PLoS ONE: Omfattende biostatistiske Analyse af CpG Island Methylator Fænotype i kolorektal cancer Ved hjælp af en stor befolkning-baseret Sample

Abstrakt

Baggrund

CpG ø methylator fænotype (CIMP) er en tydelig fænotype forbundet med mikrosatellit instabilitet (MSI) og

BRAF

mutation i tyktarmskræft. Nylige undersøgelser har valgt 5 initiativtagere (

CACNA1G

,

IGF2

,

NEUROG1

,

RUNX3

SOCS1

) som surrogatmarkører for CIMP-høj. Imidlertid har ingen undersøgelse omfattende evalueret en udvidet sæt methylering markører (herunder disse 5 markører) ved hjælp af et stort antal tumorer, eller deciphered de komplekse kliniske og molekylære foreninger med CIMP-høj bestemt af den validerede markørpanel.

Metholodology /vigtigste resultater

DNA methylering ved 16 CpG øer [ovenstående 5 plus

CDKN2A

(P16),

CHFR

,

CRABP1

,

HIC1

,

IGFBP3

,

MGMT

, MINT1, MINT31,

MLH1

, P14 (

CDKN2A

/ARF) og

WRN

] blev kvantificeret i 904 tarmkræft ved real-time PCR (MethyLight). I ukontrollerede hierarkisk klyngedannelse analyse, de 5 markører (

CACNA1G

,

IGF2

,

NEUROG1

,

RUNX3

SOCS1

) ,

CDKN2A

,

CRABP1

, MINT31,

MLH1

, P14 og

WRN

blev generelt grupperet med hinanden og med MSI og

BRAF

mutation.

KRAS

mutation blev ikke grupperet med nogen methylering markør, tyder på association med en tilfældig methylering mønster i CIMP-lave tumorer. Udnytte den validerede CIMP markørpanel (herunder de 5 markører), demonstrerede multivariat logistisk regression, at CIMP-høj blev uafhængigt associeret med højere alder, proksimal placering, dårlig differentiering, MSI-høj,

BRAF

mutation, og omvendt med LINE-1 hypometylering og β-catenin (

CTNNB1

) aktivering. Mucinous funktion, signet ring celler, og p53-negativitet var forbundet med CIMP-høj i kun univariat analyse. I stratificerede analyser, relationer CIMP-høj med dårlig differentiering,

KRAS

mutation og LINE-1 hypometylering væsentligt afveg ifølge MSI status.

Konklusioner

Vores undersøgelse giver værdifulde data til standardisering af anvendelsen af ​​CIMP-høj specifikke methylering markører. CIMP-høj er uafhængigt associeret med kliniske og centrale molekylære funktioner i kolorektal cancer. Vore data antyder også, at

KRAS

mutation er relateret med en tilfældig CpG ø metylering mønster, som kan føre til CIMP-lave tumorer

Henvisning:. Nosho K, Irahara N, Shima K, Kure S , Kirkner GJ, Schernhammer ES, et al. (2008) Omfattende biostatistiske Analyse af CpG Island Methylator Fænotype i kolorektal cancer Ved hjælp af en stor befolkning-baseret prøve. PLoS ONE 3 (11): e3698. doi: 10,1371 /journal.pone.0003698

Redaktør: Nils Cordes, Dresden Teknologiske Universitet, Tyskland

Modtaget: Juni 11, 2008; Accepteret: 24 oktober 2008; Udgivet: November 12, 2008

Copyright: © 2008 Nosho et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af amerikanske National Institute of Health (NIH) giver P01 CA87969, P01 CA55075, P50 CA127003 og K07 CA122826 (til SO), og dels af tilskud fra Bennett Familie fonden og fra Entertainment Industry Foundation (EIF) gennem EIF National Kolorektal Cancer Research Alliance (NCCRA). K.N. blev støttet af et stipendium tilskud fra den japanske Society for Fremme af Science. Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter NCI eller NIH. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Epigenetisk afvigelser er vigtige mekanismer i human carcinogenese [1], [2]. Et antal tumorsuppressorgener er tavse af promotor CpG ø metylering [3], [4]. En undergruppe af kolorektale cancere udviser udbredt promotor methylering, som omtales som CpG island methylator fænotype (CIMP) [4] – [7]. CIMP-høje kolorektale tumorer har været forbundet med ældre alder, kvindelige køn, proksimal placering, mucinøs og dårlig differentiering, mikrosatellit instabilitet (MSI),

BRAF

mutation, høj LINE-1 methylering niveau, vildtype

TP53

, stabile kromosomer, og inaktive WNT /β-catenin [8] – [23]. Men mange af disse funktioner er indbyrdes forbundne, og dermed er det vigtigt at analysere et stort antal tumorer ved flerdimensional analyse til at dechifrere de komplekse forhold mellem CIMP-høj og disse kliniske /tumorale variable.

