PLoS ONE: Samspillet mellem c-jun og Androgen receptor Bestemmer Resultat af taxanbehandling i kastrationsresistent Prostata Cancer

Abstrakt

taxan kemoterapi er standarden for pleje behandling i kastrationsresistent prostatacancer (CRPC). Der er overbevisende dokumentation for, at taxanbehandling påvirker androgen receptor (AR), men de nøjagtige mekanismer er at blive yderligere belyst. Vores undersøgelser identificeret c-jun som et afgørende nøglespiller som interagerer med AR og dermed bestemmer udfaldet af taxan terapi givet. Docetaxel (dok) og paclitaxel (Pac) agenter viste forskellige virkninger på LNCaP og LNb4 fremgår af ændring i protein og mRNA-niveauer af c-jun, AR og PSA. Docetaxel-induceret phosphorylering af c-jun skete før JNK phosphorylering hvilket antyder, at c-jun-phosphorylering er uafhængig af JNK pathways i prostatacancerceller. En xenograft undersøgelse viste, at mus behandlet med Pac og bicalutamid viste dårligere resultat understøtter vores hypotese, at opregulering af c-jun kan virke som en potent antiapoptotisk faktor. Vi observerede i vores in vitro-undersøgelser en omvendt regulering af PSA- og AR-mRNA-niveauer i Doc behandlet LNb4 celler. Dette blev også set for kallikrein 2 (KLK 2), som fulgte det samme mønster. I betragtning af, at respons på taxanbehandling måles ved PSA fald vi nødt til at overveje, at dette ikke afspejler den sande aktivitet AR i CRPC patienter

Henvisning:. Tinzl M, Chen B, Chen SY, Semenas J , Abrahamsson PA, Dizeyi N (2013) Interaktion mellem c-jun og Androgen receptor Bestemmer Resultat af taxanbehandling i kastrationsresistent prostatakræft. PLoS ONE 8 (11): e79573. doi: 10,1371 /journal.pone.0079573

Redaktør: Elad Katz, AMS Biotechnology, England

Modtaget: April 12, 2013; Accepteret: September 25, 2013; Udgivet: November 8, 2013 |

Copyright: © 2013 Tinzl et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette projekt er finansieret af Sandbergs privat finansiering, Percy Falk Foundation og Malmö kræft finansiering. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

De behandlingsmuligheder for patienter med kastrationsresistent prostatacancer (CRPC) er stadig begrænsede. Selvom nye lovende stoffer som CYP17A1 inhibitor arbiraterone og MDV3100 er kommet på markedet, er taxan kemoterapi stadig betragtes verden over den vigtigste hjørnesten i behandling, når androgen deprivation terapi (ADT) har undladt [1-4]. Ud over de klassiske taxaner, docetaxel og paclitaxel er Cabazitaxel anvendes som kemoterapeutisk middel til behandling af CRPC patienter, sidstnævnte primært til behandling af patienter med Doc resistent sygdom [5].

Taxaner standser celler i G2-M fase ved hyperstabilization af mikrotubuli hvilket fik cellerne til celledød [6]. Udover dette godt beskrevet virkning i tumorceller der er overbevisende dokumentation for, at taxanbehandling også interfererer med androgen receptor (AR) i prostatacancerceller [7-11]. Vores gruppe har identificeret c-jun som en vigtig nøglespiller i dette samspil mellem AR og taxaner som påvirker resultatet af behandlingen i kastrationsresistent status prostata kræftceller.

Transskription faktor c-jun er en prototype onkogen og hører til AP-1-familien, som består af jun, fos og ATF-2 underfamilier [12,13]. AP-1-proteiner homo- eller heterodimerisere før binding til deres DNA målstedet. AP-1-proteiner er multifunktionelle og er involveret i regulering stress svarsignaler, cellevækst og apoptose [12]. Alligevel er der data, der kraftigt antyder, at c-jun er en vækstfremmer og proto-onkogen [14,15]. Shemshedini og kolleger har vist, at, svarende til hvad observeres med andre AR coaktivatorer, kan c-jun mediere AR N-to-C interaktion kan forbedre DNA-binding [16,17]. Endvidere er phosphoryleret c-jun ofte overudtrykt i humane cancere [18,19] og er blevet forbundet med invasive egenskaber af prostata og brystkræft [18,20,21]. forbliver dog rolle c-jun-aktivering og mulig interaktion med AR i cellen skæbne efter udsættelse for Doc er en del af et komplekst netværk, og at blive belyst. Denne undersøgelse blev udført for at undersøge konsekvensen af ​​interaktion mellem c-jun og AR i taxan behandling af kastrationsresistent prostatacancerceller. For at optimere effekten af ​​kemoterapi med taxaner vi har brug for at identificere et specifikt molekyle eller sti, som kan give svar eller modstand. I nærværende undersøgelse søgte vi at undersøge effekten af ​​taxaner som enkeltstof eller i kombination med bicalutamid på AR og dets cofaktor c-jun

in vitro

in vivo

.

