PLoS ONE: Eribulin Mesylate Mål Menneskelig Telomerase revers transkriptase i kræft i æggestokkene Cells

Abstrakt

Behandling af fremskreden kræft i æggestokkene indebærer platinbaseret kemoterapi. Men kemoresistens er en væsentlig hindring. Kræft stamceller (CSCS) menes at være en af ​​årsagerne til kemoresistens, men den underliggende mekanisme er stadig undvigende. For nylig er human telomerase revers transkriptase (hTERT) blevet rapporteret at fremme CSC-lignende træk. I denne undersøgelse fandt vi, at en mitotisk inhibitor, eribulin mesylat (eribulin), effektivt hæmmet vækst af platin-resistente æggestokkene kræft cellelinjer. Eribulin-sensitive celler viste en højere effektivitet for sfære dannelse, hvilket antyder, at disse celler besidder en forbedret CSC-lignende fænotype. Desuden er disse celler udtrykte et højere niveau af hTERT, og undertrykkelse af hTERT-ekspression med siRNA resulterede i nedsat følsomhed over for eribulin, hvilket antyder, at hTERT kan være et mål for eribulin. Faktisk fandt vi, at eribulin direkte hæmmede RNA-afhængig RNA-polymerase (RdRP) aktivitet, men ikke telomerase aktivitet af hTERT

i

vitro

. Vi foreslår, at eribulin målretter RdRP aktivitet af hTERT og kan være et effektivt terapeutisk mulighed for CSCS. Desuden kan hTERT være et nyttigt biomarkør til at forudsige klinisk respons på eribulin

Citation:. Yamaguchi S, Maida Y, Yaskawa M, Kato T, Yoshida M, Masutomi K (2014) Eribulin Mesylate Mål Menneskelig Telomerase-revers transkriptase i æggestokkene Cancer Cells. PLoS ONE 9 (11): e112438. doi: 10,1371 /journal.pone.0112438

Redaktør: Taro Yamashita, Kanazawa University, Japan

Modtaget: August 19, 2014 Accepteret: 6 okt 2014; Udgivet: November 6, 2014

Copyright: © 2014 Yamaguchi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Grant i Støtte til videnskabelig forskning (26462544) (til SY) fra Japan Society for fremme af Science (http: //www.jsps.go.jp/english/e-grants/), Funding program for de næste generation af verdens førende forskere (næste program) (til KM) fra Japan Society for fremme af Science (http: //www .jsps.go.jp /english /e-jisedai /), Mitsubishi Foundation (KM) (https://www.mitsubishi-zaidan.jp/en/), den Uehara Mindefond (KM) (http: //www.ueharazaidan.or.jp/), og National Cancer center for Forskning og Udvikling Funds (26-A-5) (KM) (https://www.ncc.go.jp/jp/about/rinri/Kaihatsu /). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene er den mest dødbringende af alle gynækologiske maligniteter, hævder omkring 150.000 menneskeliv om året på verdensplan. De fleste af ovariecancer er diagnosticeret på et fremskredent stadium, og platinbaseret kemoterapi er den standard first-line behandling for avancerede æggestokkene kræftpatienter. Men kemoresistens er en væsentlig hindring i behandling af kræft i æggestokkene.

serøs adenocarcinom (SAC), den mest almindelige form for kræft i æggestokkene, som regel reagerer godt på initial platinbaseret kemoterapi, selv om det vil gentage sig, og i sidste ende udvikle medicin modstand. Clear celle carcinom (CCC), den anden mest almindelige form i Japan, er ofte resistent over for indledende platinbaseret kemoterapi [1]. Uanset om der er erhvervet resistens eller primære, mere lovende terapeutiske strategier er nødvendige for at overvinde kemoresistens og forbedre prognosen for patienter med ovariecancer.