Der er betydelig heterogenitet af tumorer med hensyn til CpG ø metylering, og ikke alle CpG-øer er methyleret på en lignende måde i colorektal cancer [15]. Således kan valg af CpG-øer i det væsentlige påvirke funktionerne i CIMP. Faktisk har forskellige CIMP paneler, der anvendes i forskellige undersøgelser forårsagede betydelig forvirring [7]. Weisenberger et al. [15] har screenet 195 CpG øer, og valgt fem loci (

CACNA1G

,

IGF2

,

NEUROG1

,

RUNX3

SOCS1

), som kan tjene som surrogatmarkører for CIMP-høj. Vi har yderligere valideret brugen af ​​8 markører (ovenstående 5 plus

CDKN2A

(p16),

CRABP1

og

MLH1

) som en CIMP-høj diagnostisk panel [24 ]. Imidlertid har ingen undersøgelse omfattende sammenligning disse CIMP-high-specifikke CpG øer og andre CpG øer ved hjælp af et stort antal tumorer.

I denne undersøgelse har vi vurderet 16 CpG øer, herunder den nye 5 CIMP markører samt som MINT (methyleret i tumor) markører og andre CpG øer, udnytte hierarkisk klyngedannelse analyse på et stort antal tarmkræft. Vi har også vurderet de særlige kendetegn ved CIMP-høje tumorer bestemt ved en valideret markør panel, og samspillet mellem forskellige kliniske og tumorale faktorer ved multivariat logistisk regressionsanalyse. Denne undersøgelse giver rationalet for standardisering af CIMP-high-specifikke methylering markører

Metoder

Study Group

Vi udnyttet databaser to store prospektive kohortestudier.; Nurses ‘Health Study (NHS, N = 121,700 kvinder fulgt siden 1976) [25], [26], og Health Professionals Follow-up Study (HPFS, N = 51.500 mænd fulgt siden 1986) [26]. En undergruppe af kohorte deltagere udviklede kolorektal kræft i løbet af potentielle opfølgning. Disse tarmkræft repræsenterede således en befolkning-baseret, relativt fordomsfri prøve (sammenlignet med en enkelt eller nogle få-hospital-baseret prøve). Tidligere undersøgelser af kohorter har beskrevet baseline karakteristika kohorte deltagere og hændelser kolorektal kræfttilfælde, og bekræftede, at vores tarmkræft var godt repræsentativt som en population-baserede prøve [25], [26]. Klinisk oplysninger blev opnået gennem diagrammet gennemgang af læger. Vi indsamlede paraffinindlejrede væv blokke fra hospitaler, hvor deltagerne havde undergået resektioner af primære kolorektal kræft. Baseret på tilgængeligheden af ​​tilstrækkelige vævsprøver, blev i alt 904 kolorektal kræfttilfælde (406 fra mændenes kohorte og 498 fra kvindernes kohorte) inkluderet. Kliniske kendetegn for de tilfælde er beskrevet i tabel 1 (til venstre, under kolonneoverskriften “Alle sager”). Blandt vores kohortestudier, var der ingen signifikant forskel i de demografiske træk mellem sager med væv til rådighed, og de uden tilgængelige væv [26]. De fleste tumorer er tidligere blevet karakteriseret for status for MSI, CIMP,

KRAS

,

BRAF

, p53, β-catenin, LINE-1 methylering og 14 i methylering markører 16 [19], [21], [24], [27]. Imidlertid har ingen af ​​vores tidligere undersøgelser omfattende analyseret 16 methylering markører i forhold til hinanden, uafhængige sammenslutninger af CIMP med forskellige kliniske, patologiske eller svulstsygdomme molekylære karakteristika, eller interaktioner af forskellige faktorer på foreninger med CIMP-høj af omfattende biostatistiske metoder . Denne undersøgelse repræsenterer en unik roman undersøgelse på sigt af 1) en stor stikprøve; 2) den validerede sæt CIMP-specifikke methylering markører; 3) antallet af andre molekylære begivenheder analyseres, herunder 8 andre end CIMP-specifikke markører, MSI,

