PLoS ONE: antitumoraktivitet emodin mod kræft i bugspytkirtlen afhænger af dens dobbeltrolle: Fremme af apoptose og Undertrykkelse af Angiogenesis

Abstrakt

Baggrund

emodin er blevet vist at inducere apoptose af kræft i bugspytkirtlen celler og inhibere tumorvækst i vores tidligere undersøgelser. Denne undersøgelse blev designet til at undersøge, om emodin kunne hæmme angiogenese af kræft i bugspytkirtlen væv og dens mekanisme.

Metode /Principal Finde

I overensstemmelse med vores tidligere undersøgelse, emodin hæmmet bugspytkirtlen vækst kræftcelle, induceret apoptose, og forbedret anti-tumor effekt af gemcitabin på bugspytkirtlen Caner celler

in vitro

in vivo

ved at hæmme aktiviteten af ​​NF-KB. Her, for første gang, demonstrerede vi, at emodin inhiberede tumor angiogenese

in vitro

i implanterede bugspytkirtelkræft væv, faldt ekspressionen af ​​angiogenese-associerede faktorer (NF-KB og dens reguleret faktorer VEGF, MMP-2 , MMP-9, og eNOS), og reduceret eNOS phosphorylering, som det fremgår af både immunhistokemi og Western blot-analyse af implanterede tumorer. Desuden fandt vi, at emodin havde ingen effekt på VEGFR udtryk

in vivo

.

Konklusioner /Betydning

Vores resultater antydede, at emodin har potentiale anti-tumor effekt på pancreas kræft via sin dobbelte rolle i fremme af apoptose og hæmning af angiogenese, sandsynligvis gennem regulering af ekspressionen af ​​NF-KB og NF-KB-regulerede angiogenese-associerede faktorer

Henvisning:. Lin SZ, Wei WT, Chen H, Chen KJ, Tong HF, Wang ZH, et al. (2012) antitumoraktivitet emodin mod kræft i bugspytkirtlen afhænger af dens dobbeltrolle: Fremme af apoptose og Undertrykkelse af angiogenese. PLoS ONE 7 (8): e42146. doi: 10,1371 /journal.pone.0042146

Redaktør: Dominique Heymann, Faculté de médecine de Nantes, Frankrig

Modtaget: Marts 22, 2012; Accepteret: 2 jul 2012; Udgivet: 2 August, 2012

Copyright: © Lin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne er taknemmelige for finansiering støtte fra: Administration af traditionel kinesisk medicin i Zhengjing provinsen, Kina (Grant nr 2011ZZ010), Zhejiang Provincial Videnskab fond for Distinguished Young Scholars (Grant No. LR12H280001) og The National Natural Science Foundation of China (Grant Nej . 81.173.606). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i øjeblikket behandling af pancreascancer er afhængig af kirurgisk resektion. Imidlertid kun omkring 25% af patienter med kræft i bugspytkirtlen er mulige for kirurgisk resektion på grund af invasionen af ​​pancreascancer. Mange patienter med lokalt fremskreden eller metastatisk bugspytkirtelkræft stole på gemcitabin kemoterapi [1]. Men bugspytkirtelkræft er en repræsentant for de mest vaskulariserede og angiogene solide tumorer, der reagerer dårligt på gemcitabin kemoterapi. Tidligere undersøgelser har antydet, at behandling med gemcitabin resulterer i den mediane overlevelsestid på ca. 6,2 måned [2]. Således søger nye behandlingsstrategier til formål at forbedre den antiangiogene kapacitet haster i klinisk praksis for at øge den terapeutiske virkning og hæmmer metastase af kræft i bugspytkirtlen.

konstitutiv aktivering af nuklear faktor-KB (NF-KB ) kan fremme celleproliferation, inhiberer celle apoptose og regulere ekspressionen af ​​gener associeret med angiogenese [3], [4]. Desuden akkumulerende beviser tyder på, at NF-KB spiller en stor rolle i væksten, apoptose inhibering, og angiogenese af pancreascancer [5]. Gemcitabin kan forbedre ekspressionen og aktiveringen af ​​NF-KB i bugspytkirtelkræftceller [6], som er forbundet med udviklingen af ​​kemoresistens af pancreascancer. Derfor kan et nyt lægemiddel, der inhiberer NF-KB-ekspression og aktivering inducerer apoptose af annullere celler og reducere angiogenese af pancreascancer og dermed styrke antitumoraktiviteten af ​​gemcitabin og potentielt kommer patienterne med kræft i bugspytkirtlen.

