PLoS ONE: monoklonale antistoffer erkendelse af de ikke-Tandem Repeat regioner Human Mucin MUC4 i kræft i bugspytkirtlen

Abstrakt

MUC4 mucin er en høj molekylvægt, membranbundne, og yderst glykosyleret protein. Det er en multi-domæne-protein, der formodet spaltes til et stort mucin-lignende underenhed (MUC4α) og en C-terminal vækst-faktor ligesom underenhed (MUC4β). MUC4 spiller kritiske roller i fysiologiske og patologiske tilstande og afvigende overudtrykt i flere kræftformer, herunder bugspytkirtlen, livmoderhalsen, bryst og lunge. Det er også en potentiel biomarkør for diagnose, prognose og progression af flere maligniteter. Endvidere MUC4 spiller forskellige funktionelle roller i kræft initiering og progression som det fremgår af dets involvering i oncogen transformation, proliferation, inhibering af apoptose, motilitet og invasion, og resistens mod kemoterapi i humane cancerceller. Vi har tidligere genereret et monoklonalt antistof 8G7, som er rettet mod TR region MUC4, og er blevet grundigt anvendt til at undersøge ekspressionen af ​​MUC4 i flere maligniteter. Her beskriver vi genereringen af ​​anti-MUC4 antistoffer rettet mod de ikke-TR regioner MUC4. Rekombinant glutathion-S-transferase (GST) -kondenseret MUC4α fragmenter, både opstrøms (MUC4α-N-Ter) og nedstrøms (MUC4α-C-Ter) af TR-domænet, blev anvendt som immunogener til at immunisere BALB /c-mus. Efter cellefusion blev hybridomaer screenet under anvendelse af de førnævnte rekombinante proteiner ad lysater fra humane pankreatiske cellelinier. Tre anti MUC4α-N-Ter og ét anti-MUC4α-C-Ter-antistoffer blev karakteriseret ved flere inmmunoassays herunder enzymkoblet immunosorbentassay (ELISA), immunoblotting, immunofluorescene, flowcytometri og immunpræcipitation under anvendelse MUC4 udtrykker humane pancreas cancercellelinier. Antistofferne reagerede også med MUC4 i humane pancreas tumorsnit i immunhistokemisk analyse. De nye domæne-specifikke anti-MUC4 antistoffer vil tjene som vigtige reagenser til at studere strukturen-funktion forholdet MUC4 domæner, og for udviklingen af ​​MUC4-baseret diagnostik og terapi

Henvisning:. Jain M, Venkatraman G, Moniaux N, Kaur S, Kumar S, Chakraborty S, et al. (2011) monoklonale antistoffer erkendelse af de ikke-Tandem Repeat regioner Human Mucin MUC4 i kræft i bugspytkirtlen. PLoS ONE 6 (8): e23344. doi: 10,1371 /journal.pone.0023344

Redaktør: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, USA

Modtaget: 27. juni, 2011; Accepteret: 12 Jul 2011; Udgivet: 23 August, 2011

Copyright: © 2011 Jain et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne på dette arbejde understøttes til dels af tilskud fra det amerikanske forsvarsministerium (BC074639, BC083295, BC09742, og PC074289) og National Institutes of Health (R21 CA156037, RO1 CA78590, UO1 CA111294, RO1 CA131944, RO1 CA133774, RO1 CA138791, RO3 CA 139.285 og P50 CA127297). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Humant MUC4 er en højt glycosyleret membranassocieret mucin, der består af et stort 850-kD mucin-lignende underenhed MUC4α, og en membranbundet 80 kD vækstfaktor-lignende underenhed MUC4β [1], [2] . MUC4α indeholder et centralt tandemgentagelse (TR) domæne indeholdende varierende antal 16 aminosyre-motiver rest, kunne blive gentaget op til 400 gange per molekyle. TR-domænet er flankeret af et C-terminalt cystein rige domæne og et N-terminalt domæne, som indeholder tre gentagelser af 123 aminosyrerester [1]. MUC4β indeholder en cysteinrige domæne, et domæne rig på N-glycosyleringssteder og tre EGF-lignende domæner [1]. MUC4 anses for at være en human homolog af rotte-sialo-mucin-kompleks (SMC, rotte MUC4) på ​​grund af ligheder i strukturel organisation [1], [3], [4]. SMC er et heterodimert glycoprotein bestående af en O-glycosyleret mucin underenhed, ascites sialoglycoprotein (ASGP-1), tæt bundet til et N-glycosyleret transmembran-underenhed, ASGP-2, som indeholder to epidermal vækstfaktor-lignende domæner i dets ekstracellulære del [ ,,,0],3], [4].

