PLoS ONE: AUY922 effektivt Overvinder MET- og AXL-medieret Modstand mod EGFR-TKI i Lung Cancer Cells

Abstrakt

Aktiveringen af ​​bypass signaler, såsom MET og AXL, er blevet identificeret som en mulig mekanisme af EGFR-TKI modstand. Fordi forskellige oncoproteiner afhænger HSP90 for modning og stabilitet, undersøgte vi virkningerne af AUY922, en nyudviklet ikke-geldanamycin klasse HSP90 inhibitor, i lungekræft celler med MET- og AXL-medieret resistens. Vi etablerede resistente cellelinier med HCC827 celler huser en exon 19-deletionsmutation i den

EGFR

gen via lang tids udsættelse for stigende koncentrationer af gefitinib og erlotinib (HCC827 /GR og HCC827 /ER, henholdsvis). HCC827 /GR resistens blev medieret af MET-aktivering, hvorimod AXL-aktivering forårsaget modstand i HCC827 /ER-celler. AUY922 behandling undertrykkes effektivt proliferation og induceret celledød i begge resistente cellelinier. Følgelig nedregulering af EGFR, MET, og AXL førte til nedsat Akt aktivering. De inhibitoriske virkninger af AUY922 på hver receptor blev bekræftet i gen-transficerede LK2 celler. AUY922 også styres effektivt tumorvækst i xenograft musemodeller indeholder HCC827 /GR og HCC827 /ER celler. Desuden AUY922 reduceret invasion og migration ved begge typer af resistente celler. Vores undersøgelse fund viser således, at AUY922 er en lovende behandlingsmulighed for MET- og AXL-medieret resistens over for EGFR-TKI i lungekræft

Henvisning:. Choi YJ, Kim SY, så KS, Baek IJ, Kim WS , Choi SH, et al. (2015) AUY922 effektivt Overvinder MET- og AXL-medieret Modstand mod EGFR-TKI i Lung Cancer Cells. PLoS ONE 10 (3): e0119832. doi: 10,1371 /journal.pone.0119832

Academic Redaktør: Javier S. Castresana, Navarra Universitet, SPANIEN

Modtaget: 26 august, 2014 Accepteret: 16 januar 2015; Udgivet: 17 Marts 2015

Dette er en åben adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering: J.K. Rho var blevet tildelt et tilskud på National Research Foundation Korea (NRF, 2013R1A1A2005112) og S.H. Choi var blevet tildelt et tilskud af Asan Institut for Life Sciences (2014-597). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

epidermal vækstfaktorreceptor-tyrosinkinase inhibitor (EGFR-TKI) er en af ​​de mest succesfulde målretning midler anvendt til behandling af kræft. Men udviklingen af ​​resistens, på trods af gode indledende reaktioner hos patienter med EGFR-mutant lungekræft er uundgåelig [1,2]. Selv om næsten halvdelen af ​​alle TKI modstand er forårsaget af en sekundær T790M mutation [3,4], kunne aktivering af bypass-signaler såsom markedsøkonomisk eller AXL også bidrage til erhvervelse af resistens [5,6].

MET genamplifikation forårsager HCC827 celler, der huser det sensibiliserende EGFR mutation til at blive resistente over for gefitinib via ErbB3-afhængig aktivering af phosphoinositid 3-kinase /Akt (PI3K) pathway [5]. Indledende undersøgelser rapporteret, at omkring 20% ​​af patienter med erhvervet resistens over for EGFR-TKI’er viste

MET

genamplifikation med eller uden T790M [5,7], mens en nylig undersøgelse af hyppigheden af ​​resistensmekanismer afslørede, at

MET

amplifikation udviklet hos ca. 5% af patienterne efter resistens [8]. Kombination behandlinger med markedsøkonomisk og EGFR-hæmmere kan ophæve aktiveringen af ​​downstream signaler, og derved overvinde erhvervet resistens over for EGFR-hæmmere [5,9]. Flere MET tyrosinkinaseinhibitorer og MET-blokerende monoklonale antistoffer, herunder SU11274, ARQ197 og onartuzumab, er i kliniske forsøg [10].