emodin (1,3,8-trihydroxy-6-methylanthraquinon), en naturlig anthraquinon derivat isoleret fra Rheum palmatum L, er i stand til at hæmme væksten af ​​bugspytkirtelkræftceller som påvist ved tidligere undersøgelser [6], [7], [ ,,,0],8]. Påfaldende er det blevet rapporteret, at emodin har potentiale til at hæmme flere angiogene processer [9], [10]. Det er blevet foreslået, at emodin kan inhibere cancercellevækst ved at blokere vaskulær endotelvækstfaktor receptor (VEGFR) signalering i humane coloncancer-celler, hvilket indikerer, at emodin kan anvendes som en potentiel inhibitor for tumorangiogenese [11]. Men det er uklart, om emodin kunne hæmme angiogenese af kræft i bugspytkirtlen. Interessant nok har det vist sig, at emodin kan inhibere ekspressionen og aktiveringen af ​​NF-KB [6], [12]. Derfor, i den foreliggende undersøgelse, vi havde til formål at undersøge, om emodin kan hæmme væksten af ​​bugspytkirtelkræftceller og angiogenese af pancreascancer via en eventuel NF-KB involverede mekanisme. Vi fandt, at behandling med emodin forbedret gemcitabin-induceret væksthæmning og apoptose af bugspytkirtelkræftceller

in vitro

. Vi yderligere demonstreret tumorvækstinhiberingen og anti-angiogenese virkninger af emodin på pancreascancer

in vivo

, med nedregulering af ekspressionen af ​​NF-KB og NF-KB-regulerede proteiner (dvs. VEGF, MMP-2, MMP -9, og eNOS), og med roller i angiogenese hæmning og reducere eNOS fosforylering.

Resultater

cytotoksicitet emodin mod SW1990 Celler, Panc-1 celler, HPNE og ECS ​​

for at teste cytotoksiciteten af ​​emodin, SW1990 celler og Panc-1-celler blev behandlet med forskellige doser af emodin (10 uM, 20 um, 40 um og 80 uM) i 72 timer, og de levedygtigheder af disse celler blev bestemt under anvendelse af CCK-8 assay. Som vist i fig. 1A, behandling med emodin alene reducerede cellelevedygtigheden af ​​både SW1990-celler og Panc-1-celler på en dosis-afhængig måde. CCK-8 analyse afslørede, at efter SW1990-celler og Panc-1-celler blev behandlet med emodin (40 uM) i 12 timer, 24 timer, 48 timer og 72 timer, emodin reducerede cellelevedygtigheden af ​​begge cellelinier i en tidsafhængig måde (fig. 1B). Interessant emodin (40 uM) behandling i 72 timer reducerede cellelevedygtigheden af ​​SW1990-celler og Panc-1-celler med 46,4% og 40,8%, henholdsvis. Men den kombinerede behandling af både emodin og gemcitabin reducerede signifikant cellelevedygtigheden af ​​SW1990-celler og Panc-1-celler med 72,4% og 54,7%, hvilket indikerer en forøget cytotoksicitet af den kombinerede lægemiddelbehandling imod SW1990-celler og Panc-1-celler sammenlignet til enkeltstofbehandling terapi (. figur 1C) (

P

0,05). Desuden fandt vi, at emodin, gemcitabin, og deres kombination ændrede ikke væksten af ​​humane pancreas normale epitelceller (HPNE) (fig. 1D). Vi fandt, at gemcitabin (20 pmol /l) behandling reducerede signifikant celledød i bugspytkirtelkræft-afledte EC’er, mens emodin (40 pmol /L) behandling og den kombinerede behandling af emodin og gemcitabin forøget celledød i disse celler, hvilket indikerer, at emodin har en hæmmende virkning på proliferation af pancreascancer-afledt EC’er.