MUC4 udtrykkes i forskellige epitelvæv, herunder epitel af føtale lunger og den voksne luftveje fra luftrøret til samlekanalerne lunge trachea [5], colon [6], endocervix [7], bindehinde [8], hornhinde [9], spytkirtler [10], mellemøret og eustakiske rør [11]. I de seneste undersøgelser, har en progressiv stigning i MUC4 udtryk blevet observeret i bugspytkirtlen intraepithelial neoplastiske læsioner, hvilket indikerer dens rolle i sygdomsudvikling [12]. Tidligere undersøgelser fra vores laboratorium har vist, at inhibering af MUC4 ekspression under anvendelse af anti-sense eller kort interfererende RNA (siRNA) oligonucleotider specifikke for MUC4 resulterer i en nedsat tumorgenicitet og formidling af cancerceller [13]. Endvidere har vores nylige undersøgelser vist, at MUC4 resulterer i onkogen transformation af musefibroblaster [14], bidrager til lægemiddel-modstand bugspytkirtelkræftceller ved at aktivere anti-apoptotiske veje [15], og er involveret i epitel-til-mesenkymale overgang i æggestokkene cancerceller [16]. Disse undersøgelser fra vores laboratorium og andre grupper indikerer den potentielle betydning af dette mucin i forskellige aspekter af tumor biologi.

Vi har tidligere genereret et panel af monoklonale antistoffer rettet mod TR region MUC4 [17]. En af de anti-MUC4 TR-antistoffer, 8G7, har fungeret som et værdifuldt reagens til at studere ekspressionen af ​​MUC4 mucin i forskellige væv og optrævle sin deltagelse i forskellige maligniteter inklusive, pancreas [12], [18], gastrisk [19] , livmoderhalskræft [20], ovariecancer [21], ekstra hepatisk galdegang carcinom [22], colangiocarcinoma [23], og kutant planocellulært karcinom. MUC4 indeholder imidlertid mange strukturelle og funktionelle domæner både opstrøms og nedstrøms for TR-regionen [1], [2], og mange splejsede former for MUC4 er fuldstændig blottet for TR-regionen [24], [25]. Endvidere TR region er stærkt O-glycosyleret. I betragtning af den ændring i glycosyleringsstatus af faste tumorer, er det muligt, at reaktiviteten til antistof kan skjules i visse maligniteter. Således strukturelle kompleksitet MUC4, at der findes talrige splejsningsvarianter og glycoformer, og kraftig O-glycosylering i TR-domænet berettiget frembringelsen af ​​yderligere antistoffer til fuldt ud at forstå strukturen-funktion forholdet af forskellige MUC4 domæner under fysiologiske og patologiske tilstande.

Her rapporterer vi generering og karakterisering af et nyt anti-MUC4 MAbs, som genkender regionerne MUC4α både opstrøms og nedstrøms for TR-domænet. Oprensede rekombinante MUC4 fragmenter, fusioneret i ramme med GST, blev anvendt som immunogener og positive kloner blev valgt på basis af deres reaktivitet i ELISA. Udvalgte kloner blev karakteriseret ved deres reaktivitet over MUC4 i immunblotting, immunopræcipitation, immunofluorescens og flowcytometri under anvendelse bugspytkirtelkræftceller. De ikke-TR anti-MUC4 MAb’er udviklet i denne undersøgelse, kan være lovende reagenser til udvikling af assays til kvantificering af MUC4 i væv og biologiske væsker, for at studere den funktionelle rolle af MUC4 i forskellige sygdomme og potentielt til immunterapi.