Nylige undersøgelser har antydet, at cancer stamceller (CSCS) er, i det mindste i del, der er ansvarlig for kemoresistens i mange typer af kræft, herunder kræft i æggestokkene [revideret i [2]]. CSCS er en subpopulation af tumorceller, som er karakteriseret ved en selvfornyelse kapacitet og evne til at differentiere til forskellige celletyper. Fremkomsten af ​​CSCS forekommer i det mindste delvist som følge af epitel-mesenkymale overgang (EMT), en fremgangsmåde afgørende for embryonisk udvikling, som induceres under cancer progression og afgørende for cancermetastase. CSCS besidder den selvfornyelse funktion i normale stamceller, og lignende signalveje regulerer selv-fornyelse af CSCS og normale stamceller [3]. En sådan vej involverer telomerase-revers transkriptase (TERT), det hastighedsbegrænsende katalytiske underenhed af telomerase, som udtrykkes i de fleste cancere. De seneste oplysninger tyder på, at TERT regulerer stamceller træk i en telomer længde-uafhængig måde. F.eks TERT aktiverer hvilende epidermale stamceller

i

vivo

på en måde uafhængig af den indre RNA komponent i telomerase-enzymet tert [4]. Desuden sammen med switch-Saccharose NonFermentable (SWI-SNF) komplekse protein brahma-relaterede gen 1 (BRG1), tert virker som en transkriptionel modulator af Wnt /β-catenin signalvej, der bidrager til selv-fornyelse og spredning i løbet af udvikling [5]. For nylig, akkumulere data viser, at TERT også opererer i CSCS og fremmer EMT og CSC-lignende træk. Specifikt overekspression af human TERT (hTERT) resulterer i en forbedret kugle-dannende evne, forøget ekspression af EMT /CSC-markører, og steget

i

vivo

tumorigenese forårsaget af hTERT interagere med β- catenin og forbedre dens transkriptionelle aktivitet [6]. Omvendt undertrykkelse af hTERT ekspression resulterer i en nedsat kugle-dannende evne og reduceret ekspression af CSC markør CD44 [7]. Denne funktion af hTERT i fremme af EMT og CSC-lignende træk synes at være uafhængig af dens telomerase-aktivitet [6]. Vi har faktisk rapporteret, at hTERT i et kompleks med BRG1 og nucleolar GTP-bindende protein nucleostemin (NS) (TBN kompleks) deltager i vedligeholdelse af CSCS. Endvidere fandt vi, at overekspression af TBN komplekset forøger tumorigenicitet og ekspression af EMT /CSC-markører i en hTERT-afhængig måde, men i en telomer længde-uafhængig måde [8]. De nøjagtige telomerase-uafhængige mekanismer, som TBN kompleks regulerer CSCS forblive undvigende. En mulig mekanisme er via RNA-afhængig RNA-polymerase (RdRP) aktivitet af hTERT [9]. RdRP inducerer RNA-interferens gennem fremstilling af dobbeltstrengede RNA’er fra enkeltstrengede template RNA’er og regulerer samlingen af ​​heterochromatin og mitotisk progression [10]. Svarende til RdRPs i modelorganismer, fandt vi, at RdRp aktiviteter TBN komplekset er høj i mitotiske celler, og undertrykkelse af TBN komplekse resultater i mitosestandsning [11].

For at løse kemoresistens, terapeutiske strategier rettet mod EMT og CSCS i stigende grad tiltrækker opmærksomhed. For nylig, fordi eribulin mesylat (eribulin) blev rapporteret at inhibere metastase ved at vende EMT [12], vi spekulerede at eribulin kan målrette CSCS. Eribulin er en ikke-taxan inhibitor af mikrotubulusdynamik [13], som inducerer irreversibel mitotisk blokade, hvilket fører til vedvarende inaktivering af Bcl-2 og efterfølgende apoptose [14]. I USA, er eribulin blevet godkendt til behandling af metastatisk brystkræft efter mindst to behandlingsregimer herunder et antracyklin og et taxan. Endvidere er eribulin godkendt til behandling af inoperabel eller tilbagevendende brystkræft i Japan.