cellerne uden lægemiddelbehandling blev anvendt som kontrol. (A) emodin inhiberede proliferationen af ​​SW1990-celler og Panc-1-celler på en dosis-afhængig måde. (B) emodin inhiberede proliferationen af ​​SW1990-celler og Panc-1-celler i en tidsafhængig måde. (C) emodin forbedret spredning inhibering af SW1990-celler og Panc-1-celler ved gemcitabin. (D, E) levedygtighed HPNE og ECS ​​blev vurderet efter behandlet med fortynder kontrol, gemcitabin (20 mmol /l), emodin (40 mmol /l), eller deres kombination for 72 timer. Kvantificering blev udført ved at beregne forholdet mellem en værdi til kontrollen. Data er udtrykt som middelværdi ± SD af hver gruppe af celler fra tre separate forsøg. Emo: emodin; Gem: gemcitabin. *,

P

. 0,05

Effekt af emodin på apoptose af SW1990 Cells og Panc-1 celler

Yderligere flowcytometri analyse viste, at behandling med emodin alene øgede den apoptose på SW1990 celler fra 3,7% til 15,3% og af Panc-1-celler fra 7,7% til 26,0%. Sammenlignet med enkelt lægemiddel behandling, den kombinerede behandling med begge lægemidler inducerede markant højere apoptose (

P

0,05), hvilket var 41,2% for SW1990 celler og 38,7% for Panc-1 celler (2A og B). Disse data er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser af cellevækstinhiberingen anvendelse af MTT-assayet, hvilket indikerer, at tabet af levedygtige celler ved emodin og /eller gemcitabin i det mindste delvis på grund af induktion af celleapoptose.

(A) repræsentative dot-plots illustrerer den apoptotiske status SW1990-celler og Panc-1-celler. (B) Procentdelen af ​​apoptotiske SW1990-celler og Panc-1-celler. *,

P

. 0,05

Effekt af emodin på angiogenese af kræft i bugspytkirtlen-afledt EC’er

angiogenese assay blev udført for at undersøge effekten af emodin på angiogenese

in vitro

. Vi fandt, at gemcitabin (20 pmol /l) behandling opreguleret indekset for angiogenese, mens emodin (40 pmol /L) behandling og den kombinerede behandling af gemcitabin og emodin nedreguleret indekset, hvilket indikerer, at emodin kan inhibere spontan og gemcitabin-induceret angiogenese (figur 3).

(A) Repræsentative mikrografer (200 ×) af angiogenese efter behandling af fortyndingsmiddelkontrol, gemcitabin (20 pmol /l), emodin (40 pmol /L), eller deres kombination i 72 timer. Celler blev udpladet på Matrigel-præcoatede brønde (5 x 10

3 celler /brønd) og dyrket i 10% FBS-DMEM-medium. Oprindelig forstørrelse. (B) Angiogenese af endotelceller (ECS) isoleret fra pancreas cancer væv.

In vitro

angiogenese blev kvantitativt analyseret som beskrevet i Materialer og Metoder. *,

P

. 0,05

Effekt af emodin på Expression og Aktivitet af NF-KB

Resultatet af EMSA-analyse viste, at behandling med emodin betydeligt nedreguleret det DNA-bindende aktivitet af NF-KB i SW1990-celler og Panc-1-celler på en dosis-afhængig måde (fig. 4A og B). De relative niveauer af NF-KB /p65 i SW1990-celler og Panc-1-celler blev bestemt ved anvendelse af Western blot-assay. Vi fandt, at gemcitabin opreguleret ekspression af NF-KB /p65 i SW1990-celler og Panc-1-celler. Men behandling med emodin alene eller kombineret gemcitabin faldt betydeligt den spontane ekspression af NF-KB /p65 i begge typer af celler. NF-KB er en potent transkriptionsfaktor til regulering af ekspressionen af ​​apoptose-relaterede gener (Fig.4C og D). Disse data viste, at emodin hæmmede ekspression af NF-KB og fremme bugspytkirtelkræft celle apoptose

in vitro

og dermed styrke hæmning af cellevækst og proliferation af den kombinerede behandling.

(A) repræsentative billeder, der viser, at behandlingen med emodin i 72 timer hæmmede aktiviteten af ​​NF-KB på en dosis-afhængig måde i SW1990-celler og Panc-1-celler. (B) Data er udtrykt som middelværdi ± SD% af de relative niveauer af NF-KB-aktivering i SW1990-celler og Panc-1-celler fra træ separate eksperimenter. Lig protein loading sikredes ved immunoblotting 10 ug kerneprotein med anti-retinoblastoma antistof. Kerneekstrakterne fra ustimulerede gastriske cancer SGC7901 celler blev anvendt som negativ kontrol, og SGC7901 celler stimuleret med 50 ng /ml TNFa blev anvendt som positiv kontrol. +: Positiv kontrol; -: Negativ kontrol. (C) emodin svækket den spontane og gemcitabin-induceret NF-KB-ekspression i SW1990-celler og Panc-1-celler. (D) Kvantificering blev udført ved at beregne forholdet mellem værdien til kontrolgruppen. *,