Resultater

Den skematiske struktur MUC4 og de rekombinante domæner er angivet i figur 1a. Efter cellefusion blev kultursupernatanter fra stabile hybridomer screenes, og de positive hybridomaer udviste høj reaktivitet med det rekombinante protein og negativ reaktivitet med GST blev klonet ved tre runder af begrænsende fortynding. Syv stabile kloner reaktive med MUC4α-N-Ter og tre kloner reaktive med MUC4α-C-Ter blev opnået (tabel 1 og figur 1b). MAb’erne 2172, 2173, 2175, 2212, 2213, 2214 og 2382 udviste specifik reaktivitet mod MUC4α-N-Ter, mens MAbs 2103, 2106 og 2107 var specifikke for MUC4α-C-Ter. Yderligere har ingen af ​​de selekterede antistoffer viste nogen reaktivitet over oprenset MUC4 TR-peptid, BSA eller GST (data ikke vist). Tilsvarende tidligere genereret anti-MUC4 TR antistof 8G7 eller anti-KLH-antistof K2G6 viste ingen reaktivitet over de rekombinante MUC4 domæner.

a) Skematisk struktur MUC4 og rekombinante proteiner, der anvendes i undersøgelsen. MUC4 er putativt spaltes ved GDPH stedet for at generere en N-terminal mucin-typen subunit MUC4-α og en C-terminal vækstfaktor-typen subunit MUC4-β. Vigtige domæner af MUC4 er markeret. Rekombinante domæner af MUC4- α svarer til fragmenterne opstrøms og nedstrøms for tandem-repeat (TR) domæne blev klonet og udtrykt som beskrevet i Materialer og metoder og betegnet MUC4-α-N-ter og MUC4-α-C-Ter, henholdsvis. De nukleotidnumrene svarer til grænserne for de rekombinante domæner er mærket og er beskrevet i Moniaux et al. og Choudhury et al (ref 1 og 24, henholdsvis) ifølge den oprindelige nummerering. Cys-cystein-rige domæne EGF-epidermal vækstfaktor-lignende domæne; TM-transmembrane domæne; CT-cytoplasmatiske hale. b) ELISA viser reaktiviteten af ​​anti-MUC4 mAb’er mod rekombinante immunogener. De angivne MAb’er blev inkuberet med 2,5 ug /ml GST-mærket N-terminale og tandemgentagelse rekombinante domæner af MUC4. De særlige blev også testet mod MUC4 TR peptid, GST og en ikke-specifik kontrol protein bovint serumalbumin og antistofferne udviste negativ reaktion med disse antigener. Analysen omfattede også en ikke-specifik isotype matchet kontrol K2G6.

Antistofferne blev yderligere testet for deres evne til specifikt at genkende MUC4 protein i lysater af MUC4 udtrykke bugspytkirtelkræft cellelinier ved immunblotting. Af de syv MUC4α-N-Ter-specifikke antistoffer kun MAb’er 2214, 2175 og 2382 erkendte MUC4 protein i cellelysaterne (figur 2). MAb’er 2215 og 2382 anerkendte højmolekylære proteinbånd i lysaterne af MUC4 positive celler (HPAF /CD18, Colo357, QGP1 og T3M4) (fig. 2a og 2c), og reaktiviteten mønster svarede til den af ​​anti-TR MAb 8G7 (fig. 2d). Hver af MUC4 positive cellelinjer udviste et karakteristisk forskelligt band størrelse, som er i overensstemmelse med vores tidligere undersøgelser af VNTR polymorfier i MUC4 med HPAF /CD18, Colo357 og QGP1 viser et enkelt bånd og T3M4 udtrykker to bånd (allel VNTR polymorfi). I modsætning MAb’er 2175, 2382 og 8G7, MAb 2214 reagerede overvejende med lav molekylvægt form af MUC4 men med bandet mønster svarende til VNTR-polymorfi (figur 2b). Mab 2214 viste også meget svag reaktivitet med den højmolekylære bånd svarende til dem, der genkendes af andre antistoffer i QGP1 og T3M4 lysater. Immunoblotanalyse af β-actin i SDS-PAGE løst lysater angivet lig protein loading (Figur 2, indsat). Ingen reaktivitet blev observeret med helst antistof med lysatet af MUC4 negative cellelinie MiaPaCa. Ingen af ​​de anti-MUC4α-C-Ter antistoffer reagerede med MUC4 i cellelysaterne i immunblotting (data ikke vist).

I alt 20 ug protein fra celleekstrakter blev opløst ved elektroforese på en 2% SDS-agarosegel, overført til PVDF-membran og inkuberet med 2 ug /ml MAb’er 2175 (a), 2214 (b), 2382 (c) eller 1 ug /ml anti-MUC4 TR Mab 8G7 (d). Membranen blev derefter probet med peberrodsperoxidase-mærket gede-anti-muse-immunoglobulin. Signalet blev detekteret ved anvendelse af et ECL-reagens kit. Positionen af ​​de detekterede bånd er angivet med pile. Til lastning kontrol blev immunoblot til påvisning af β-actin (indsat a) udført på lysater af respektive celler opløst på 10% SDS-PAGE.

