasy-søjle separation (Qiagen).

Vaccine fremstilling

CD40-B blev genereret fra hunde mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) under anvendelse K562-celler transficeret med human CD40L (KtCD40L) som feederceller som tidligere beskrevet [12]. 5 × 10

6 PBMC’er blev co-dyrket med 10

6 letalt bestrålede KtCD40L celler i nærværelse af rekombinant hunde IL-4 og cyclosporin. Efter 5-7 dage blev B celler høstet, talt og re-stimuleret med bestrålede KtCD40L celler i nærværelse af IL-4 og cyclosporin. Celler blev stimuleret med KtCD40L celler tre gange. Fem dage efter CD40-B sidste stimulation høstet, vasket to gange i PBS og resuspenderes ved 2 × 10

6 celler pr 100 ul af Nucleofector B-opløsning (Amaxa, Köln, Tyskland). Op til 5 x 10

6 celler blev elektroporeret med enten 10 ug autolog tumor-RNA eller 2 ug CDV mRNA ved hjælp af Amaxa Nuceofector enhed (puls program u08). Den elektroporator designet og fremstillet i henhold til GMP-standarder fastsat af FDA og er godkendt til brug i human vaccine produktion. Efter elektroporering blev celler vasket en gang i B-medier og derefter to gange i PBS. Elektroporerede celler blev resuspenderet i 300 ul PBS og indgivet intradermalt over højre flanke for tumor RNA-påfyldte CD40-B-celler og over venstre for CDV-loaded CD40-B-celler.

Vaccine forberedelse og generation

CD40-B-celler og tumor-RNA blev genereret fra alle hunde, selv om antallet af CD40-B-celler produceret varieres per hund.