P

. 0,05

Effekt af emodin på væksten af ​​orthotopisk transplanteret kræft i bugspytkirtlen

Protokollen behandling er vist i Fig.5A. På dag 56 efter tumorer blev implanteret, den gennemsnitlige vægt af tumorerne behandlet med normalt saltvand, emodin (40 mg /kg), gemcitabin (100 mg /kg), og emodin (40 mg /kg) plus gemcitabin (80 mg /kg) var (1,721 ± 0,149) g, (1,021 ± 0,109) g, (0,794 ± 0,082) g og (0,393 ± 0,057) g. Vi observerede et signifikant fald (

P

0,05) i tumor vægt i emodin eller gemciatabine sammenlignet med den ubehandlede kontrol og den største hæmmende virkning på tumorvækst i kombinationen gruppen (Fig.5B og C) (

P

0,05, sammenlignet med kontrolgruppen eller enkelt lægemiddel gruppe).

(A) Skematisk illustration af forsøgsprotokol. (B) Fotografier af orthotopisk implanterede pancreas tumorer på dag 28 efter behandling. Den kombinerede behandling af emodin og gemcitabin inhiberede tumorvækst betydeligt. (C) De tumorvægte enkelte grupper af mus på den sidste dag af forsøget (dag 37). *,

P

. 0,05

Effekt af emodin på væksten af ​​orthotopisk implanteret kræft i bugspytkirtlen Opdagede af MicroPET

Efter at være behandlet i 4 uger, den nøgne mus blev afbildet med høj opløsning positronemissionstomografi (MicroPET) (fig. 6A) og fluor-18-mærket fluordeoxyglucose (

18F-FDG) for at bestemme forholdet mellem tumor og normalt muskelvæv (T /NT-forhold) i samme størrelse regioner af interesse (ROI) og standard-optagelse er værdier (SUV). Sammenlignet med T /NT forholdet kontrolgruppen (2,78 ± 0,042), de af gemcitabin gruppen (1,88 ± 0,043) og emodin gruppen (2,20 ± 0,052) blev reduceret signifikant (

P

0,05 ), og kombinationen gruppen (1,55 ± 0,058) blev yderligere reduceret (

P

. 0,05, sammenlignet med de enkelte lægemiddelgrupper) (fig 6B). SUV’er af gemcitabin-gruppen (3,61 ± 0,12) og emodin-gruppen (4,10 ± 0,35) var signifikant faldt sammenlignet med kontrolgruppen (5,49 ± 0,22) (

P

0,05), og kombinationen gruppen ( 2,72 ± 0,08) havde endnu lavere optagelse end de enkelte lægemiddelgrupper (

P ..

0,05) (fig 6C)

(a) MicroPET viser en stor koronale sektionsopdelt ortotopisk transplantation tumor i en nøgne mus. (B og C) T /NT-forholdet og SUV’er i gemcitabin gruppe, emodin gruppen og kombinationen gruppen var lavere end for kontrolgruppen (0,9% natriumklorid) (

P

0,05), og kombinationen gruppen viste endnu lavere T /NT-forholdet og SUV’er end emodin gruppen og gemcitabin gruppen. *,

P

. 0,05

Effekt af emodin på angiogenese af orthotopisk implanteret kræft i bugspytkirtlen Opdagede ved Tumor Vaskulær Imaging

Som vist i Fig.7A og B, afslørede tumorvaskulær billeddannelse analyse, gemcitabin øget distribution fartøj (

P

0,05), selv om det faldt tumorens volumen sammenlignet med kontrolgruppen, som vist ved MicroPET (

P

0,05) (Fig.7A og B). Endvidere viste immunhistokemi analyse, at gemcitabin signifikant opreguleret ekspressionsniveauerne af CD31 og CD105, som kan markant nedsat af emodin behandling og den kombinerede behandling af emodin og gemcitabin (Fig.7C og D). Disse observationer foreslog, at emodin kunne hæmme angiogenese af orthotopisk implanterede tumorer