For nylig rapporterede tre selvstændige studiegrupper at AXL, som er inkluderet i TAM ( Tyro-Axl-Mer) receptor (RTK) familie, kunne være en årsag til EGFR-TKI-resistens i prækliniske modeller [6]. Selvom ca. 20% af patienter viste AXL overekspression efter at have udviklet resistens i denne undersøgelse, at den nøjagtige andel blandt patienter med erhvervet resistens og behandlinger, der kan anvendes til at overvinde virkningerne af målretning AXL i kliniske omgivelser forbliver bestemmes [11] .

Heat shock protein 90 (HSP90) spiller en afgørende rolle i at opretholde cellulær protein homeostase ved at påvirke protein modning og stabilitet [12]. Fordi forskellige oncoproteiner afhænge af dens rette funktion har HSP90 blevet anerkendt som en attraktiv terapeutisk mål [13]. Kliniske forsøg rettet mod mutant EGFR, herunder T790M mutant med HSP90 hæmmere, er i gang. Nogle prækliniske studier har rapporteret lovende resultater [14-16]. Der er dog ikke tilstrækkelige data om, hvordan MET- eller AXL-medieret resistens over for EGFR-TKI i lungekræft kunne overvindes ved at hæmme HSP90. I vores foreliggende undersøgelse undersøger vi effekten af ​​AUY922, en ikke-geldanamycin klasse HSP90 inhibitor af MET- og AXL-medieret resistente cellelinier og dyremodeller.

Materialer og metoder Salg

Cellekultur og reagenser

HCC827 celler blev opnået fra American Type Culture Collection (Rockville, MD). Gefitinib- og erlotinib-resistent cellelinier (HCC827 /GR og HCC827 /ER, henholdsvis) blev etableret som en del af en tidligere undersøgelse [17]. Celler blev dyrket i RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Invitrogen) ved 37 ° C i en atmosfære af 5% CO

2. AUY922 blev købt fra Selleck kemikalier (Houston, TX).

Cell levedygtighed analyser

Cell levedygtighed blev vurderet ved hjælp af MTT-analysen. Kort fortalt blev celler i den logaritmiske vækstfase høstes, podedes på plader med 96 brønde og dyrket natten over. Celler blev udsat for forskellige doser af AUY922 i medium indeholdende 1% FBS. Efter 72 timer blev MTT-assayet udført som beskrevet af Carmichael et al. [18]. At validere de anticancer virkninger af AUY922 blev celler behandlet med de angivne doser af AUY922 i 72 timer og de vedhæftede celler blev farvet med en 0,2% trypanblåt-opløsning indeholdende 50% methanol. Cellelevedygtighed blev bestemt under anvendelse af en ADAM-MC automatisk celletæller (NanoEnTek, Seoul, Korea) i accordiance med producentens anvisninger. Resultaterne er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg, og fejlen søjler indikerer standardafvigelsen (SD).

Western blot-analyse

For western blotting, proteiner blev separeret på SDS-polyacrylamidgeler og elektrooverført til Immobilon-P-membraner (Millipore, Bedford, MA). Antistoffer specifikke for p-EGFR (Tyr1173), EGFR, AXL, MET, Akt, p-Erk, Erk, Myc, og β-actin blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), og antistoffer for p-MET ( Tyr1234 /1235), p-AXL (Tyr702), p-Akt, PARP og caspase-3were fås fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Proteiner blev påvist ved anvendelse af et forøget kemiluminescens western blotting (Amersham Biosciences, NJ) i overensstemmelse med producentens anvisninger.

Transient transfektion

pcDNA3 /EGFR (WT) og pcDNA3 /EGFR (delE746- A750) blev leveret af Dr. TY Kim (College of Medicine Seoul National University, Seoul, Sydkorea). pCMV6-opslag /MET blev købt fra OriGene (Rockville, MD). pcDNA3.1 /AXL (WT) blev bygget som en del af en tidligere undersøgelse [6]. Transfektioner blev udført under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i overensstemmelse med producentens anvisninger. Salg

Cellecyklusanalyse

Celler podedes på plader med 6 brønde og behandlet i de angivne tidsrum med 1 pmol /L AUY922. Både vedhængende og flydende celler blev indsamlet til analyse. Celler blev fikseret i 70% iskold ethanol i 1 time og inkuberet i 50 ug /ml RNase A og 25 pg /ml propidiumiodid (PI) i 30 minutter ved 37 ° C. Kvantitativ analyse af fordelingen cellecyklen blev udført under anvendelse FASCalibur flowcytometri (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ).