KRAS

,

BRAF

, p53, LINE-1 methylering og β-catenin CpG øer ; og 4) omfattende statistiske analyser, herunder opsyn hierarkisk klyngedannelse, udglatning splines til at vurdere ikke-linearitet, multivariat logistisk regression, og stratificeret logistisk regression. Denne undersøgelse opnåede hidtil ukendte data fra de eksisterende materialer og database, der er analoge med hidtil ukendte undersøgelser under anvendelse af de velbeskrevne cellelinier eller musemodeller. Informeret samtykke blev opnået fra alle forsøgspersoner. Tissue indsamling og analyser blev godkendt af Harvard School of Public Health og Brigham og kvinders Hospital Institutional Review Boards.

Patologisk Undersøgelse, DNA Udvinding og Sekventering af

KRAS

BRAF

For alle tilfælde, patologiske funktioner, herunder tumor differentiering, mucinøse funktioner og signetring celler blev undersøgt af en patolog (SO). Dårlig differentiering blev defineret som tilstedeværelse af 50% glandulær område. Genomisk DNA blev ekstraheret fra paraffin væv, og PCR og Pyrosequencing målrettet til

KRAS

kodoner 12 og 13, og

BRAF

codon 600 blev udført som tidligere beskrevet [28], [29].

mikrosatelitter ustabilitet (MSI) Analyse

MSI status blev bestemt af MSI panelet herunder D2S123, D5S346, D17S250, BAT25, BAT26, BAT40, D18S55, D18S56, D18S67 og D18S487 (dvs. 10- markørpanel) som tidligere beskrevet [24]. En “høj grad af MSI” (MSI-høj) blev defineret som tilstedeværelsen af ​​ustabilitet i ≥30% af markørerne.

Real-time PCR (MethyLight) for Kvantitativ DNA-methylering Analyse

Natriumbisulfit behandling på DNA og efterfølgende real-time PCR (MethyLight [30]) blev valideret og udført som tidligere beskrevet [31]. Vi kvantificeret DNA methylering i 5 CIMP-promotorer (

CACNA1G

,

IGF2

,

NEUROG1

,

RUNX3

SOCS1

) og 11 andre CpG øer [

CDKN2A

(p16),

CHFR

,

CRABP1

,

HIC1

,

IGFBP3

,

MGMT

, MINT1, MINT31,

MLH1

, P14 (

CDKN2A

/ARF), og

WRN

].

COL2A1

(collagen 2A1-genet) blev anvendt til at normalisere for mængden af ​​template med bisulfit omdannet DNA [31]. Primere og prober blev beskrevet tidligere [15], [27], bortset fra

IGFBP3

, P14 og

WRN

: IGFBP3-F, 5′-G

T

T

T

CG GGC GTG AG

T

ACG A-3 ‘(Genbank nr M35878, nukleotid nr 1692-1710.); IGFBP3-R, G

AA

TCG

A

CG CA

En

A

CA CG

A

CT

A

C (nukleotid nr. 1789-1810) og IGFBP3-sonde, 6FAM-

T

CG G

T

TG

T

T

T

AG GGC GAA GTA CGG G-BHQ-1 (nukleotid nr 1760-1784.) (bisulfit-konverterede nukleotider er fremhævet med fed og kursiv); P14 (CDKN2A /ARF) -F, 5′

T

TG GAG GCG GCG AGA A

T

En T-3 ‘(Genbank nr L41934, nukleotid nr. 238-256) ; P14-R, 5’CCC CGT

A

En

A

CCG CG

En

A

AT

A

3 ‘(nukleotid nr 332 til 350.); P14-sonde, 6FAM-5’CGG

TT

C G

T

C GCG AGT GAG GGT T-3 ‘-BHQ-1 (nukleotid nr 299-320.); WRN-F, 5’-G

T

En TCG

TT

C GCG GCG

TTT

En

T

-3 «(Genbank nr AY442327 , nukleotid nr 1827-1846).; WRN-R, 5 ‘-

A

CG

AAA

CCG

A

T

A

TCC GAA

A

TC A – 3 ‘(nukleotid nr. 1887-1908) og WRN-sonde, 6FAM-

TTT

T

T

T

T

TG CGG

T

CG

T

TG CGG G-BHQ- (nukleotid nr. 1855-1876). PCR betingelse var indledende denaturering ved 95 ° C i 10 minutter efterfulgt af 45 cykler af 95 ° C i 15 sek og 60 ° C i 1 min. En standardkurve blev fremstillet for hver PCR-plade af duplikerede PCR-amplifikationer til