A:. Det vaskulære billede af tumorerne blev erobret af X-ray maskine. B: Vaskulær densitet blev beregnet som den samlede tumor blodkar nummer divideret med tumorvolumen, og derefter normaliseret til kontrolgruppen. (C) emodin alene eller kombineret med gemcitabin inhiberede ekspression af CD31 og CD105. (D) kvantificerede data præsenteres. Kvantificeringen blev udført ved at beregne forholdet mellem værdien til kontrolgruppen. *,

P

. 0,05

Effekt af emodin på Expression af angiogenese-associerede proteiner i ortotopisk bugspytkirtelkræft Væv Opdagede ved immunhistokemi og Western Blot

som vist i fig. 8, immunhistokemi-analyse afslørede, at emodin og gemcitabin nedreguleres ekspressionen af ​​Ki-67 sammenlignet med kontrolgruppen (

P

0,05), og deres kombination yderligere nedreguleres Ki-67-ekspression i forhold til de enkelte lægemiddelbehandlinger (

P

0,05). Både immunhistokemi analyse og Western blot-analyse afslørede, at gemcitabin opreguleret ekspression af VEGF, MMP-2, MMP-9, eNOS, og NF-KB i orthotopisk thanspanted tumorer sammenlignet med kontrolgruppen (

P

0,05). Endvidere emodin behandling og den kombinerede behandling af emodin og gemcitabin signifikant hæmmet eNOS phosphorylering. Vi fandt imidlertid, at ingen af ​​de tre behandlinger ændret ekspressionsniveauet for VEGFR i bugspytkirtelkræft væv.

(A) Immunhistokemi analyse af ekspressionen af ​​Ki-67, NF-KB, VEGF, MMP-2, MMP-9, og eNOS i ortotopisk bugspytkirtelkræft væv. (B) Western blot-analyse af ekspressionen af ​​NF-KB, VEGF, MMP-2, MMP-9, eNOS, VEGFR, og p-eNOS i ortotopisk bugspytkirtelkræft væv. (C) kvantificerede data af immunhistokemi-analyse præsenteres. (D) Kvantificering af western blot resultaterne blev udført ved at beregne forholdet mellem værdien til kontrolgruppen. *,

P

0,05; #,

P

. 0,05

Effekt af emodin på NF-KB aktivitet i transplanteret kræft i bugspytkirtlen væv

For at afgøre, om kombinationsbehandling af emodin og gemcitabin har nogen virkning på NF-KB-aktivering, blev det DNA-bindende aktivitet af NF-KB evalueret ved brug af EMSA-assay. I overensstemmelse med immunoblotting resultater, emodin alene eller kombineret med gemcitabin nedsatte DNA-bindingsaktivitet af NF-KB i bugspytkirtelkræft orthotopisk implanteret med Panc-1-celler (fig. 9A, B).

(A) NF- KB-DNA-bindingsaktivitet blev bestemt ved EMSA og supershift eksperiment. Lig protein loading sikredes ved immunoblotting 10 ug kerneprotein med anti-retinoblastoma antistof. +, Positiv kontrol; -, Negativ kontrol. (B) kvantificerede data præsenteres. *,

P

. 0,05

Effekt af emodin på mRNA Expression Niveauer af NF-KB, VEGF, MMP-2, MMP-9, og eNOS i kræft i bugspytkirtlen væv detekteret ved RT-PCR

i overensstemmelse med resultaterne af immunhistokemi og Western blot-analyse, mRNA ekspression af NF-KB, VEGF, MMP-2, MMP-9 og eNOS i bugspytkirtelkræft væv var op- reguleret i gemcitabin gruppe, men nedreguleret i emodin gruppen og kombinationen sammenlignet med kontrolgruppen i bugspytkirtelkræft væv (

P

0,05). (. figur 10A, B)

(A) mRNA niveauer af NF-KB, VEGF, MMP-2, MMP-9 og eNOS i bugspytkirtelkræft væv i forskellige behandlingsgrupper blev detekteret ved RT-PCR. (B) kvantificerede data blev præsenteret. *,

P

. 0,05

Diskussion

I overensstemmelse med vores tidligere observationer [8], behandlingen af ​​celler med emodin væsentligt forbedret hæmning af celle vækst af gemcitabin, der blev korrelerede godt med resultaterne af apoptose analyse. Ligeledes fandt vi, at emodin hæmmede bugspytkirtlen vækst kræftcellen

in vivo

. Her, for første gang, fandt vi, at emodin inhiberede angiogenese af pancreascancer in vivo, nedreguleret ekspression af NF-KB og NF-KB-regulerede proteiner med roller i angiogeneseinhibering (VEGF, MMP-2, MMP-9, og eNOS). Denne undersøgelse blev fokuseret på den anti-angiogenese effekt af emodin

in vivo

og mulig mekanisme.