Evnen af ​​antistoffer til at genkende MUC4 i ubeskadiget celler blev undersøgt ved immunfluorescens og flowcytometri. I methanol fikseret og permeabiliseret assay HPAF /CD18-celler alle de valgte MAb’er udviste specifik farvning for MUC4; ingen farvning blev observeret med kontrol-anti-KLH-antistof K2G6 (figur 3). MAb 2214 viste en både membran og perinukleære farvning, mens MAb’er 2175, 2382 og 2106 viste cytoplasmatisk og membran-farvning. Anti-TR MAb 8G7 viste stærkeste reaktivitet på grund af den repetitive natur af epitoperne. Yderligere har ingen af ​​antistofferne viste nogen reaktivitet med MUC4 negative pancreatiske cancercellelinier MiaPaCa eller Panc1 (data ikke vist). For celleoverfladen farvning blev paraformaldehyd-fikseret (unpermmeabilized) celler anvendes, og bindingen af ​​antistofferne blev analyseret ved flowcytometri. MAb 2214 udviste den stærkeste reaktivitet med celleoverfladen i paraformaldehyd-fikserede celler, medens overfladen reaktiviteten af ​​MAb’er 2175 og 2382 var svag og gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) værdier var sammenlignelige med værdierne opnået med MAb 8G7 (figur 4).

Celler blev dyrket ved lav densitet på steriliserede cover-objektglas, fikseret i iskold methanol ved -20 ° C og inkuberet med 10 ug /ml non-TR MAb’er af 2214, 2175, 2382 og 2106, eller 2 ug /ml anti-MUC4 TR MAb 8G7 (kontrol) og påvist under anvendelse af FITC-konjugeret sekundært antistof. Anti-KLH-antistof K2G6 blev anvendt som en isotypekontrol. Celler blev monteret på objektglas ved hjælp anti-fade Vectashield montering medium og observeret under et ZEISS konfokal laser scanning mikroskop (forstørrelse, × 630).

Celler blev høstet ikke-enzymatisk, fikseret med paraformaldehyd og inkuberes med de angivne antistoffer. Efter inkubering med sekundært antistof blev cellerne analyseret under anvendelse BD FACSCalibur. De gennemsnitlige fluorescensintensiteter (MFI) værdier opnået med hvert antistof er angivet i parentes.

domænespecifikke anti-MUC4 antistoffer blev også testet for deres evne til at immunpræcipitere MUC4 hjælp af HPAF /CD18 lysat. MAb’er 2382 2175, og 2214 immunpræcipiteret fuld længde MUC4 fra de totale cellelysater, som blev visualiseret når de behandlede prøver blev opløst på SAS-agarosegel og immunblottet med anti-MUC4-TR MAb 8G7 (figur 5). De immunopræcipiterede prøver fra forskellige antistoffer immunoblottedes også med MAb 2214 på grund af dets dominerende reaktivitet med en lavere molekylvægt form af MUC4. Når undersøgt med MAb 8G7, blev det højeste beløb af MUC4 immunopræcipiteret med 8G7, mens MAb 2382 også resulteret i en betydelig berigelse af 8G7 reaktivt protein bands. MAb’erne 2175 og 2214 også immunopræcipiterede fuld længde 8G7 reaktiv band, men berigelsen var ikke så stærk som observeret med MAb’erne 8G7 og 2382. Anti-C-terminale MAb 2106 og negativ kontrol anti-KLH antistof K2G6 ikke trække ned nogen 8G7 reaktiv proteinbånd. Ingen af ​​de testede antistoffer undtagen 2214, immunopecipitated MAb’et 2214-reaktiv molekylvægt lavpunkt på MUC4.