COL2A1

på bisulfit omdannet humant genomisk DNA ved 4 forskellige koncentrationer (i en 5 gange fortyndingsserie). Procentdelen af ​​methyleret reference (PMR, dvs. grad af methylering) ved et specifikt locus blev beregnet ved at dividere

GENE: COL2A1

forholdet mellem template beløb i en prøve ved den

GENE: COL2A1

forholdet mellem skabelon beløb i

Sss

i-behandlet humant genomisk DNA (formentlig fuldt methylerede) og multiplicere denne værdi med 100. Methylering positivitet blev indstillet som PMR≥4 som tidligere valideret [31].

Pyrosequencing at måle LINE-1 Methylering

for at præcist at kvantificere relativt høje LINE-1 methylering niveauer vi udnyttet Pyrosequencing som beskrevet tidligere [21]. LINE-1 methylering niveau målt ved Pyrosekventering er blevet vist at korrelere godt med samlede 5-methylcytosin (dvs., hele genomet DNA-methylering niveau) i tumorceller [32], [33].

Immunhistokemi for p53 og β-catenin

Tissue microarrays (TMAS) blev konstrueret og immunhistokemi for p53 og β-catenin blev udført som tidligere beskrevet [19], [34]. Passende positive og negative kontroller blev inkluderet i hver kørsel af immunhistokemi. Cytoplasmatisk og nuklear β-catenin udtryk blev indspillet separat som enten ingen udtryk (0), svag udtryk (1+), eller moderat /stærkt udtryk (2+). Den β-catenin aktivering score blev beregnet som summen af ​​nuklear score (0-2), cytoplasmatisk score (0-2) og membran score (0 hvis membranfarvning var positiv, +1, hvis membran-ekspression var tabt), som oprindeligt beskrevet ved Jass et al. [35]. Alle immunhistokemisk-farvede objektglas blev undersøgt af en af ​​investigator (β-catenin ved K.N .; p53 ved S. O.) uvidende om andre data. Tilfældige prøver af 402 og 118 tumorer blev fornyet overvejelse for β-catenin og p53 henholdsvis af en anden observatør (β-catenin ved SO, p53 af KN) uvidende om andre data, og de konkordanser mellem de to observatører var 0,83 for β-catenin (κ = 0,65, p 0,0001), og 0,87 for p53 (κ = 0,75, p 0,0001)., hvilket indikerer en betydelig aftale

Statistisk analyse

for cluster analyse af biomarkører herunder de 16 methylering markører, MSI,

KRAS

BRAF

, vi udnyttet gennemsnitlige sammenkædning hierarkisk klyngedannelse med en euklidisk afstand metrisk som implementeret i MeV (https://www.tm4.org) [36]. Den chi i anden-test blev anvendt til at undersøge en sammenhæng mellem CIMP og andre kategoriske variabler af interesse. T-testen under antagelse ulige varianser blev udført for at sammenligne gennemsnitsalder og betyder LINE-1 methylering niveau. Den κ koefficient blev beregnet til at vurdere overensstemmelse mellem hver af de 16 markører (positive vs negative) og 16-markør CIMP panel (CIMP-høj positiv vs. negativ).

For at undersøge forholdet i en given variabel og CIMP-høj, vi udnyttet ubetingede logistiske regressionsmodeller til beregning odds ratio (OR) for CIMP-høj, ifølge status for den given variabel, ukorrigeret og korrigeret for alder, køn, tumor placering, fase, differentiering, LINE- 1 methylering niveau, og status for MSI,

KRAS

,

BRAF

, p53 og β-catenin. For at justere for potentiel confounding, alder og LINE-1 methylering niveau blev brugt som kontinuerte variable, og alle de andre variabler blev brugt som kategoriske variable.