I denne undersøgelse fandt vi, at eribulin effektivt hæmmet vækst af platin-resistente æggestokkene cancerceller. Eribulin-sensitive celler viste forbedret CSC-lignende egenskaber og høj hTERT-ekspression. Undertrykkelse af hTERT udtryk resulterede i nedsat følsomhed over for eribulin. Desuden eribulin hæmmede RdRP aktivitet hTERT

i

vitro

, viser, at hTERT er et direkte mål for eribulin.

Resultater

Eribulin hæmmer væksten af cisplatin-resistente æggestokkene adenocarcinom cellelinjer

Fjorten æggestokkene adenocarcinom cellelinier blev undersøgt for følsomhed over for cisplatin [cis-diammindichlorplatin (II)], herunder seks SAC cellelinjer (PEO1, PEO4, PEO14, PEO23, OVKATE, og OVSAHO), seks CCC cellelinjer (RMG-I, ES-2, OVISE, OVMANA, OVTOKO, og TOV21G), og to udifferentierede /uklassificerede adenocarcinom cellelinier (OVCAR-3 og A2780) (tabel S1). Som vist i figur 1A, OVKATE, RMG-I, PEO4, og PEO23 celler var særligt resistente over for cisplatin, formodentlig via forskellige mekanismer. OVKATE celler er tidligere blevet rapporteret som resistente over for platin agenter med forhøjet ekspression af glutathion-S-transferase, et lægemiddel-resistens markør [15]. RMG-I-celler er også resistente over for cisplatin, der involverer den ekstracellulære signal-regulerede kinase (ERK) pathway [16]. PEO4 og PEO23 celler blev afledt fra de samme patienter som PEO1 og PEO14 celler henholdsvis efter udvikling af klinisk kemoresistens, og er derfor platin resistente [17]. BRCA2 mutation har vist sig at bidrage til platinmodstandstermometer i PEO4 celler [18]. Salg

Celler blev behandlet med cisplatin eller eribulin i 72 timer og derefter cellelevedygtigheden blev bestemt ved MTT-assays. (A) Mean IC

50 værdier for cisplatin (uM). (B) Mean IC

50 værdier for eribulin (nM). Eribulin-sensitive (Eribulin S) cellelinier er vist som åbne søjler, og eribulin-resistente (Eribulin R) cellelinier er vist som lukkede søjler. Fejlsøjler repræsenterer SD af mindst tre uafhængige forsøg.

Vi screenede en serie af kendte anti-cancer forbindelser til vækstinhibering af platin-resistente æggestokkene cancercellelinier. Vi fandt, at eribulin, en mitotisk inhibitor, der undertrykker mikrotubulusdynamik [13], hæmmet vækst af RMG-I, PEO23, og PEO4 celler (Figur 1B). Påfaldende, eribulin var ikke så effektiv i nogle af cisplatin-sensitive cellelinjer, såsom OVTOKO, PEO14, og TOV21G (figur 1A og 1B). For yderligere karakterisering, vi definerede otte cellelinjer med en IC

50 100 nM for eribulin som “eribulin-følsomme” (Eribulin S) og seks cellelinjer med en IC

50 100 nM for eribulin som “eribulin-resistent” (eribulin R).

eribulin følsomme cellelinjer viser en højere sfære-dannende kapacitet

CSCS menes at være ansvarlig for kemoresistens, og CSCS er blevet rapporteret at bidrage til cisplatin resistens i flere typer af kræft [19]. Endvidere blev det for nylig rapporteret, at eribulin reverserer EMT [12], en fænotype, der er stærkt relateret til CSCS. Derfor har vi undersøgt, om eribulin-sensitive celler besidder en forbedret CSC-lignende fænotype. Fordi en kugle-dannende evne er en CSC-lignende karakteristik, udførte vi sfære dannelse assays under serumfrie betingelser, og fandt, at eribulin-følsomme cellelinier viste høje sfære dannelse effektivitet (figur 2A og 2B). Kuglen dannelse effektivitet Eribulin S cellelinier var signifikant højere end den for Eribulin R cellelinjer (figur 2C, p = 0,0013), hvilket antyder, at eribulin-følsomme cellelinier har forbedret CSC-lignende karakteristika.