Det er blevet rapporteret, at gemcitabin inducerer aktiveringen af ​​NF-KB og efterfølgende forårsager medikamentresistens [ ,,,0],13]. I overensstemmelse med vores tidligere observationer, den foreliggende undersøgelse viser klart, at emodin inhiberede den spontane aktivering af NF-KB på en dosis-afhængig måde i SW1990-celler og Panc-1-celler, og modvirkede gemcitabin-induceret NF-KB-aktivering i begge typer celler. Desuden fandt vi, at emodin alene eller kombineret med gemcitabin præsenteret antitumorvirkninger på en orthotopisk pancreascancer model, som vist ved et fald i tumorvægt. Tilsvarende emodin alene eller kombineret gemcitabin har vist sig at have kraftig anti-tumor effekt i en subkutan tumor model i vores tidligere undersøgelse [8].

Et kritisk trin i angiogenese involverer lokale proliferation af endotelceller. Hee-Jin Kwak et al. viste, at emodin effektivt inhiberer VEGF-A-induceret angiogenese in vitro og in vivo [10]. Alexander D. Crawford et al. rapporterede, at emodin hæmmede mammal endotelcelleproliferation og rør-dannelse in vitro [14]. Og det er blevet rapporteret, at emodin kan inhibere tumor-associeret angiogenese i human coloncarcinom

in vitro

[9]. Vores undersøgelse viste, at proliferation af pancreascancer-afledt EC’er og blodkardannelse blev inhiberet af emodin alene eller kombineret med gemcitabin. Konstitutiv aktivering af NF-KB er observeret i mange cancere, herunder human pancreascancer [15]. Strategier rettet mod NF-KB reguleret pathway kan være nyttige til at forbedre virkningerne af kemoterapeutiske midler, såsom gemcitabin på tumorafledte endotelceller [16]. Vores undersøgelse antydede, at emodin kan hæmme angiogenese af pancreascancer-afledte EC’er gennem NF-KB reguleret signaleringsvej. Desuden viste tumor vaskulære imaging resultater, at den vaskulære tæthed i emodin gruppen og emodin /gemcitabin kombination gruppe væsentligt reduceret i forhold til kontrol- og gemcitabin grupper. I forhold til kontrol- og gemcitabin grupper, den emodin behandling og den kombinerede behandling af emodin og gemcitabin reducerede signifikant ekspressionsniveauerne for CD31 og CD105. Vores resultater antydede, at emodin kan inhibere angiogenese af orthotopisk implanteret pancreascancer.

Tidligere undersøgelser har antydet, at NF-KB kan regulere ekspressionen af ​​flere angiogenese-associerede proteiner, såsom MMP-2, MMP-9, VEGF og eNOS [12], [17], [18], [19]. Vores tidligere undersøgelse har vist, at emodin nedreguleret aktivering og ekspression af NF-KB i SW1990 celleimplantation induceret pancreascancer [20], NF-KB analyse af de ortotopisk tumorvæv i denne undersøgelse viste, at emodin alene eller kombineret med gemcitabin undertrykt NF- KB-udtryk og dets aktivitet i bugspytkirtelkræft væv. fandt også vi, at emodin alene eller kombineret med gemcitabin nedreguleret ekspression af NF-KB-regulerede gener (VEGF, eNOS, MMP2 og MMP9), som er nært forbundet med angiogenese.

MMP-2 og MMP-9 kan være forbundet med tumorangiogenese [9], [17]. Det er blevet rapporteret, at emodin kan inhibere tumor-associeret angiogenese gennem undertrykke MMP-9-ekspression [9]. I denne undersøgelse viste immunohistokemisk analyse, at emodin alene eller kombineret med gemcitabin nedreguleret ekspression af MMP-2 og MMP-9 i ortotopisk bugspytkirtelkræft væv, mens gemcitabin havde ingen effekt på ekspressionen af ​​MMP-2 og MMP-9. Disse resultater antydede, at emodin kan inhibere angiogenese af pancreascancer væv via suppression af MMP-2 og MMP-9.