Materialer og metoder Salg

Cellelinier og reagenser

human prostatacancer-cellelinier LNCaP og PC-3 blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassass, VA ). LNb4 celler blev dannet i vores laboratorium fra LNCaP-celler udsat for bicalutamid (5 uM i serum reduceret til 5%). Celler blev dyrket i RPMI (LNCaP) og Hams-F12 (PC-3) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin (Life Technologies, Paisley, UK). Cellerne blev behandlet med docetaxel (Taxotere®, Sanofi Aventis) og Paclitaxel (Paclitaxel®, Actavis, Hafnarfjordeur, Island) i den anførte i hver figur koncentration. Dihydrotestosteron (DHT) blev købt fra Steraloids Inc. (Newport, RI) og bicalutamid fra AstraZeneca (London, UK). Alle Western blot reagenser blev købt hos Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) bortset JNK inhibitor XIV SR 3306 (Calbiochem, Darmstadt, Tyskland).

Transfektion og lille interfererende RNA (siRNA)

Forbigående transfektioner med c-jun, c-jun mutant (c-jun Ala63 /73) og AR plasmider (alle venligst stillet til rådighed af Shao-Yong Chen, Harvard Medical School) i PC-3 prostatacancerceller blev udført ved hjælp af FuGENE 6 (Roche Diagnostics , Mannheim, Tyskland) som anbefalet af producenten. C-Jun-mutant (c-Jun Ala63 /73), heri omtalt som Juna, anvendes til forsøg bærer en mutation ved den serinbindingsted 63/73 (Ala63 /73), som er hovedmålet for phosphorylering ved stress stimuli. For siRNA eksperimenter blev PC-3 og LNCaP-celler transficeret i 48 timer med 100 nM siRNA c-jun eller ikke-targeting siRNA (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA). Transfektion blev udført ved hjælp af X-tremeGENE siRNA transfektionsreagens (Roche Diagnostics) i henhold til fabrikanter instruktion.

spredning

Cell levedygtighed blev defineret ved trypanblåteksklusion (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). PC-3, blev LNCaP og LNb4 celler podet i 24-brønds plader ved en densitet på 25.000 celler per brønd. Efter 24 og 48 timers behandling med Doc eller DMSO (Sigma-Aldrich) ved de angivne koncentrationer flydende og vedhæftede celler blev opsamlet ved trypsinering. Lige store portioner af cellesuspensioner og 0,4% trypanblåt blev blandet, og antallet af levedygtige, trypanblåt-eksklusive celler blev talt ved anvendelse af et hæmacytometer. Procentdelen af ​​levedygtige celler blev udtrykt pr 100 af de totale celler (gennemsnit ± SD). transficerede PC-3-celler blev yderligere evalueret af MTS-assay. Efter 48 timers transfektion blev celler eksponeret for Doc eller forblev ubehandlet i yderligere 48 timer. Efter inkubation ved 37 ° C i 5% CO

2 til 4 timer blev antallet af levende celler måles ved anvendelse af et 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2 – (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium (MTS) assay (CellTiter 96 Vandig One-opløsning celleproliferationsassay, Promega, Madison, WI, USA) i overensstemmelse med fabrikantens instruktioner. Absorbans blev målt ved 490 nm under anvendelse af en flerbrøndsplade reader (Model 680, Bio-Rad, Richmond, CA, USA), med brønde, der kun indeholder medium tjener som blindprøvekontrol.