(A ) Sphere dannelse effektivitet (SFE) af hver cellelinje blev indikeret per 1.000 celler. Eribulin S cellelinjer er vist som åbne søjler, og Eribulin R celler er vist som lukkede søjler. Hvert forsøg blev udført mindst tre gange, og gennemsnitsværdier ± SD er vist. (B) Morfologi af tumorspheres under serumfrie betingelser. Repræsentative billeder af sfærer dannet af A2780, RMG-I, ES-2, OVSAHO, TOV21G, og OVTOKO celler er vist. Scale bar = 50 um. (C) Middelværdien SFE af Eribulin S cellelinier (n = 8) og Eribulin R cellelinier (n = 6) er vist i (A). Fejlsøjler indikerer SD. (D) Niveauet for BRG1 og NS-protein-ekspression blev detekteret ved immunoblotting. GAPDH-ekspression blev vist som ladningskontrol. (E) Signaler i (D) blev kvantificeret med ImageJ software og normaliseret til GAPDH signal. Middelværdierne for relative ekspression niveau ± SD er vist.

Da vi for nylig har vist, at NS sammen med hTERT og BRG1 fastholder CSCS [8] og vi og andre har også påvist, at NS er en nyttig CSC markør [20] – [22], undersøgte vi ekspressionen af ​​BRG1 og NS i Eribulin S og Eribulin R cellelinier. Proteinet Ekspressionsniveauet af BRG1 var signifikant højere i Eribulin S cellelinjer (figur 2D og 2E, p = 0,0189), mens der blev observeret en beskeden tendens højere niveau af NS i Eribulin S cellelinier (figur 2D og 2E, p = 0,1216). Vi har ikke påvise en forskel i udtrykket niveau af CD133 eller CD44 (figur S1), celleoverflademarkørerne underforstået i nogle CSCS [23].

Eribulin S celler udtrykker højere niveauer af hTERT protein

Overekspression af hTERT opstår der en forbedret kugle-dannende evne i gastriske cancerceller [6]. Omvendt undertrykkelse af hTERT-ekspression resulterer i en nedsat kugle-dannende evne i brystcancerceller [7]. Derfor bestemte vi, om de ovariecancerceller med en højere sfære-dannende evne udtrykker et højere niveau af hTERT. Vi observerede en tendens i cellelinier med høj sfære-dannende effektivitet, såsom RMG-I, PEO23, og A2780, at udtrykke relativt høje niveauer af hTERT-protein, mens cellelinier med lav sfære-dannende effektivitet, såsom TOV21G, OVTOKO, og OVMANA udtrykt lave niveauer af hTERT-protein som påvist ved enzymkoblet immunosorbentassay (ELISA) (figur 3A). kan forklares det høje hTERT-ekspression i RMG-I-celler om, med en gain-of-function mutation (-124 G A) i hTERT-promotorregionen (tabel S1 og figur S2). Denne kræft-specifik mutation blev for nylig rapporteret i melanom og flere andre typer af kræft [24] – [27], som skaber nye bindende motiver for E-tyve seks /ternære komplekse faktorer (ETS /TCF) og bidrager således til opreguleret hTERT transskription [24], [25].

(A) niveauet af hTERT-protein-ekspression blev bestemt ved ELISA (angivet som ng /ml). Eribulin S cellelinjer er vist som åbne søjler, og Eribulin R celler er vist som lukkede søjler. Hvert forsøg blev udført mindst tre gange, og gennemsnitsværdier ± SD er vist. (B) Middelværdien hTERT niveau af Eribulin S cellelinier (n = 8) og Eribulin R cellelinier (n = 6) er vist i (A). Fejl søjler indikerer SD.

Vi fandt, at Eribulin S cellelinjer udtrykte højere niveauer af hTERT protein end i Eribulin R cellelinjer (figur 3B, p = 0,008).