Som angiogenese regulatorisk faktor, er VEGF tæt forbundet med angiogenese [21] og metastase af kræft i bugspytkirtlen [22]. Som rapporteret af Aggarwal et al., Kan NF-KB-afhængig stigning af VEGF-ekspression fremme tumorcelleoverlevelse og vaskulær angiogenese [23]. En nylig undersøgelse antydede, at emodin kan inhibere ekspressionen af ​​VEGF i humane neuroblastomceller [24]. I denne undersøgelse fandt vi, at emodin alene eller kombineret med gemcitabin betydeligt nedreguleret VEGF-ekspression i orthotopisk implanteret pancreascancer. Vores resultater antydede, at emodin kan inhibere VEGF-ekspression til at undertrykke angiogenese af pancreascancer. Yderligere forsøg viste, at emodin, gemcitabin, og deres kombination havde ingen effekt på VEGFR-ekspression, hvilket indikerer, at inhibering af angiogenese ved emodin i pancreascancer ikke var forbundet med VEGFR.

eNOS stimulerer frigivelsen af ​​NO, som igen kan fremme udbredelsen af ​​EPC’er [25]. Inhibering af eNOS i humane umbilical vene endotelceller (HUVEC’er) kan hæmme proliferation og kanaldannelse af endotelceller [10]. I denne undersøgelse fandt vi, at emodin alene eller kombineret med gemctabine inhiberede eNOS-ekspression i ortotopisk bugspytkirtelkræft væv, hvilket indikerer, at inhibering af eNOS-ekspression kan være involveret i inhibering af tumorangiogenese ved emodin. Yderligere forsøg viste, at emodin behandling og den kombinerede behandling af emodin og gemcitabin signifikant hæmmede eNOS fosforylering, hvilket indikerer, at emodin kan signifikant at hæmme gemcitabin-inducerede eNOS fosforylering, som er involveret i EF-migration, spredning, og dannelse rør

in vitro

[26].

NF-KB er tæt forbundet med ikke blot apoptose inhibering, men også angiogenese af tumorer. Vores undersøgelse viste for første gang, at NF-KB også kan spille en vigtig rolle i angiogenese hæmning ved emodin i bugspytkirtelkræft

in vivo

, og en forstærket effekt af gemcitabin på kræft i bugspytkirtlen kan opnås ved emodin medieret nedregulering af ekspressionen af ​​NF-KB og NF-KB-regulerede proteiner med roller i angiogeneseinhibering (dvs. VEGF, MMP-2, MMP-9 og eNOS). Men hvordan emodin nedregulerer NF-KB-ekspression er endnu ikke undersøgt.

Materialer og metoder

Etik Statement

De eksperimentelle protokoller blev godkendt af Institutional Review Board i Første tilknyttede Hospital, Zhejiang University School of Medicine.

cellelinjer og Dyr

De humane pancreas cancer cellelinjer SW1990 og Panc-1 blev indkøbt fra American Type Culture Collection. Humane pancreas normale epitelceller (HPNE) (CHI Scientific INC, Maynard, MA) blev lagerføres i vores laboratorium. Kvindelige athymiske BALB /c nu /nu mus (4-6 uger gamle) blev indkøbt fra Shanghai Cancer Institute for tumorimplantation. Alle dyrene blev holdt i et sterilt miljø i dyreforsøg Center i Zhejiang University School of Medicine, ifølge Laboratory Animal regulativer Ministeriet for Videnskab og Teknologi i Folkerepublikken Kina (https://www.most.gov. cn /kytj /kytjzcwj /200.411 /t20041108_32465.htm).

Reagenser

emodin blev købt fra Sigma (St. Louis, USA), opløst i dimethylsulfoxid (DMSO) ved 0,2 mmol /l på lager og opbevaret ved -20 ° C. Slutkoncentrationen af ​​DMSO var 0,1%. Gemcitabin blev indkøbt fra Ely Lilly (Bad Homburg, Tyskland) og opløst i sterilt saltvand ved 50 g /l på lager. RPMI-1640 og føtalt bovint serum (FBS) blev opnået fra Gibco BRL (Grand Island, NY, USA). Cell apoptose reagenskit (Annexin V-FITC og PI) blev købt fra Nanjing KeyGen Biotech Co., Ltd (Nanjing, Kina). Celletælling kit-8 (CCK-8) blev købt fra Beyotime Institute of Biotechnology (Haimen, Kina). Fluor-18-mærket fluordeoxyglucose (