In vivo

undersøgelse

Kvinde alvorlig kombineret immundefekt (SCID ) mus (18-20 g; 5 uger gamle, 5 mus /gruppe) blev erhvervet fra Charles River Laboratories. Alle eksperimentelle procedurer blev udført efter en protokol godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg for Asan Institut for Life Sciences (2013-01-066). Tumorer blev dyrket ved at implantere celler (1 x 10

6 HCC827 /GR-celler eller 5 × 10

6 HCC827 /ER celler) i Matrigel (BD Biosciences) og efterfølgende ind i musen over fløjene. Behandling med vehikelkontrollen påbegyndes, når tumorerne nåede et volumen på 50-100 mm

3 (20 mg /kg AUY922 via intraperitoneal injektion; 5 dage /uge). Behandlingen blev stoppet på den angivne dag, og musene fik opfølgende undersøgelser for at dokumentere tumor tilbagefald. For at måle tumorstørrelse, længden (

L

) og bredde (

W

) af hver tumor blev målt ved hjælp af skydelære, og tumor volumen (TV) blev beregnet som TV = (

L

×

W

2) /2. Immunhistokemisk farvning blev udført under anvendelse af et specifikt primært antistof (Ki-67; DakoCytomation, Los Angeles, CA), Envision Plus farvning kit (DakoCytomation), og APO-Direct terminal deoxynukleotidyltransferase-medieret dUTP nick-endemærkning (TUNEL) assaykit (Millipore), som anvist af leverandørens anvisninger. Kvantitativ analyse af hver farvede sektion blev udført ved at tælle alle immunpositive celler i 5 vilkårligt valgte felter (× 400 forstørrelse).

invasion og migration assays

Alle cellemigration og invasion-assays blev udført ifølge en tidligere beskrevet metode [19]. Resultaterne er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg, og fejlen søjler indikerer SDS.

Resultater

AUY922 effektivt hæmmer spredning af gefitinib /erlotinib-resistente celler

Gefitinib /erlotinib-resistente underlinjer afledt fra forældrenes, følsomme HCC827 cellelinje blev etableret som en del af en tidligere undersøgelse [17]. Cellerne blev behandlet med AUY922 på en dosis-afhængig måde at afgøre, om det hæmmer cellevækst i gefitinib /erlotinib-resistente celler. Som vist i fig. 1 begge resistente cellelinier viste krydsresistens over for gefitinib eller erlotinib henholdsvis og var også modstandsdygtige over for afatinib. Alligevel AUY922 behandling undertrykkes effektivt proliferationen af ​​den parentale linje og begge resistente cellelinier (fig. 1d). De væksthæmmende virkninger af AUY922 blev observeret, selv når medikamentkoncentrationen var lav (fig. 2A).

Celler blev behandlet med de angivne doser af gefitinib, erlotinib, afatinib eller AUY922 i 72 timer i medium indeholdende 1% FBS. Cellelevedygtighed blev bestemt under anvendelse af MTT-assayet.

A, blev celler behandlet med de angivne doser af AUY922 i 72 timer i medium indeholdende 1% FBS. Bundne celler blev farvet med trypan blå opløsning (øverst). Cellelevedygtighed baseret på celletælling vises også (nederst). Bjælkerne repræsenterer middelværdien ± SD af tre brønde. B, Celler behandlet med AUY922, ligner panel A. Efter 48 timer blev cellerne høstet og EGFR-signalering molekyler blev vurderet ved anvendelse af western blotting. C, LK2 celler blev behandlet med vektor-holdige vildtype EGFR, del E746-E750, MET, eller AXL og de angivne doser af AUY922 i 12 timer.