Proteinlysater fra MUC4-udtrykkende CD18 /HPAF celler blev immunfældet anvendelse af 5 ug /ml 8G7 ( tandemgentagelse MAb), 2382, 2214 og 2175 (ikke-tandemgentagelse MAb’er) og K2G6 (Isotype matchet kontrol MAb) og blev immunblottet under anvendelse af MAbs 8G7 og 2214 som beskrevet i Materialer og Metoder.

evne antistoffer til påvisning MUC4 i tumorvæv blev testet ved immunohistokemiske analyser udført på bugspytkirtelkræft væv. MAb’er 2214, 2175 og 2382 viste positiv farvning i tumorvævet, der bestemtes til at være MUC4 positiv baseret på dets reaktivitet med anti-TR MAb 8G7 (figur 6). Mønsteret for farvning med de nye antistoffer svarede til det observeret med 8G7 viser diffus farvning i både membranen og cytoplasmaet af tumorcellerne. Ingen farvning blev observeret med Mab 2106 eller det ikke-specifikke isotype matchet kontrol MAb K2G6.

Paraffinsnit blev inkuberet med de angivne test- og kontrol-antistoffer og binding blev påvist under anvendelse VECTOR Universal farvning Kit. MAb 8G7 blev anvendt ved en koncentration på 2 ug /ml, mens alle andre antistoffer blev anvendt i en koncentration på 10 ug /ml.

Discussion

MUC4 er et stort glycoprotein involveret i fysiologi og impliceret i forskellige sygdomstilstande. Af særlig betydning er dets rolle i pancreas cancerudvikling og progression [2], [26], [27]. En række nyere undersøgelser har etableret rolle transmembrane mucin MUC4 i patogenesen af ​​flere maligniteter. MUC4 består af to domæner, nemlig MUC4α som har tandemgentagelsesregionen og MUC4β som har den transmembrane region og besidder også vækstfaktor lignende domæner [1], [2]. På grund af den polymorfi i antallet af tandemgentagelser [28] og eksistensen af ​​forskellige splejsede former helt blottet for TR-domænet [25], de antistoffer, der genkender ikke-tandemgentagelse områder af proteinet, som kan give nyttige oplysninger om dens funktion , mulige interagerende partnere og endnu vigtigere kan anvendes i kvantitative assays.

Tre af antistoffer dannet mod regionen opstrøms for det centrale TR domæne 2214, 2175 og 2382, og en af ​​antistoffer dannet mod nedstrøms for TR domæne, 2106 udviste stærk reaktivitet mod de respektive rekombinante domæner i ELISA. Ingen af ​​antistofferne genkender de ikke-specifikke rekombinante domæner, GST eller syntetisk TR peptider. Disse antistoffer kan potentielt tjene som nyttige reagenser til udvikling af MUC4 bioassays og kan supplere den eksisterende anti-MUC4 TR antistof eller andre antistoffer reaktive mod kulhydratepitoper stede på muciner (DUPAN2, CA 19.9, TAG 72). Voksende tegn på, at den MUC4 mucin, grundet dets overekspression i flere maligniteter, er en potentiel markør for diagnose [27], især for den letale pancreascancer hvor dens association med de tidlige neoplastiske læsioner er blevet etableret [29]. En anden nylig undersøgelse har vist MUC4 at være en hidtil ukendt prognostisk faktor ekstra-hepatiske galdegang carcinom [22]. MUC4 udtryk var korreleret med dårlig prognose i små og mellemstore lungeadenokarcinom [30]. Alle disse undersøgelser har vist, at MUC4 kunne være en nøglespiller i tumorigenese; imidlertid alle disse undersøgelser har analyseret MUC4 i vævsprøver, som kan være begrænset af stikprøvefejl, på grund af den heterogene ekspression af tumorantigener. Derfor ville det være logisk at udvikle kvantitative assays for MUC4 i biologiske væsker, som vil være ikke-invasiv, omkostningseffektiv og let automatiseres. På grund af den variable størrelse tandemgentagelsesregionen, kunne antistof, der genkender tandemgentagelsesregionen ikke anvendes til kvantitative formål. Domænet specifikke antistoffer kan potentielt hjælpe med at udvikle

in vitro

diagnostiske assays til kvantificering MUC4 i serum og andre biologiske væsker.