Flowcytometri for cellecyklus og apoptose analyser

fordeling Cell cyklus blev analyseret ved flowcytometri. Kort fortalt blev transficerede celler behandlet med Doc i 48 timer og blev fikseret og farvet med propidiumiodid i 40 min. De levedygtige celler blev gated og DNA-indhold på mindst 10 000 mærkede celler blev kvantificeret med en fluorescens-aktiveret cellesorterer. Apoptose blev bestemt ved Annexin V konjugeret med fluoresceinisothiocyanat (FITC) og 7-AAD-farvning (BD Pharmingen BD Bioscience, San Jose, CA, USA). Cellerne blev behandlet med Doc i 48 og 72 timer og farvede celler blev underkastet flowcytometrisk analyse på en FACSCalibur (BD Bioscience, San Jose, CA, USA) instrument. Præsenterede data opnås fra to uafhængige forsøg in duplo og blev analyseret under anvendelse FCS Express software (DeNovo Software, Los Angeles, CA, USA).

Western blot-analyse og Immunopræcipitation

Til Western blot-analyse totalt protein blev ekstraheret ved anvendelse radioimmunpræcipitationsanalyse (RIPA) buffer (50 mmol /L Tris-HCI, 150 mM NaCl, 20 mM EDTA, 1 % NP40, 0,1% SDS, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF og 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid) suppleret med protease-cocktail Complete Mini (Roche, Mannheim, Tyskland). Total proteinkoncentration blev målt under anvendelse BCA proteinassay (Pierce, Rockford, IL). Proteinprøver (20-30 ug) blev fyldt på 4-12% SDS-PAGE og overført til en nitrocellulosemembran Bio-Rad-assayet (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) og underkastet elektroforetisk analyse og blotting. Membraner blev probet natten over ved 4 ° C med de følgende primære antistoffer: anti-AR (441 og N-20), anti-c-jun, anti-p-cJun (Ser 63/73), og anti-β-actin, alt indkøbt fra Santa Cruz (Santa Cruz Biotechnology, CA), anti-PSA (Dako, Glostrup, Danmark), p-JNK fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Sekundære antistoffer (IRDye 680, IRdye 800) blev opnået fra Li-Cor Bioteknologi (Nebraska, USA) og proteiner påvises ved Odyssey® Infrared Imaging System.

For immunopræcipitation celler blev behandlet som angivet og høstet i lysis buffer. Cellelysater blev homogeniseret, proteinindhold målt og 500 ug-klaret protein blev inkuberet med anti-AR-antistof ved 4 ° C natten over med kontinuerlig omrøring. Lige store mængder af muse IgG blev anvendt som negativ kontrol. Protein G-perler (Pierce, Rockford, IL, USA) blev derefter tilsat til hver prøve og inkuberet ved 4 ° C i 2 timer. Prøver blev derefter centrifugeret ved 2000 x g 2 min og Laemmli prøvepuffer (30 pi) uden β-mercaptoethanol tilsættes, og blandingen inkuberes ved 65 ° C i 15 minutter for at eluere bundne proteiner. Eluatfraktioner blev centrifugeret ved 2000 x g, 1 pi af β-mercaptoethanol blev tilsat, og prøver underkastet Western blotting som beskrevet ovenfor. Proteinekspression blev evalueret i forhold til p-actin-ekspression ved densitometrisk analyse.

Real-time kvantitativ PCR-analyse

Totalt RNA blev isoleret fra LNCaP og LNb4 celler under anvendelse RNeasy Mini Kit (Qiagen, West Sussex, UK) ved at følge fabrikantens protokol og behandlet med RNase-fri DNase (DNase i; Amersham Pharmacia Biotech, Sollentuna, Sverige) for at fjerne potentielle genomiske DNA kontaminanter. Hver cDNA blev syntetiseret ved revers transskription fra 1 ug totalt RNA ved anvendelse af StrataScript First-Strand Synthesis System og vilkårlige hexamere primere (Stratagene, AH diagnostics, Stockholm, Sverige). Real-time PCR blev udført med SYBR Green QPCR Master Mix (iScript fra BioRad) i en MX 3000P detektionssystem (Stratagene) med en indledning trin ved 95 ° C i 10 minutter efterfulgt af 40 cyklusser ved 95 ° C i 30 sekunder, 56 ° C i 1 minut og 72 ° C i 1 minut.