Suppression af hTERT udtryk resulterer i nedsat følsomhed over for eribulin

sammenhængen mellem hTERT udtryk og eribulin følsomhed førte os til at postulere, at eribulin hæmmer væksten af ​​kræft i æggestokkene celler via hæmning af hTERT. For at teste denne hypotese undersøgte vi, om suppression af hTERT-ekspression i ovariecancerceller fører til nedsat følsomhed ved eribulin. To uafhængige hTERT-specifikke siRNA’er blev indført i A2780 celler, og følsomhed over for eribulin blev sammenlignet med celler, der udtrykker kontrol siRNA. Som forventet, celler, der udtrykker hTERT siRNA’er viste nedsat følsomhed ved eribulin (figur 4A). TERT siRNA1 viste en tendens til stærkere undertrykkelse af hTERT-ekspression end TERT siRNA2 som påvist ved ELISA (figur 4B). Dette fund kan forklare, hvorfor celler, der udtrykker TERT siRNA1 tendens til at være mindre følsomme over for eribulin end dem, der udtrykker TERT siRNA2 (figur 4A). Lignende resultater blev opnået i ES-2 celler (figur 4C og 4D). Disse resultater antyder, at hTERT kan være et direkte mål for eribulin.

(A) A2780 celler, der udtrykker kontrol siRNA (åbne søjler), tert siRNA1 (lukkede søjler), eller tert siRNA2 (skraverede søjler) blev behandlet med eribulin i 72 timer og derefter cellelevedygtigheden blev bestemt ved MTT-assays. * P 0,05 vs. celler, der udtrykker kontrol siRNA. (B) størrelsen af ​​hTERT proteinekspression i A2780 celler, der udtrykker kontrol siRNA (åbne søjler), tert siRNA1 (lukkede søjler), eller tert siRNA2 (skraverede søjler) blev bestemt ved ELISA (angivet som ng /ml). (C og D) beskrevet i (A og B) blev udført på samme måde ved anvendelse af ES-2 celler, der udtrykker kontrol siRNA (åbne søjler), tert siRNA1 (lukkede søjler), eller tert siRNA2 (skraverede søjler). * P. 0,05 vs. celler, der udtrykker kontrol siRNA

Eribulin hæmmer RdRP aktivitet af hTERT

i

vitro

Det er en udbredt opfattelse at enhver effekt af hTERT suppression medieres af telomer afkortning. Men fordi vi observeret nedsat følsomhed ved eribulin i en relativt kort periode (figur 4, 96 h efter transfektion af siRNA mod hTERT), vi spekuleret på, at denne virkning er uafhængig af telomer opretholdelse funktion af hTERT. Endvidere funktionen af ​​hTERT i fremme af EMT og CSC-lignende træk er uafhængig af dets telomeraseaktivitet [6]. Sammen med vores seneste rapport, der viser, at hTERT har en RdRP aktivitet uafhængig af telomer vedligeholdelse [9], undersøgte vi, om eribulin direkte rettet mod hTERT-RdRP aktivitet. Vi overvågede den hæmmende effekt af eribulin på hTERT-RdRP aktivitet ved hjælp af en

i

vitro

RdRP assay [11], og fandt, at eribulin hæmmede hTERT-RdRP aktivitet

I

vitro

ved en koncentration på 50 pM (figur 5A). Den samme koncentration af eribulin inhiberede ikke telomeraseaktivitet af hTERT som vist ved telomere repeat amplifikationsprotokol (TRAP) assay (figur 5B). Disse resultater antyder, at virkningerne af eribulin på hTERT ikke medieres via telomeraseaktivitet, men via RdRP aktivitet. Interessant har en anden mitotisk inhibitor, paclitaxel, en repræsentant taxan, ikke inhiberer RdRP aktivitet (figur 5C), hvilket antyder, at eribulin har en specifik hæmmende effekt på hTERT-RdRP aktivitet.

(A) RdRP aktivitet af hTERT immun komplekser fremstillet ud fra HeLa-celler anholdt i mitotiske fase blev analyseret uden eller med 10 og 50 uM eribulin. (B) Telomerase-aktivitet i HeLa celleekstrakter blev analyseret uden eller med 10 og 50 uM eribulin. (C) RdRP aktivitet af hTERT immunkomplekser blev analyseret uden eller med 10 og 100 pM paclitaxel (PTX).