Alle antistoffer, der reagerer med regionen opstrøms for MUC4 TR domæne var i stand at anerkende MUC4 i cellelysaterne af MUC4-udtrykkende bugspytkirtelkræftceller. MAb’er 2175 og 2382 anerkendte fuldlængde MUC4 med en høj molekylvægt, med et band størrelse svarende til den, genkendt af anti-TR MAb 8G7. Forskellen i signalstyrke af de ikke-TR og TR-antistoffer kunne tilskrives antallet af epitoper tilgængelige for MAb til at binde, eftersom 8G7 genkender tandemgentagelsesregionen, som er repræsenteret flere gange i hvert molekyle, mens epitoperne genkendt af 2175 og 2382 er repræsenteret kun én gang pr molekyle. I modsætning hertil Mab 2214 udviste stærk anerkendelse af en proteinbånd på mindre end dem, genkendt af MAb’er 8G7, 2175 og 2382. På trods af deres lavere molekylstørrelse, disse bånd afspejlede allelvariation udvises af fuldlængde MUC4 for de respektive cellelinier , hvilket antyder, at Mab 2214 eventuelt reagerer med en umoden eller underglykosylerede form af MUC4. Meget svage bånd svarende til det højmolekylære modne protein blev stadig detekteret i QGP1 og T3M4. Jo stærkere signalstyrke Mab 2214 med de nederste bånd kan skyldes den overflod af en umoden MUC4 protein i cancercellerne. I cancerceller det er veldokumenteret, at på grund af afvigende og ineffektiv glycosylering, er muciner hypoglykosyleret og disse umodne former kontinuerligt undergår gentagne cyklusser af internalisering, hvilket resulterer i en mere umoden form, end den modne form. Men på-membran deglycosylering (enzymatisk eller kemisk) af løst proteinbånd forstærkede ikke reaktiviteten af ​​Mab 2214 med de modne MUC4 bånd (data ikke vist). Men i paraformadehyde fikserede celler, MAb 2214 udviste den højeste reaktivitet med celleoverfladen. Det umodne protein er usandsynligt, at være til stede på celleoverfladen, og muligvis fiksering af celler med paraformaldehyd udsat MAb 2214 reaktiv epitop. Yderligere karakterisering af den lave molekylvægt form af MUC4 reaktive med MAb 2214 er i gang.

Immunofluorescensanalyse viste specifik farvning for MUC4 i membraner og i de cytoplasmatiske rum af HPAF /CD18-celler. Farvningsmønstret var sammenlignelig med anti TR Mab 8G7 og deres specificitet til MUC4 blev yderligere understøttet af den manglende signal i MUC4 negative celler. Den perinukleære farvning af Mab 2214 støtter yderligere dets reaktivitet det umodne protein.

På grund af sin store størrelse og multi-domæne organisation, kan MUC4 potentielt interagere med mange proteiner og disse interaktioner kan være nøglen til forskellige funktioner tilskrives til MUC4. Dets interaktion med HER2 og den funktionelle betydning af denne interaktion er blevet godt undersøgt [31], [32]. Men der er mange andre potentielle interagerende partnere MUC4, som kunne spille en vigtig rolle i modulering eller mediering MUC4 funktion. MAb’erne 2175 og 2382 var i stand til at immunpræcipitere den MUC4 protein fra cellelysater af HPAF /CD18-celler og kunne derfor bidrage til isolation og identifikation af yderligere MUC4 interagerende partnere. Yderligere, det fremherskende reaktiviteten af ​​MAb 2214 til lavere molekylvægt MUC4 antyder en anden form for MUC4 som sameksisterer med det modne protein. Hvis det i virkeligheden er det den umodne form af proteinet, så MAb 2214 kan potentielt hjælpe ved isoleringen af ​​forskellige hidtil ukendte interagerende partnere, der kan interagere med denne form for MUC4 og optrævle dens funktionelle betydning.

MAb’er 2214, 2175 og 2382 også anerkendt MUC4 udtryk i kræft væv ved immunhistokemisk analyse med reaktiviteten mønster ligner den, der blev observeret med anti-TR Mab 8G7. Ingen af ​​de normale pancreas kanaler blev farvet, hvilket er i overensstemmelse med vores tidligere undersøgelser, der har vist et fravær af MUC4 ekspression i ikke-neoplastiske kanaler. De nye antistoffer kan være nyttige værktøjer til at bekræfte resultaterne fra 8G7, hvilket tyder overekspression af MUC4 i forskellige maligniteter. Yderligere, på grund af den ikke-repetitive karakter af deres reaktive epitop, vil de nyligt udviklede antistoffer mere rimeligt mål for omfanget af overekspression ved ophæve virkningerne af VNTR-polymorfi. Den anti-TR-antistof 8G7 ville imidlertid give større følsomhed for påvisning på grund af flerheden af ​​epitoperne. Således kan kombination af anti-TR og anti-ikke-TR MUC4 antistoffer give bedre information om omfanget af MUC4 overekspression i tumorvæv.