Følgende primere for hvert gen blev anvendt: PSA (F5′-AGGCCTTCCCTGTACACCAA-3 ‘og R5′-GTCTTGGCCTGGTCATTTCC-3′), AR (F 5’-GTACCTGTCAGCCCCTGAAC-3 ‘og R5’ GGAGAGCTGCT TTCG- CTTAG-3 ‘), GAPDH (5’ -CGA CCA CTT TGT CAA GCT CA-3 ‘og 5′-AGG GGT CTA CAT GGCAACTG-3′), c-jun (F 5’-GCATGAGGAACCGCA- TCGCTGCCTCCAAGT-3 og R5 ‘GCGACCAAGTCCTTCCCACTCGTGCA- CACT-3 ‘), NKX3.1 (F 5′- GTACCTGTCGGCCCCTGAACG-3’og R5′-GCT- GTTA TACACGGAGACCAGG-3′), c-Myc (F 5′-GGCGGGCACTTTGCACTGGA-3’and R5′- TCGCGGGAGGCTGCTGGTTT-3′), KLK2 (F 5′-AGATGAAGACTCC-AGCCAT-3’og R 5′-GATACCTTGAAGCACACCA -3′), β-actin (F 5′-CGTGG- GGCGCCCCAG -3′ og R 5′-TTGGCCTTGGGGTTCAGGGGG – 3’).

mRNA beløb blev bestemt ved hjælp af sammenlignende C

metode T. Prøver blev analyseret tredobbelt, og dataene sammenlignet med ekspressionen af ​​mRNA i ikke-behandlet kontrol, der blev sat som referenceværdi.

Dyr og tumorinokulation

Fire til seks uger gamle NMRI mandlige nøgne mus fra Taconic Europe (Lille Skensved, Danmark) blev anvendt i eksperimentet. Den xenograftmodel blev udført i overensstemmelse med protokollen specifikt er godkendt af den etiske komité Lunds universitet (autorisationsnummer M 239-10). Musene blev holdt i henhold til de retningslinjer, som Malmö-Lund Komité. LNCaP-celler (2×10

6 celler) blev injiceret subkutant i begge flanker resulterer i to tumorer per mus. Efter tumorer har udviklet kirurgisk kastration blev udført. Dyrene blev tildelt i 6 grupper: mus blev behandlet med vehikel, Doc, Pac eller bicalutamid som enkeltstof og Doc eller Pac kombineret med bicalutamid. Lægemidler blev indgivet intraperitonealt (i.p.) (20 mg /kg) i 100 pi volumen gang om ugen i 5 uger undtagen bicalutamid, som blev indgivet to gange om ugen. På det tidspunkt er udpeget uge 0, blev behandling initieret og musene aflivet en uge efter den sidste behandling. Tumorer blev høstet, fikseret i formalin og paraffin indlejret til immunhistokemisk analyse.

Immunhistokemi

dissekerede xenotransplantattumorer blev fikseret i 4% paraformaldehyd og derefter indlejret i paraffin. Fire um tykke snit blev deparaffineret, rehydreret og mikrobølgeovn behandlet i 10 minutter i høj pH Target Retrieval Solution (Dako, Glostrup, Danmark), inden de behandles i automatisk Techmate 500 immunhistokemi farvning maskine (Dako) anvendelse af antistoffer mod AR, c-jun, s -cjun, og Ki-67 (Dako). DAB (3,3′-diaminobenzidin) blev anvendt som et kromogent substrat og objektglas blev modfarvet med hæmatoxylin. Prøverne blev set med et Olympus AX 70 mikroskop ved en forstørrelse på x 10. En vilkårlig semikvantitativ scoring blev anvendt til at vurdere farvning signaler og scorede i tre kategorier; negativ farvning (0), svag men påviselig farvning af nogle eller alle celler (1), moderat farvning (2) eller stærk farvning (3). Mindst to sektioner pr tumor blev bestemt, og den score var repræsentativt for mindst 70% af arealet af vævet analyseret.

Sub-cellulær fraktionering

Cellular fraktionering blev udført i overensstemmelse med den protokol, der leveres med NE-PER nukleare og cytoplasmatiske udvinding reagenser (Pierce, Rockford, IL). LNCaP-celler blev udsat for Doc eller Pac til 6, 24 og 48 timer eller forblev ubehandlet. Fraktioner blev kogt med SDS-prøvebuffer, underkastet SDS-PAGE og overført til en nitrocellulosemembran og probet som indikeret med primære antistoffer mod AR, β-actin eller lamin A, alle fra Santa Cruz, efterfulgt af sekundære antistoffer (IRDye 680, IRdye 800), som blev opnået fra Li-Cor Bioteknologi (Nebraska, USA). Proteiner blev påvist ved Odyssey® Infrared Imaging System.