Discussion

Blandt gynækologisk cancer, ovariecancer er den hyppigste årsag til død. Især har modstand mod konventionelle platinbaseret kemoterapi været en barriere i forbedringen af ​​prognoser for patienter med ovariecancer, og der er hårdt brug for nye terapeutiske strategier. Her fandt vi, at eribulin var effektiv til at inhibere væksten af ​​platin-resistente ovariecancerceller. Virkninger af eribulin var korreleret med hTERT ekspressionsniveauer (figur 3), og undertrykkelse af hTERT-ekspression resulterede i nedsat følsomhed over for eribulin (figur 4), hvilket antyder, at hTERT kunne være et mål for eribulin i disse celler. Faktisk eribulin hæmmede RdRP aktivitet, men ikke omvendt transkriptase aktivitet hTERT

i

vitro

(Figur 5).

CSCS og hTERT

CSCS menes at være involveret i kemoresistens, og flere veje har vist sig at bidrage til at fremme eller opretholdelse af CSCS. Vi og andre har vist, at hTERT spiller en vigtig rolle i fremme og vedligeholdelse af CSCS i telomer vedligeholdelse-uafhængige manerer [6] – [8]. Eribulin hæmmede effektivt væksten af ​​platin-resistente celler (figur 1). Eribulin-sensitive celler udviste højere hTERT-ekspression (figur 3) og en højere sfære-dannende evne (figur 2), hvilket antyder, at disse celler har forbedret CSC-lignende egenskaber, muligvis på grund af de høje niveauer af hTERT proteinet. Konsekvent, eribulin-sensitive celler udviste højere BRG1 ekspression (figur 2), en anden komponent af TBN kompleks, der opretholder CSCS. Vi har ikke påvise en signifikant forskel i ekspressionen af ​​CD133 eller CD44 (figur S1). Selvom CD133 og CD44 menes at være tegn på CSCS i nogle typer af kræft, er det fortsat at blive belyst hvilke markører er passende for CSCS i ovariecancer [23].

Fordi telomer vedligeholdelse af telomerase er uundværlig for uendelig spredning af maligne celler, er blevet gjort en indsats for at udvikle kræft lægemidler rettet mod telomerase. Nylige undersøgelser viser, at TERT spiller funktionelle roller ud over telomer vedligeholdelse. Faktisk til funktionen af ​​TERT aktivere normale hvilende stamceller eller CSC-lignende træk har vist sig at være uafhængig af dens telomeraseaktivitet [4], [6], [28]. Vi har også fundet, at TBN komplekset opretholder CSCS i en telomer længde-uafhængig måde [8]. Det er muligt, at dette telomerase-uafhængig mekanisme medieres af RdRP aktivitet af TERT, fordi TBN komplekset selv er ansvarlig for RdRP aktivitet og er involveret i heterochromatin regulering og mitotisk progression [11]. Vi spekulere, at RdRP aktivitet hTERT er involveret i genekspression gennem heterochromatin regulering i kræftceller, og det kunne være en roman anticancer terapeutisk mål. Hvorvidt RdRP aktivitet er forudsætning for hTERT funktion i at fremme CSCS er endnu ikke fastslået.

Eribulin og hTERT

Eribulin bindes til mikrotubuli plus ender og hæmmer væksten fase af mikrotubulusdynamik [29] . For nylig eribulin viste sig at vende EMT ved nedregulering transformerende vækstfaktor-β (TGF-β) -induceret Smad phosphorylering [12]. Smad proteiner binder til mikrotubuli i fravær af TGF-β og TGF-β udløser dissociation fra mikrotubuli og phosphorylering af Smad proteiner [30]. Yoshida

et al.