18F-FDG) blev leveret af Zhejiang University School (Hangzhou, Zhejiang, Kina). Antistoffer blev fremstillet af følgende kommercielle kilder: anti-MMP-2, anti-MMP-9, anti-VEGF, og anti-β-actin antistoffer blev indkøbt fra Epitomics (Burlingame, Californien, USA); anti-NF-KB, anti-CD31 og anti-CD105-antistoffer blev anskaffet fra Abcam (Cambridge, MA, USA); anti-eNOS og anti-VEGFR (FLK-1) (C1158) antistoffer blev indkøbt fra Santa Cruz (Santa Cruz, USA); anti-Phospho-eNOS (Ser1177) antistof blev købt hos Cell Signaling (Beverly, MA, USA); anti-Ki-67 antistof og DAB-kit blev købt fra Zhongshan Bio-Tech Co., Ltd (Beijing, Kina). Den TRIzol-reagens blev købt hos Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). RNA hurtigt 200 rensning kit blev købt fra Fastagen Biotech (Shanghai, Kina).

Isolering af mikrovaskulære endotelceller (ECS) fra implanterede bugspytkirtelkræft væv.

Implanterede bugspytkirtelkræft væv blev skåret i 1 mm vævsblokke og inkuberet i 0,1% collagenase i i MEM ved 37 ° C i 2 timer. Mikrovaskulær EC’er blev isoleret fra vævet blokke ved en magnetisk perle immunoaffinitets- isolering af endothelceller kit (Dynal Biotech, Brown Deer, WI). Kort fortalt, Dynabeads M-450 og fåre-anti-rotte-IgG koblet med et monoklonalt rotte-anti-muse CD31-antistof (30 pi aliquot pr 5-ml rør) blev inkuberet i 1 ml af væv supernatant ved 4 ° C natten over og derefter vasket tre gange med 10% FBS-DMEM; 1 ml cellesuspension blev anbragt i røret med de vaskede perler. Efter inkubation med lejlighedsvis omrøring ved 4 ° C i 30 minutter blev perle-bundne celler udvundet, vasket og derefter fordøjet i 1 ml trypsin /EDTA (GIBCO) for at frigøre kuglerne. De perle-fri celler blev centrifugeret i 10% FBS-RPMI-1640 og derefter resuspenderet i 7 ml dyrkningsmedier som beskrevet nedenfor. Udbyttet af vaskulær EC’er var 98%. Identiteten af ​​de isolerede celler blev bekræftet ved in vitro rør dannelse i matrigel og farvning for VE-cadherin, en eksklusiv EF markør.

Cell Culture

HPNE, EC’er, SW1990 celler, og Panc -1 celler blev dyrket i RPMI-1640 dyrkningsmedium suppleret med 10% varme-inkuberet FBS (Invitrogen, New York, USA), 100 enheder /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C i en fugtig 5% COz

2 atmosfære. Celler blev passeret ved 70-80% konfluens. Luciferase-transficerede SW1990-celler blev høstet fra 70-80% konfluerende kulturer efter en kort udsættelse for 0,25% trypsin suppleret med 0,2% EDTA. Trypsinisering blev afsluttet med RPMI-1640 medium indeholdende 10% FBS. Cellerne blev vasket en gang i serumfrit medium og resuspenderes i PBS. Karantæner bestående af Panc-1 celler, med 90% levedygtighed blev anvendt til injektionerne

Cell Survival Rate opdaget af CCK-8

HPNE, ECS SW1990 celler, og Panc. -1 celler opsamlet i eksponentiel fase blev podet med en initial densitet på 4 x 10

3 celler per brønd i 96-brønds plader. Så celler blev inddelt i fire grupper med forskellig behandling i 72 h: kontrolgruppen (0,1% DMSO), den gemcitabin gruppen (gemcitabin, 20 pmol /L), den emodin gruppe (emodin, 40 pmol /L), og kombinationen gruppe (gemcitabin 20 pmol /L + emodin 40 pmol /l), med fem brønde til hver gruppe. Brøndene uden medicin, men 0,1% DMSO blev anvendt som kontrol. En time før eksponering sluttede, blev 0,01 ml CCK-8 tilsættes til hver brønd.