Statistical Analysis

Resultater blev opnået fra mindst tre forsøg udført og er udtrykt som middelværdi ± SD. Statistisk signifikans blev bestemt med uparret t-test. Værdier af p 0,05 blev betragtet som signifikante.

Resultater

c-jun overekspression induceret resistens mod Doc behandling

Funktionen af ​​c-jun som en transskription faktor relateret til spredning er blevet rapporteret i prostatakræft før [22 ]. For at undersøge virkningen af ​​c-jun på Doc behandlet prostatacancerceller blev eksperimenter udført i LNCaP, LNb4 og PC-3 celler. Vi observerede, LNCaP-celler behandlet med Doc var mere resistente over for behandling ved angivne tidspunkter sammenlignet med PC-3-celler (30% vs. 9%, p = 0,003) (figur 1A). Selvom vi ikke påvise en statistisk signifikant forskel mellem LNCaP og LNb4 kunne vi se en tendens til, at langtidsbehandling med bicalutamid øger modstanden (figur 1A). Endvidere apoptose analyse blev udført ved anvendelse af Annexin V /7AAD bekræfter mindre apoptose i LNb4 celler udsat for Doc sammenlignet med parentale LNCaP-celler

(A) Cellelevedygtighed undersøges ved trypan blå-udelukkelse i LNCaP (LN), LNb4 og PC -3 celler. (B) Bestemmelse af apoptose ved flow-cytometri. Efter behandling af celler med Doc, blev omfanget af apoptose vurderet ved annexin V /7AAD assay. (C) MTS assay i PC-3-celler transficeret som vist i figur og behandlet 48 timer med 5 nM Doc. (D) Grafer fra flowcytometri i celler, der er nævnt i (c) fremviser cykling cellepopulation farvet med propidiumiodid. Cellerne blev behandlet med Doc i 48 timer eller forblev ubehandlet og sorteres i forskellige stadier af mitose ved flowcytometri. (E) Western blotting-analyse for at vise proteinekspression i transficerede celler, der er nævnt i (C). (F) Analyse af protein-protein-interaktion ved immunopræcipitation i nærvær eller fravær af Doc eller Pac i LN og LNb4 celler. Celler blev immunfældet med anti-AR (441) antistof og membraner blev undersøgt med anti-c-jun-antistof. Til kontrol blev 20 ug af cellelysatet anvendt som input og lige belastning blev confimed med AR-antistof.

(Figur 1B). For at undersøge om c-jun er involveret i responset på Doc terapi blev PC-3-celler transficeret med c-jun, c-jun-mutant (Juna) og co-transficeret med AR (AR /cJun, AR /Juna henholdsvis) plasmider og MTS-assay udført. PC-3-celler transficeret med Juna viste en statistisk signifikant stigning (p = 0,01, Juna vs kontrol) i celleproliferation (figur 1C), hvorimod transfektion med AR nedsat cellelevedygtighed sammenlignes med Doc behandlede kontrolceller. Selv om der var ingen statistisk signifikant forskel mellem Doc behandlet kontrol celler og c-jun transficerede PC-3 celler var der en klar tendens til øget rentabilitet i sidstnævnte. Interessant havde co-transfektion af AR i PC-3-celler, der overudtrykker af c-jun eller Juna ikke ophæver denne virkning på proliferation (figur 1C), hvilket antyder en rolle for c-jun som en potent antiapoptotisk faktor. Cell cyklus analyse blev derefter udført og viste celle anholdelse i G2-M fase Doc behandlet PC-3-celler (Figur 1D). Vi observerede, at PC-3-celler transficeret med AR eller Juna viste en lignende tendens med et markant fald af procentdelen af ​​celler i G2-M-fasen (18,6% og 19,9%, henholdsvis), mens S-fasen blev forøget (43 , 4% og 43,5%, henholdsvis), hvilket antyder, at phosphorylering af c-jun spiller en afgørende rolle i celle respons på Doc (figur 1D).

Vi næste undersøgte proteinekspression i de transficerede PC-3-celler. Western blotting-analyse viste en markant stigning i AR protein i celler co-transficeret med AR /cJun sammenlignet med celler transficeret med AR alene eller AR /Juna (figur 1E). Disse resultater antyder, at interaktionen mellem AR og c-jun er afhængig af den tilgængelige phosphorylering webstedet 63/73. For yderligere at vurdere virkningen af ​​taxan agenter på endogen c-jun og AR immunfældning blev udført i LNCaP og LNb4. Vi fandt en vekselvirkning mellem AR og c-jun i begge celletyper, som blev forstærket af Doc og Pac behandling (figur 1F). Disse resultater bekræfter, at der er en fysisk interaktion mellem c-jun og AR som regulerer virkningen af ​​taxanbehandling i PC celler.