For alder og LINE-1, vi vurderede ikke-linearitet ved sandsynligheden for kvotientkriteriet at sammenlignet en regressionsmodel med en kvadratisk (eller kubisk) udtryk med en model, eksklusive det. Sandsynligheden kvotientkriteriet viste, herunder den kvadratiske udtryk ikke signifikant ændrer model fit (p = 0,86 for alder, p = 0,078 for LINE-1), og at også den kubiske sigt ikke væsentligt ændrer model fit (p = 0,87 for alder , p = 0,084 for LINE-1). Vi undersøgte også muligheden for en ikke-lineær sammenhæng mellem alder (eller LINE-1 methylering) og CIMP-høj, ikke-parametrisk med begrænsede kubiske splines [37].

Vi dikotomiseret tumor placering (proksimal vs. distal), tumor differentiering (dårlig vs. godt /moderat), signet ring celler (nuværende vs fraværende), MSI (høj vs. ikke-MSI-høj), p53 (positiv vs. negativ),

KRAS

(muteret vs. vildtype),

BRAF

(muteret vs. vildtype) og β-catenin (aktiv vs. inaktiv). Der var 3 kategorier for mucinøs funktion (0%, 1-49%, og ≥50%) i den oprindelige primære analyse (tabel 2). Vi dikotomiseret mucinøs træk (til stede vs. fraværende) i sekundære stratificeret analyser og analyser af interaktioner, fordi multivariable yderste periferi for CIMP-høj var ens på tværs af 1-49% mucinøs og ≥50% mucinøse kategorier (i forhold til den ikke-mucinøs kategori ). Der var 4 kategorier for trin (I, II, III og IV) i den indledende main analyse (tabel 2). Vi dikotomiseret tumor stadie (jeg vs. II-IV) i sekundære stratificeret analyser og analyser af interaktioner, fordi multivariable yderste periferi for CIMP-høj var ens på tværs stadie II-IV (med henvisning til fase I).

Når der var manglende oplysninger om tumor stadie (12%), LINE-1 (3,9% mangler), MSI (3,2% mangler), p53 (1,3% mangler),

KRAS Hotel (2,3% mangler) eller

BRAF

(4,7% mangler), vi tildelt en separat ( “mangler”) indikator variabel og omfattede de tilfælde i de multivariate analysemodeller. Vi bekræftede, at udelukke sager med en manglende variabel ikke væsentligt ændrer resultater (data ikke vist). Der var ingen manglende oplysninger i andre variabler

En sammenslutning af hver variabel med CIMP-høj blev også vurderet i lag af vigtige kliniske eller molekylære funktioner, herunder alder ( . 65 år gammel vs. ≥65 år gammel ), køn, tumor placering (proksimal vs. distal), MSI-status, og

BRAF

status. For stratificeret analyse, hver multivariat logistisk regressionsmodel inkluderet en variabel af interesse, der blev stratificeret ved en given stratificering variabel (fx alder) og indstilles til alle de resterende variabler (SAS koder kan rekvireres).

An interaktion blev vurderet ved at inkludere krydsproduktet løbetid en given variabel (fx MSI) og en anden variabel af interesse i en regressionsmodel, og sandsynligheden kvotientkriteriet sammenlignet en model herunder krydsproduktet sigt med at udelukke det. Ud over interaktioner af en given variabel med MSI, beliggenhed, alder, køn og

BRAF

, vi undersøgte alle mulige resterende to-vejs interaktioner, og fandt ingen signifikante interaktioner (data ikke vist).

Alle statistiske analyser undtagen clustering analyse anvendte SAS-version 9.1 (SAS Institute, Cary, NC). Alle p-værdier var tosidet, og statistisk signifikans blev defineret som p ≤ 0,05. Ikke desto mindre blev flere hypoteser testning overvejes ved fortolkning af data, især i at undersøge flere to-vejs interaktioner.