er bestræbelser i gang for at studere de direkte hæmmende virkninger af antistofferne om kræft cellevækst, motilitet og invasion under begge

in vitro

og

in vivo

betingelser. Vore nylige undersøgelser har vist, at MUC4 bidrager til kemoresistens i bugspytkirtelkræftceller ved at aktivere anti-apoptotiske veje og fremme celleoverlevelse [15]. Derfor vil det være af interesse at undersøge virkningen af ​​anti-MUC4 antistoffer i inducere apoptose i cancerceller og forstærke deres følsomhed over for kemoterapeutiske lægemidler. Endvidere disse antistoffer skal også evalueres for deres anvendelighed i radioimmunodiagnosis og radioimmunterapi af MUC4 overekspression tumorer. Funktionelle studier ved hjælp af ikke-tandem repeat MAb’er kan sandsynligvis give en bedre forståelse af MUC4 medierede mekanismer i kræft progression. Disse antistoffer kan også hjælpe med at forstå MUC4 mellem struktur og funktion, regulering af udtryk og eventuelt identificere en sandsynlig interagerende partner på tumoren celleoverfladen, hvilket kan være årsagen til den metastatiske fænotype.

Som konklusion, vores studier indikerer, at MAb’er 2175 og 2382 er meget specifik påvisning af ikke-tandemgentagelsesregionen af ​​mucin MUC4 af forskellige immunoassays. Disse domæne specifikke antistoffer ville tjene som nyttige reagenser til at udvikle kvantitative analyser, og er værdifulde værktøjer til at studere MUC4 mellem struktur og funktion og eventuelt målrette MUC4 til behandling af solide tumorer, der overudtrykker MUC4.

Materialer og metoder

Etik erklæring

anvendelse af dyr til immunisering og isolering af milten blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) protokol # 94-025-12 titlen “monoklonalt antistof Core Facility vaccination protokollen” .

Humane pancreas tumorvæv blev opnået fra University of Nebraska Medical center (UNMC) Tissue Bank og deres anvendelse blev godkendt via UNMC Institutional Review Board (IRB) godkendelse # 491-97-EX.

Fremstilling af rekombinant MUC4 domæner

Regioner af MUC4-α på hver side af TR-domænet blev klonet og udtrykt, og oprensede proteiner blev anvendt som immunogener. Specifikke primere blev designet ved hjælp MUC4 sekvens AJ000281 til at forstærke de fragmenter fra nukleotider 587 til 3361 [MUC4α-Amino Terminal (MUC4α N-ter)] og fra nukleotider 1-1293 [MUC4α-carboxyterminal (MUC4α C-ter), der repræsenterer de regioner umiddelbart opstrøms og nedstrøms for TR-domænet henholdsvis (figur 1a). BamHI og et EcoRI-restriktionssteder blev tilføjet fremad- og bagudrettede primere, henholdsvis tillader i ramme kloning med GST og thrombin kløvningssted er pGEX-2TK-vektoren (Pharmacia). Amplifikation blev udført af udvide lange RT-PCR-system (Roche) som beskrevet tidligere under anvendelse JER103 og JER109 som skabeloner til sekvens AJ00281 og AJ010901 henholdsvis [1]. Konstruktionerne blev sekventeret for at bekræfte den korrekte læseramme og opretholdt i E. coli BL21 (New England Biolabs Inc.). En 5 ml natten over forkultur af hver rekombinant stamme blev anvendt til inokulering 1 liter 2 × YTA medium (16 g trypton, 10 g gærekstrakt og 5 g NaCl i 900 ml deioniseret vand, 100 ug /ml ampicillin), og dyrket under omrøring ved 37 ° C i 3 til 4 timer for at nå en absorbans ved 260 nm mellem 0,6-0,8, induceret med 0,1 mM IPTG og dyrket i en tilsætning af 3 til 4 timer. Kulturer blev centrifugeret og vasket tre gange i iskold PBS, resuspenderet i 5 ml iskold PBS og lydbehandlet. Proteinlysater blev klaret ved centrifugering og ved filtrering på et 0,22 um filter. Lysater blev ført gennem en 5 ml Glutathion Sepharose Fast Flow-søjle (Pharmacia), vasket tre gange med 5 søjlevolumener PBS, og elueret med 10 ml 15 mM reduceret gluthation. Elueringsfraktionerne på 1 ml blev opsamlet, og 5 pi portion af hver fraktion blev opløst på 10% SDS-PAGE, og proteiner påvist ved Coomassie blue-farvning. Fraktioner indeholdende rent GST-fusionsproteiner blev samlet og kvantificeret under anvendelse af Bio-Rad D /C-protein estimation kit (BIO-RAD).