Virkninger af c-jun siRNA på Doc respons

For at undersøge om c-jun nedregulering kan ændre PC celle respons på Doc vi transficerede PC-3 og LNCaP celler med siRNA eller nontargeted siRNA, som tjente som kontrol (figur 2A). Celler blev udsat for Doc i 24 eller 48 timer og underkastet MTS assay. c-jun signifikant nedreguleret selvom ikke helt mindre i begge cellelinier (figur 2A). LNCaP celler tavshed med siRNA viste et klart fald i levedygtighed efter 24 timer til Doc eksponering i forhold til forældrenes LNCaP celler (p = 0,002). I PC-3-celler blev der ikke observeret en betydelig ændring i cellernes levedygtighed på samme tidspunkt. Efter 48 timer virkningen af ​​C-jun silencing faldt og celler udvundet som vist i figur 2B.

(A) Western blotting-analyse viser transfektionseffektivitet af siRNA c-jun i både PC-3 og LNCaP-celler. (B) Celleproliferation i LNCaP (øverste felt) og PC-3 (nederste panel) celler transfekteret med c-jun siRNA eller nontargeted (kontrol) vektor. Cellerne blev behandlet med Doc i 24 og 48 timer. LNCaP-celler harbor c-Jun siRNA viste et signifikant fald i proliferation (p = 0,002), mens PC-3-celler ikke blev påvirket.

taxan-induceret p-cJun udtryk er uafhængig af JNK vej hos PC celler

Det er blevet rapporteret, at Doc kemoterapi inducerer sin virkning gennem selektiv aktivering JNK i cancerceller [23] . Når den er aktiveret, JNK phosphorylerer og aktiverer en række transkriptionsfaktorer, såsom c-jun. For at løse dette spørgsmål, vi analyseret, om JNK-signalvejen har en rolle i dok-induceret prostatacancer celledød. PC-3 og LNCaP-celler blev behandlet med 500 nM af JNK-inhibitor til 2 eller 8 timer, hvorimod Doc og Pac behandlede celler udført i tidspunkter 2, 4, 8 og 24 timer. Som vist i figur 3A c-jun-phosphorylering blev induceret 2 timer efter udsættelse for Doc i PC-3-celler, mens JNK phosphorylering optrådte 24 timer efter eksponering i PC-3-celler kun (figur 3A). I LNCaP-celler udsat for Doc blev observeret nogen markante ændringer i JNK phosphorylering på ethvert tidspunkt af lægemiddelbehandling (Figur 3B). Dette antyder, at JNK-aktivering kan være en sekundær effekt af Doc behandling og c-jun-phosphorylering er et primært mål for dok. Især i AR udtrykkende LNCaP-celler, kan en direkte interaktion med AR der forårsager hurtig induktion af c-jun-phosphorylering ikke udelukkes. Endvidere blev lignende resultater opnået i de ovennævnte celler udsat for Pac (figur ikke vist). Det er værd at nævne, at et basalt niveau af p-cJun hos ikke-behandlede celler blev udtrykt i begge cellelinier.

Western blotting-analyse af (A) PC-3 og (B) LNCaP-celler udsat for Doc ( 5 nM) i op til 24 timer eller forblev ubehandlet (0). PC-3 og LNCaP-celler blev podet i 24-brønds plader ved en densitet på 50.000 celler per brønd og behandles med Doc og Pac eller i kombination med 500 nM af JNK-inhibitor (SB) som angivet.