Resultater

Evaluering af 16 methylering markører

Vi opnåede 904 kolorektal cancer prøver og kvantificeret DNA methylering i de 16 loci [

CACNA1G

,

IGF2

,

NEUROG1

,

RUNX3

,

SOCS1

,

CDKN2A

(p16),

CRABP1

,

MLH1

,

CHFR

,

HIC1

,

IGFBP3

,

MGMT

, MINT1, MINT31, P14 (

CDKN2A

/ARF), og

WRN

] af real-time PCR (MethyLight 30] [) analyser. De første 5 loci (op til

SOCS1

) blev udvalgt som gode indikatorer for CIMP (CpG ø methylator fænotype) ved screening af 195 CpG øer [15]. Brugen af ​​den første 8 loci (op til

MLH1

) som en CIMP-høj diagnostisk panel tidligere er blevet valideret [24].

For at evaluere 16 methylering markører i en fordomsfri måde, vi gennemført en uovervåget hierarkisk klyngedannelse analyse af de 16 methylering markører og status MSI (mikrosatellit ustabilitet), og

KRAS

BRAF

onkogener, der bruger 860 tumorer med alle disse resultater til rådighed (figur 1 ). De 8 CIMP-høje markører (

CACNA1G

,

CDKN2A

(p16),

CRABP1

,

IGF2

,

MLH1

,

NEUROG1

,

RUNX3

SOCS1

) blev generelt grupperet sammen, hvilket indikerer god overensstemmelse af methylering mønstre i disse markører og støtte disse 8 markører som gode CIMP-høje markører. Desuden P14, MINT31 og

WRN

blev også grupperet med de 8 markører. De øvrige 5 methylering markører (

MGMT

,

HIC1

,

CHFR

, MINT1 og

IGFBP3

) ikke grupperet tæt sammen med hinanden eller 8 markører.

BRAF

og MSI variabler, som har været kendt for at være forbundet med CIMP-høj [15], [18], [24], blev også grupperet sammen med disse 8 markører, hvilket indikerer stramme foreninger med CIMP- høj. Især

KRAS

mutation blev ikke grupperet med nogen af ​​methylering markører, tyder association med en tilfældig methyleringsmønster (især i CIMP-low tumorer, som har været forbundet med

KRAS

mutation [29 ]; se også Supplemental Figur S1). Vi brugte clustering analyse kun til undersøgelse af markør klyngedannelse, men ikke for tumor klassificering. Det var fordi gruppering af markører var meget stabil med det store antal af tumorer (dvs. eksklusive nogle tumorer ikke væsentligt påvirke resultater), mens tumor klassificering ved clustering analyse baseret på de 16 markører ikke var stabil.

Vandret og lodrette akse repræsenterer markører og sager, hhv. Den udvidede syn på klyngedannelse træ for markørerne er vist til højre. De 8 markører i vores CIMP-høj diagnostisk panel (

CACNA1G

,

IGF2

,

RUNX3

,

MLH1

,

SOCS1

,

CDKN2A

(p16),

CRABP1

og

NEUROG1

) er grupperet tæt, at støtte, at disse markører er gode CIMP-høje markører. Bemærk også det tætte forhold mellem MSI,

BRAF

og 8 CIMP-høje markører.

KRAS

mutation ikke grupperet med nogen af ​​methylering markører analyseres, hvilket antyder, at

KRAS

mutation (som er associeret med CIMP-low [24], [29], se Supplemental figur) er sandsynligvis forbundet med en tilfældig methylering mønster.

for at beskrive udførelsen af ​​hver af de 16 markører på en fordomsfri måde, vi beregnede κ koefficient (for aftale statistik), sensitivitet og specificitet af hver maker for CIMP- høj diagnose bestemmes af de 16 markører (Supplemental tabel S1). Cutoff for CIMP-høj blev sat som ≥11 /16 eller ≥ 10/16 denatureret markører baseret på fordelingen af ​​

KRAS

BRAF

mutationer (Supplerende figur), og på den foregående fund, CIMP-høj er forbundet med

BRAF

mutation og CIMP-low er forbundet med

KRAS

mutation [24], [29]. Følsomhed og specificitet af hver markør afspejlede overordnet overensstemmelsen mellem et methylering mønster med de resterende 15 markører. Det var tydeligt, at udførelsen af ​​de 8 CIMP-panel markører (

CACNA1G

,

CDKN2A

,

CRABP1

,

IGF2

,

MLH1

,

NEUROG1

,

RUNX3

SOCS1

) var generelt god. Den κ koefficient var større end 0,5 for alle disse 8 markører.