Mus Immunisering

immunisering og udvælgelse af MAb’er blev gennemført ud via de sædvanlige procedurer ved UNMC Antibody Core Facility [17]. Kort fortalt blev separate grupper af mus (BALB /c) immuniseret ved gentagne IP injektioner af rekombinante GST-fusionsproteiner MUC4α-N-Ter og MUC4α-C-Ter med to ugers intervaller. I hver gruppe var immunisering med rekombinant protein vekslede med lysatet af MUC4 positive HPAF /CD18 humane bugspytkirtelkræftceller [17]. Sera fra disse mus blev evalueret i direkte bindingsassays for antistofreaktivitet med den rekombinante MUC4 fusionsprotein, og GST blev anvendt som en negativ kontrol. Når et passende antistof respons blev observeret i ELISA blev dyrene givet en endelig booster-injektion med det rekombinante protein fire dage før afblødning og splenektomi. Splenocytter blev isoleret og fusioneret med NS-1 og /eller Sp2 /0 myelomaceller. Hybridomer der producerer antistofferne af interesse blev udvalgt ved screening for specifik antistofbinding til immunogenet af interesse (rekombinante proteiner og HPAF /CD18 lysat) og manglende binding til irrelevante kontrol antigener (GST og BSA).

Screening for MUC4-positive Hybridomer

Immulon-plader blev overtrukket med 50 pi af det antigene præparat (MUC4 rekombinante proteiner eller GST eller proteinlysater fra MUC4 positive cellelinjer) ved en koncentration på 2,5 ug /brønd i bicarbonatbuffer (pH 9,6 ). Pladerne blev inkuberet natten over ved 4 ° C. Pladerne blev vasket i PBST og de frie bindingssteder af brøndene blev mættet for at fjerne ikke-specifik binding af immunglobulinerne ved inkubering med 200 pl /brønd af 2% fedtfri skummetmælk i PBS i 2 timer ved 37 ° C og pladerne blev vasket i PBST. Et hundrede pi af kultursupernatanten blev overført fra brønde i dyrkningsplader i tilsvarende brønde i ELISA-plader. Muse præimmunserum blev anvendt som en negativ kontrol i hvert assay, inkuberes i 1 time ved 37 ° C, og derefter vaskes pladerne igen i PBST. Et hundrede pi /brønd af peroxidase-konjugeret antistof (anti-muse HRP, Amersham Biosciences, 1:2000 fortynding i PBS) blev tilsat og inkuberet i 1 time ved 37 ° C. Pladerne blev vasket i PBST og 100 pi TMB-substrat (Dako substrat) blev tilsat til hver brønd og inkuberet ved 37 ° C. Reaktionen blev standset ved tilsætning af 100 pi 2 M svovlsyre, og pladerne blev scannet ved 450 nm i en Biotech ELISA-pladelæser.

Immunopræcipitation

Proteinlysater fra MUC4-udtrykkende HPAF /CD18 celler blev immunfældet ved anvendelse af 5 ug /ml 2382, 2214, 2175, 8G7 (anti-TR-antistof), og K2G6 (isotype matchet kontrol MAb reagerer med KLH). Antigen-antistof komplekser dannet blev trukket ned ved anvendelse af Protein A /G beads (Calbiochem) og komplekserne blev solubiliseret ved anvendelse af SDS-prøvebuffer indeholdende 2-mercaptoethanol. Prøverne blev opløst på 2% SDS-agarosegel og blev immunblottet under anvendelse af 8G7.

immunblotting

En række pancreatiske cellelinjer blev forarbejdet til protein ekstraktion og Western blotting under anvendelse af standardprocedurer [17] . Kort beskrevet blev cellerne vasket to gange i PBS og skrabet i radioimmunpræcipitationsanalyse (RIPA) buffer [50 mM Tris, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,25% natriumdeoxycholat; 1% NP40 (pH 7,5)] indeholdende proteasehæmmer blanding (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) og phosphatase-inhibitorer (5 mM NaF og 5 mM Na3VO4; Sigma Chemicals, St. Louis, MO), og holdt ved 4 ° C i mindst 30 minutter.