taxan agenter ændrer protein niveauer af AR og PSA

Yderligere eksperimenter blev udelukkende udført i kun LNCaP og LNb4 celler. Baseret på vores ovenstående resultat undersøges yderligere vi, hvordan taxanbehandling påvirker ekspressionen af ​​AR regulerede gener såsom PSA på protein niveau. Vi observerede en samtidig forøgelse af AR og PSA-proteinniveauer i dok behandlet LNCaP-celler (p = 0,01, Doc 24 vs kontrol) (figur 4A). Men i Pac behandlede LNCaP-celler en gradvis nedsættelse af AR protein blev set samtidig med PSA-niveau efter 48 timer (figur 4A). Interessant nok blev stigningen i AR protein niveau i LNb4 celler mere udtalt ved Doc behandling, mens PSA protein niveau klart blev reduceret efter 48 timer (p = 0,02, Doc 24 vs dok 48). Eksponering af LNb4 celler til Pac førte til en markant nedgang i AR og PSA-proteinekspression (figur 4B). Ekspression af p-cJun afveg i LNCaP og LNb4 (figur 4C, D). I LNCaP celler Doc behandling øget p-cJun udtryk gradvist (p = 0,04, Doc 6 vs Doc 48), mens der i Pac behandlede celler en stigning på 24 timer blev set, som blev efterfulgt af et markant fald på 48 timer (figur 4C) . Men i LNb4 celler Pac behandling resulterede i en tidsafhængig induktion af p-cJun, mens Doc behandling undladt at gøre det (figur 4D). Ingen markante ændringer i c-jun niveauer blev observeret i begge cellelinier og under alle undersøgte betingelser.

Western blotting-analyse af ekspressionen af ​​AR og PSA i (A) LNCaP og (B) LNb4 celler. Celler eksponeret for 5 nM af Doc, 5 nM Pac eller 10 nM DHT i op til 48 timer eller forblev ubehandlet. De samme lysater blev anvendt til at analysere ekspressionen af ​​p-cJun og c-jun i (C) LNCaP og (D) LNb4 celler. Protein ekspressionsniveauerne blev evalueret ved densitometrisk analyse (lavere paneler).

Effekt af taxan behandling på c-jun og AR mRNA-ekspression

For at undersøge RNA ændringer som følge af taxan behandling, QRT-PCR blev udført i LNCaP og LNb4 celler. Cellerne blev behandlet som vist i figur 5. Selv om vi observeret en indledende induktion af AR- og PSA mRNA i Doc behandlet LNCaP-celler, dette ikke forekommer i Pac behandling. Interessant, viste LNb4 celler en fortsat stigning af AR mRNA-ekspression i en tid, afhængig måde, når de behandles med Doc, mens PSA mRNA var negativt korreleret til AR mRNA-ekspression (figur 5A). Der var en statistisk signifikant forskel i AR og PSA mRNA niveau ved 24 og 48 timer efter udsættelse for Doc (p = 0,05 og p = 0,003, henholdsvis). Men i Pac behandlede LNb4 celler vi observerede en indledende induktion af AR og PSA mRNA, som faldt til et betydeligt niveau efter 48 timer. I modsætning hertil c-jun-mRNA-ekspression steget betydeligt i Pac behandlede LNb4 celler (p = 0,03), som ikke kunne vises i dok behandlede celler (figur 5B). Som forventet KLK2 mRNA-ekspression viste et lignende mønster som PSA mRNA i alle celler behandlet. Yderligere analyser af c-myc og NKX3.1 blev udført som vist i figur 5B. Resultaterne viser ingen signifikant tendens i c-myc mRNA-ekspression uanset taxan anvendes, og behandlingstidspunktet. Alligevel observerede vi en øget ekspression af NKX3.1 mRNA i alle Doc behandlede celler, mens dette var mindre udtalt i Pac behandlede celler (figur 5B).

Ekspression af (A) AR og PSA og (B) c -jun, KLK2, NKX3.1 og c-myc-mRNA-niveauer som respons på Doc eller Pac blev vurderet ved kvantitativ realtids-PCR (qPCR). Den relative middelværdi mRNA-ekspression niveau af AR regulerede gener blev målt ved kvantitativ realtids-RT-PCR i triplikater.

For at opsummere vores resultater viser en klar sammenhæng mellem AR, c-jun og PSA i taxan behandlede celler. Resultatet af behandlingen er afhængig af status for AR-receptoren og c-jun-mRNA-ekspression og taxanen anvendes.

Animal model

For at vurdere den terapeutiske respons af prostatacancer LNCaP in vivo vi etableret en dyremodel som vist i figur 5. Mus blev behandlet med Doc eller Pac som enkeltstof eller i kombination med bicalutamid. En statisitically signifikant reduktion i tumorstørrelse af mus behandlet med Doc alene blev vist (p = 0,04, Doc vs ctr) (figur 6A). I mus behandlet med Pac en stabilisering, men ikke noget fald i tumorvolumen blev observeret (figur 6A). Der var ingen signifikant forskel observeres mellem Doc-behandlede mus og mus, der modtog kombineret behandling med bicalutamid (figur 6C). Interessant, tumorer i mus behandlet med Pac og bicalutamid tumorer begyndte at regrow efter den indledende stabilisering (figur 6C). Der var en statistisk signifikant tumor neddeling i dok /bic sammenlignet med PAC /bic behandlede mus (p = 0,003).