RUNX3

var enkelt bedste markør for CIMP-høj diagnose. Blandt de øvrige 8 markører (

CHFR

,

HIC1

,

IGFBP3

,

MGMT

, MINT1, MINT31, P14 og

WRN

), kun MINT31 og P14 konsekvent viste κ koefficient større end 0,5, og god følsomhed /specificitet. Dette var i overensstemmelse med clustering analyse, som viste, at MINT31 og P14 grupperet med de 8 CIMP-panel markører.

Vi sammenlignede også all-16-markør panel med 8-markør CIMP panel. Brug af 8-maker panel, eller 16-maker panel blev CIMP-høj defineret som ≥ 6. /8 eller ≥11 /16 denatureret markører hhv. Blandt de 904 sager, 879 sager (97,2%) viste overensstemmende diagnose af CIMP status mellem 16-markør panel og den 8-markør panel (κ = 0,89, p 0,0001). Hvornår blev anvendt 16-markør CIMP panel, sammenslutningerne af CIMP-høj med kliniske og molekylære funktioner var meget lig de CIMP-høje foreninger ved 8-markør CIMP panel (data ikke vist). Vi bekræftede også en høj grad af enighed (98,6% overensstemmende; κ = 0,94) mellem 8-markør panel og den 5-markørpanel beskrevet af Weisenberger et al. [15]. I efterfølgende analyser, brugte vi Således 8-markør CIMP panel, som vi udførligt havde valideret [24].

CIMP-høj i kolorektal cancer

Vi vurderede klinisk, patologisk og molekylære funktioner i CIMP-høj kolorektal cancer (tabel 1). Ved univariat analyse blev CIMP-høj forbundet med kvindelige køn, alder, proksimal placering, dårlig differentiering, mucin, signet ring celler, MSI-høj og

BRAF

mutation, og omvendt med fase I,

KRAS

mutation, LINE-1 hypometylering, positiv p53, og aktiv β-catenin (alle p 0,004).

Alder blev lineært forbundet med CIMP-høj i logistisk regressionsanalyse (p for trend 0,0001). Vi viste ikke signifikant ikke-linearitet af sandsynligheden for kvotientkriteriet at sammenlignet en model, herunder en kvadratisk (eller kubisk) udtryk med en model udelukke det (p 0,85). Ligeledes blev LINE-1 hypometylering omvendt lineært forbundet med CIMP-høj (p for trend 0,0001), og der var ingen signifikant ulinearitet af likelihood ratio test under anvendelse en kvadratisk (eller kubisk) sigt (p≥0.078) . Ikke-parametriske begrænset kubiske splines støttede også en lineær relation mellem alder og CIMP-høj (figur 2) og en invers lineær sammenhæng mellem LINE-1 hypometylering og CIMP-høj (figur 3).

Log

e (OR for CIMP-høj) vises (y-akse) i henhold til alder (x-aksen) (med unge alder som en referent). Brudte linjer angiver 95% konfidensinterval. Bemærk den lineære relation mellem alder og CIMP-høj. CIMP, CpG island methylator fænotype; OR, odds ratio.

Log

e (OR for CIMP-høj) (y-aksen) i henhold til LINE-1 methylering (x-aksen) er vist (med højt niveau LINE-1 methylering som en referent). Brudte linjer angiver 95% konfidensinterval. Bemærk den omvendte lineær sammenhæng mellem LINE-1 hypometylering og CIMP-høj. CIMP, CpG island methylator fænotype; LINE-1, længe afbrudt nukleotid element-1; OR, odds ratio.

I multivariat logistisk regressionsanalyse, CIMP-høj var signifikant forbundet med højere alder, proksimal placering, dårlig differentiering, MSI-høj og

BRAF

mutation, og omvendt med aktiv β-catenin og LINE-1 hypometylering (tabel 2). Men alle de andre funktioner (kvindelig, scene, mucin, signet ring celler,

KRAS

og p53) blev ikke længere signifikant associeret med CIMP-høj i multivariat analyse. Vi yderligere undersøgt for mulige konfoundere i foreningen af ​​hver variabel med CIMP-høj. Bortset fra sex, alle de andre variabler viste betydelige ændringer i odds ratio (OR) for foreningen med CIMP-høj efter justering for MSI,

BRAF

og /eller tumor placering (eller andre variabler) (Tabel 2 ). Disse resultater viste, at der findes komplekse forhold mellem kliniske og molekylære funktioner (herunder CIMP) i kolorektal cancer, som er opsummeret i figur 4.