Spekuleret på, at eribulin hæmmer Smad fosforylering muligvis ved at undertrykke Smad dissociation fra mikrotubuli [12]. Fordi vi for nylig har vist, at hTERT lokaliseres mitotiske spindler og centromerer under mitose [11], er det også muligt at eribulin inhiberer hTERT funktioner ved at interferere med interaktionen mellem hTERT og mikrotubuli. Eribulin forbedrer samlede overlevelse af patienter med metastatisk brystcancer, som havde forudgående anthracycline- og taxan kemoterapi [31]. En taxan lægemiddel, paclitaxel, hæmmede ikke RdRP aktivitet af hTERT (figur 5C), giver en af ​​de potentielle molekylære grundlag for de forskellige kliniske resultater af taxaner og eribulin. Den nøjagtige mekanisme, hvormed eribulin hæmmer hTERT funktion er endnu ikke forstået.

hTERT som biomarkør

Det er vigtigt at identificere biomarkører til at forudsige reaktioner på mod kræft behandlinger. Ved bestemmelse af hTERT niveauer i kliniske prøver, kan patienter, der er tilbøjelige til at reagere godt til eribulin identificeres før de modtager kemoterapi. Især vil en ELISA kunne måle hTERT-niveauer i klinisk praksis.

Sammenfattende fandt vi, at eribulin inhiberer RdRP aktivitet af hTERT, som kan bidrage til kemoresistens i æggestokkræft ved at opretholde CSCS. Eribulin hæmmede væksten af ​​ovariecancerceller med høj hTERT-ekspression og stærk platinmodstandstermometer, tyder det kan være et lovende terapeutisk middel til kemoterapi ovariecancer. Desuden kan hTERT være et nyttigt biomarkør til at forudsige klinisk respons på eribulin.

Materialer og metoder

Cellelinjer

RMG-I [32], OVMANA [33], OVTOKO [34], OVISE [34], OVSAHO [33], og OVKATE [33] celler blev opnået fra den japanske Indsamling af Research Bioressourcer Cell Bank. OVCAR-3 celler [35] blev opnået fra Riken Bioresource Center. PEO1, PEO4, PEO14, PEO23 [17], og A2780 [36] celler blev købt fra European Collection of Cell Cultures, og TOV21G [37] og ES-2 [38] celler blev købt fra American Type Culture Collection. RMG-I-celler blev dyrket i Hams F12-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum, ES-2 celler i McCoys 5a medium suppleret med 10% føtalt bovint serum, TOV21G celler i MCDB105 /Medium 199 (01:01) tilsat 10% føtalt bovint serum, og HeLa-celler i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum. Alle andre cellelinier (A2780, OVCAR-3, OVMANA, OVTOKO, OVISE, OVSAHO, OVKATE, PEO1, PEO4, PEO14, og PEO23) blev dyrket i RPMI-1640-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1 mM natriumpyruvat ( Gibco, Grand Island, NY, USA).

Forbindelser

Cisplatin blev købt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA), paclitaxel blev købt fra Wako (Osaka, Japan), og eribulin (Halaven) blev købt fra Eisai Co., Ltd (Tsukuba, Japan).

MTT assay Salg

Celler (5.000-10.000 per brønd) blev podet i plader med 96 brønde og derefter behandlet med cisplatin eller eribulin efter 24 timer. Ved 72 timers behandling blev en MTT proliferationsassay (Cell Proliferation Kit I MTT, Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) udført ifølge producentens protokol. Kort fortalt, 10 pi MTT mærkningsreagens blev tilsat til hver brønd, efterfulgt af 4 timer inkubation. Derefter blev 100 pi opløsning tilsat til hver brønd, efterfulgt af inkubation natten over. Reaktionsproduktet blev kvantificeret ved måling af absorbansen ved 570 og 690 nm under anvendelse af en mikropladelæser (Viento 808, BioTek, Winooski, VT, USA). Cellelevedygtighed blev bestemt ved sammenligninger med ubehandlede celler.