(A) Vækst kurve af mus behandlet med Doc eller Pac alene, Doc vs ctr (p = 0,04). (B) svarende immunhistokemisk farvning af tumorvæv. (C) Vækstkurve af mus med kombineret behandling, Doc /bicalutamid (BIC) vs Pac /Bic (p = 0,003). (D) Tilsvarende immunhistokemisk farvning af tumorvæv. Bemærk, at p-cJun blev differentielt udtrykt i mus behandlet med Doc og Pac. Ki67 udtryk var højere i Pac forhold til Doc behandlede mus.

Vi næste undersøgt ekspressionen af ​​c-jun, p-cJun, AR og Ki67 proteiner i tumorvæv høstet for at vurdere effekten af ​​medicinsk behandling. Der var en signifikant ændring i nukleare AR niveauer i dyr behandlet med Doc alene eller Doc /bic (figur 6B og 6D, henholdsvis). I begge behandlingsgrupper ca. 60% af cellepopulationen udviste en cytoplasmatisk translokation af AR, sammenlignet med mus i kontrolgruppen (figur 6B). I modsætning hertil mus behandlet med Pac eller kombinationsterapi den cytoplasmatiske translokation af AR var mindre udtalt. Imidlertid er ekspressionen af ​​p-cJun i væv fra kontroldyr udviste en intens farvning, mens vi observeret, at nuklear p-cJun var mere tydelig i Pac-behandlede mus sammenlignet med Doc behandlede dyr, hvor også et cytoplasmatisk ekspression blev fundet (figur 6B). Ingen signifikant ændring i mønstret for c-jun-ekspression blev set i kontrol og behandlede dyr. Ki67 udtryk var mere udtalt i Pac behandlede mus, der afspejler den ringe respons af tumorer på denne taxan in vivo.

For at bekræfte cytoplasmatisk translokation af AR ved taxanbehandling in vitro, blev udført Western blotting eksperimenter i LNCaP celler ( Figur S1). Efter aftale med in vivo data påviste vi, at uafhængig af taxanet brugte AR blev omplantes til cytoplasmaet. Den translokation var mere udtalt i Doc behandlede celler (øverste panel) sammenlignet med Pac behandlede celler (lavere panel), især efter 48 timers behandling.

Diskussion

I denne undersøgelse har vi belyst rolle AR og dets coaktivator c-jun i PC celle respons på taxan-terapi. Vi har vist, at c-Jun-overekspression i PC-3-celler medfører en statistisk signifikant højere modstand til Doc behandling sammenlignet med celler co-transficeret med AR /c-jun eller AR alene. LNCaP-celler var mere resistente over for Doc i nærvær eller fravær af bicalutamid sammenlignet med PC-3-celler. Transfektion med mutant Juna øget levedygtighed, hvilket antyder, at c-jun og phosphorylering webstedet 63/73 er ​​en vigtig regulator af cellereaktion på taxaner i PC. Vi har vist for første gang, at Doc og Pac behandling anderledes påvirker protein og mRNA niveauer af AR og PSA i forældrenes LNCaP og LNb4 celler. Disse forskelle blev afspejlet i tumorvækst i musemodellen. Her fremlagte resultater dokumenterer, at effekten af ​​taxan behandling er stærkt afhængig af c-jun og AR status cellelinien anvendes, og lægemidlet anvendes til behandling.

Det er kendt, at AP-1 transkriptionsfaktor er multifunktionelt og til tider kontroversielt diskuteret i litteraturen [24]. c-jun er blevet påvist at transducere et mitogent respons og fremme cellevækst som et enkelt gen eller i samarbejde med et aktiveret ras-gen [25,26]. Derfor har vi fundet, at c-jun overekspression (mutant Juna) giver resistens over for PC-3-celler til Doc terapi. Interessant Juna viste sig at være mere potent i forebyggelsen celledød sammenlignet med AR antyder, at phosphorylering webstedet 63/73 er ​​afgørende for interaktion og stabilisering af AR og c-jun-komplekser.