Den stiplede linje angiver den relativt svage forening.

Foreninger med CIMP-høj i lag af MSI

Molekylær klassifikation af MSI status er stadig vigtigere i kolorektal cancer [38] – [40]. Således har vi undersøgt forholdet af kliniske og tumorale variable med CIMP-high i MSI-høje tumorer og ikke-MSI-høje tumorer (tabel 3). Ældre alder, proksimal placering og

BRAF

mutation var signifikant forbundet med CIMP-høj i begge MSI-høje og ikke-MSI-høje tumorer. I modsætning hertil relationer CIMP-høj med dårlig differentiering,

KRAS

mutation og LINE-1 hypometylering syntes at være forskellige i henhold til MSI status (p for interaktion 0,005). CIMP-high blev forbundet med dårlig differentiering og omvendt med

KRAS

mutation i MSI-høje tumorer, men ikke i ikke-MSI-høje tumorer. LINE-1 hypometylering blev omvendt forbundet med CIMP-høj i ikke-MSI-høje tumorer, men ikke i MSI-høje tumorer.

Foreninger med CIMP-høj i lag af tumor placering

Der er akkumulerende evidens for en molekylær forskel mellem proksimale og distale kolorektal kræft [38], [41]. Derfor undersøgte vi, forholdet af kliniske og tumorale variable med CIMP-høj i proksimale tumorer og distale tumorer (tabel 4). De relationer CIMP-høj med variablerne ikke syntes at variere alt efter tumor placering (alle p til interaktion 0,23).

Foreninger med CIMP-høj i andre lagdelt analyser

Vi undersøgte forholdet af kliniske og tumorale variable med CIMP-høj i lag af køn, alder ( 65 år gammel vs. ≥65 år gamle) og

BRAF

status. I betragtning af flere hypoteser test (12-hypoteser test hver), har effekten af ​​variablerne ikke at afvige væsentligt efter alder (alle p til interaktion 0,03) og køn (alle p til interaktion 0,02). Især har effekten af ​​LINE-1 hypometylering synes at variere alt efter

BRAF

status (p for interaktion = 0,001) (tabel 5). En væsentlig omvendt sammenhæng af LINE-1 hypometylering med CIMP-høj var til stede i

BRAF

-mutated tumorer [justeres eller = 0,022; 95% konfidensinterval (CI), 0,003 til 0,17], men ikke i

BRAF

-Wild-type tumorer (justeret OR = 0,87; 95% CI, 0,25-3,06)

Vi undersøgte også alle de resterende potentielle to-vejs interaktioner af de tilgængelige kliniske og tumorale variabler, og fandt ingen signifikante interaktioner med hensyn til foreninger med CIMP-høj (data ikke vist).

diskussion

i denne undersøgelse udnytte en stor stikprøve, vi evalueret 16 methylering beslutningstagere i en fordomsfri måde. De 16 methylering markører inkluderet de 5 markører (

CACNA1G

,

IGF2

,

NEUROG1

,

RUNX3

SOCS1

), som blev udvalgt ved screening af 195 CpG-øer [15] og yderligere valideret som skal indgå i den CIMP-høj diagnostisk panel (ovenstående 5 plus

CDKN2A

,

CRABP1

og

MLH1

) [24]. Ved ukontrollerede hierarkisk clustering analyse blev de 5 methylering markører grupperet med hinanden samt med MSI (mikrosatellit instabilitet) og

BRAF

mutation. Analyse af κ koefficient, sensitivitet og specificitet viste også gode præstationer af de 5 methylering markører med generelt overensstemmende methylering mønster. Udnytte den validerede CIMP panelet, har vi tydet de komplekse relationer CIMP-høj med forskellige kliniske, patologiske og molekylære funktioner i kolorektal cancer. Vores data giver et rationale for den validerede CIMP-specifikke methylering markørpanel.

Denne undersøgelse er den første omfattende undersøgelse for at sammenligne de 5 nye CIMP høje markører [15] med MINT1, MINT31 og andre CpG øer ved hjælp af en stor stikprøve. Udførelse af de 5 nye markører (

CACNA1G

,

IGF2

,

NEUROG1

,

RUNX3

, og

SOCS1

), <