Sphere formation assay

Enkelte celler blev podet i 96-brønds ultra lave montagepladerne (Corning Inc, Corning, NY, USA) ved 100- 1.000 celler /100 pi medium i hver brønd. Celler blev dyrket i serumfrit DMEM /F12-medium (Gibco) suppleret med 20 ng /ml basisk fibroblastvækstfaktor (Wako), 20 ng /ml epidermal vækstfaktor (Wako), og B27 supplement (Gibco). Kulturer blev suppleret med 25 pi af frisk medium hver 3-4 dage, og antallet af kugler blev talt på dag 7 og 14. mikroskopiske billeder blev opnået med et CKX41 omvendt mikroskop og DP21 digitalkamera (Olympus, Tokyo, Japan).

immunblotting

Celler blev lyseret i radioimmunpræcipitationsanalyse (RIPA) buffer indeholdende 1% NP-40, 1 mM EDTA, 50 mM Tris-HCI (pH 7,4) og 150 mM NaCl. Efter lydbehandling og centrifugering af lysaterne blev proteiner (20 ug) udsat for SDS-PAGE i 7,5% poly-acrylamid-geler, efterfulgt af immunoblotanalyse. Følgende antistoffer blev anvendt: anti-BRG1 (en gave fra Dr. Tsutomu Ohta, National Cancer Center, Japan), anti-NS (A300-600A, Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA), anti-GAPDH (3H12; Medicinsk Biological Laboratories (MBL), Nagoya, Japan), anti-CD133 (W6B3C1, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Tyskland) og anti-CD44 (2C5, R Sigma-Aldrich) blev også anvendt

IP-RdRP assay

For at detektere RdRP aktivitet

i

vitro

, hTERT immunkomplekset blev isoleret ved mAb mod hTERT. En IP-RdRP analysen er blevet etableret i mitotisk anholdt HeLa-celler [11]. Derfor blev HeLa-celler anvendes til dette assay. At synkronisere HeLa-celler undergår mitose, blev cellerne dyrket i medium indeholdende 2,5 mM thymidin (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) i 24 timer. Efter 6 timer efter frigivelse blev cellerne inkuberet i medium indeholdende 0,1 ug /ml nocodazol (Sigma-Aldrich) i 14 timer. Efter forsigtig omrystning blev mitotiske celler hentet. IP-RdRP assay blev udført som tidligere beskrevet [11].

TRAP assay

En TRAP-assay blev anvendt til at detektere telomer specifik revers transkriptase-aktivitet som tidligere beskrevet [39].

Statistisk analyse

Statistiske analyser blev udført med GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Den t-test eller Mann Whitney testen blev anvendt. To-sidet p-værdier for 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Støtte Information

Figur S1..

CD133 og CD44 ekspression i Eribulin S og Eribulin R ovariecancer celler. (A) Niveauet for CD133 og CD44-protein-ekspression blev detekteret ved immunoblotting. Da data blev opnået på samme eksperiment som fig 2 panel D, GAPDH gel var identisk med figur 2 panel D. (B) Signaler i (A) blev kvantificeret med ImageJ software og normaliseret til GAPDH signal. Middelværdierne for relativ udtryk niveau ± SD er angivet

doi:. 10,1371 /journal.pone.0112438.s001

(TIF)

Figur S2.

ES-2 og RMG-I-celler besidder hTERT promotorsekvenser mutationer. HTERT-promotoren blev sekventeret i hver cellelinie. ES-2 celler huser en -138 /-139 GG AA mutation som tidligere [27] beskrevet, og RMG-I celler huser en -124 G En mutation. De vildtype sekvenser af de tilsvarende regioner fra OVKATE og OVSAHO celler vises som kontroller

doi:. 10,1371 /journal.pone.0112438.s002

(TIF)

tabel S1.

Ovariecancerpatienter cellelinjer anvendt i denne undersøgelse

doi:. 10,1371 /journal.pone.0112438.s003

(DOCX)

Tak

Vi takker Dr. Tsutomu Ohta for den gave af anti-BRG1 antistof, Dr. Koichi Ichimura til teknisk bistand med promoter mutation analyse og MBL for deres bistand i oprettelse af ELISA kit til hTERT detektion.