Vi har tidligere vist, at modstanden af HCC827 /GR og HCC827 /eR celler medieres af MET eller AXL aktivering henholdsvis [6,17]. Tidligere rapporter har også tilkendegivet, at et stort antal HSP90 klient proteiner har afgørende roller i kræft progression, og at hæmning af HSP90 nedbryder klient proteiner [13,20,21]. Undersøgte vi således om AUY922 påvirker stabiliteten af ​​markedsøkonomisk eller AXL. Inhiberingen af ​​HSP90 af AUY922 viste sig at føre til signifikant nedbrydning af EGFR, MET, og AXL på en dosis- (fig. 2B) og tidsafhængig måde (S1 Fig.). I overensstemmelse hermed AUY922 behandling faldt også niveauet af kunstigt frembragte proteiner i LK2 celler, som blev transfekteret med gener, såsom

EGFR

(WT),

EGFR

(Del E746-E750),

MET

, og

AXL

(fig. 2C).

Mange HSP90 hæmmere inducerer cellecyklusstop og apoptose i forskellige cancerceller [22-26]. For yderligere at bekræfte virkningerne af AUY922, undersøgte vi cellecyklus ændringer i PI-farvede celler under anvendelse af FACS-analyse. Som vist i fig. 3A, AUY922 behandling steg antallet af celler i G2 /M-fase og induceres sub-G1 (dvs. celledød) efter 48 timer. I overensstemmelse med disse resultater blev tidsafhængig PARP og caspase-3-spaltning også observeret (fig. 3C). Disse data indikerede, at antitumorvirkninger af AUY922 på parentale og resistente celler kan skyldes induktion af standsning af cellecyklus og celledød.

A og B, blev celler behandlet med 0,1 pmol /L AUY922 for 24-72 timer. For at analysere fordelingen cellecyklus blev de høstede celler analyseret ved flowcytometri. C, Cellelysater blev analyseret under anvendelse western blotting. De angivne antistoffer blev anvendt til at evaluere apoptotisk celledød.

AUY922 overvinder erhvervet resistens over for gefitinib /erlotinib i xenograftmodeller

HCC827GRand HCC827 /ER tumorxenoplantater blev etableret i SCID-mus til yderligere evaluere antitumorvirkningen af ​​AUY922. Tumor vækst i HCC827 /ER-celler var lavere end den for HCC827 /GR-celler. AUY922 behandling resulterede i væsentlig hæmning af væksten i begge celler (fig. 4A). Undertrykt tumorvækst blev opretholdt i HCC827 /ER implanteret gennem 2 uger efter seponering, mens tumorer i HCC827 /GR xenograft langsomt voksede igen efter tilbagetrækning narkotika. Immunohistokemiske analyser af tumorvæv afslørede, at celledeling var faldet og apoptose blev induceret i begge tumorer ved AUY922 behandling (fig. 4B-C).

A, SCID-mus med etablerede HCC827 /GR og HCC827 /ER tumorceller xenotransplantater blev behandlet med AUY922. Tumorstørrelse blev målt på de angivne dage, og tumorvolumen blev beregnet. Pile betyder sidste dag i behandling lægemiddel (rød pil, HCC827 /GR, lilla pil, HCC827 /ER). Bjælkerne repræsenterer middelværdien tumorvolumen ± SD. B og C, immunhistokemisk farvning for Ki-67 og TUNEL efterfulgt af kvantitativ analyse af proliferation og apoptose i (B) Ki-67

+ -celler og (C) TUNEL

+ -celler.

* p

0,01 og

** p

0,001 i sammenligning med kontrolgruppen.

AUY922 falder cellulære mobilitet

induktion af AXL eller MET er forbundet med øget cellulær mobilitet i kræft [6,10,27-29]. Vi undersøgte derfor ændringer i cellulær mobilitet i både forældrenes og gefitinib /erlotinib-resistente celler. Som forventet, de vandrende og invasive evner i både resistente celletyper steget voldsomt i forhold til forældrenes celler (fig. 5). AUY922 behandling resulterede i reducerede vandrende og invasive kapaciteter i både resistente og forældrenes celler.

Celler blev podet på enten collagen eller Matrigelcoatede polycarbonatfiltre at bestemme deres træk og invasive potentialer, hhv. Celler blev inkuberet i modificerede Boyden kamre med eller uden de angivne doser af AUY922 i 24 timer, og de celler, der trængte filteret blev farvet og talt ved anvendelse af et lysmikroskop. Bjælkerne repræsenterer middelværdien ± SD af tre brønde.

* p

0,01 og

** p

0,001 i sammenligning med HCC827 celler.

Diskussion

Da mutant EGFR-varianter, herunder T790M, blev først vist at være forbundet med HSP90 chaperoneproteiner [16], flere lignende baner af beviser har akkumuleret. T790M-udtrykkende celler, som er resistente selv til irreversibel EGFR-TKI’er er følsomme over for HSP90 inhibition. HSP90 inhibering fører til regression af EGFR

L858R

-driven murin lunge adenocarcinom, uanset tilstedeværelsen af ​​T790M [15]. Bao et al. har også rapporteret, at målrette HSP90 med CUDC-305, en HSP90 hæmmer, kan overvinde erlotinib-modstand i ikke-småcellet lungecancer [30]. Endvidere 17-DMAG reducerer væksten af ​​lungecancerceller med mutant EGFR, uanset tilstedeværelsen af ​​en T790M mutation i mus xenograftmodeller [14]. I øjeblikket er over et dusin HSP90 inhibitorer er indskrevet i kliniske forsøg, hvoraf nogle undersøger T790M-medieret resistens over for EGFR-TKI’er [20].

Adskillige tidligere studier har vist, at behandling er en HSP90 klient protein og er udsat for nedbrydning på HSP90 inhibition. SNX-2112, en hidtil ukendt lille molekyle inhibitor for HSP90, reducerer EGF krydstale og aktivering af c-Met receptor via c-Met nedbrydning i lungecancerceller [31]. Ueno et al. har vist, at AUY922 er effektiv mod de fleste NSCLC cellelinjer, uanset kendte molekylære ændringer. AUY922 behandling viste sig at inducere signifikant udtømning af klient proteiner, såsom EGFR, MET, og Akt, og derved øge apoptose [32]. Selv om disse undersøgelser har vist evnen til HSP90 hæmmere at nedregulere MET, de ikke evaluere MET-medieret resistens over for EGFR-TKI i lungekræft. Følgelig Koizumi et al. først vist effekten af ​​HSP90-inhibitorer til at overvinde modstanden forårsaget af MET signalering [33]. I denne undersøgelse, HGF-gen transficerede Ma-1 celler med EGFR

L858R Hotel (Ma-1 /HGF) reagerede ikke på erlotinib, mens 17-DMAG hæmmede celledeling og induceret apoptose ved at mindske ekspressionen af ​​EGFR og MET, selv under HGF stimuli. Yderligere klinisk relevante modeller blev undersøgt af Xu et al. [34]. Disse forfattere genereret transgene musemodeller, der udtrykker mutant Del19-T790M eller L858R-T790M EGFR (hver med samtidig MET overekspression). Kombination EGFR og MET hæmning med WZ4002 (en tredje generation EGFR-TKI) og crizotinib demonstreret meget effektiv kontrol i disse kræftmodeller, men ingen af ​​disse lægemidler alene kunne fremkalde en undertrykkende respons. Disse forfattere fandt endvidere, at virkningerne af 17-DMAG er sammenlignelige med crizotinib når det kombineres med WZ4002, hvilket antyder, at MET inhibering er mulig via HSP90. Desuden blev en tilsvarende virkning observeret i en anden musemodel bærende gefitinib-resistente MET-forstærket HCC827 xenografter. Disse resultater er næsten i overensstemmelse med vores nuværende fund i en HCC827 /GR model. Men vores nuværende resultater bedre repræsenterer en klinisk indstilling, fordi vores HCC827 /GR celler blev oprettet ved kontinuerlig langvarig eksponering narkotika.

I forhold til behandling, er der kun få data om, hvordan AXL afhænger HSP90 for stabilitet. For nylig Krishnamoorthy et al. rapporterede, at 17-AAG inducerer nedregulering af endogen eller ektopisk udtrykt AXL protein i skjoldbruskkirtlen cancercellelinier og i HeLa-celler på en tids- og dosisafhængig måde, hvilket fører til inhibering af AXL-medieret signalering og biologisk aktivitet [35 ]. Så vidt vi ved, vores aktuelle undersøgelse er den første til at vise, at HSP90 inhibering med AUY922 kan overvinde AXL-medieret resistens i lungekræft cellelinier og dyremodeller. Tilsammen derfor tyder på, at fordi HSP90 hæmning kan overvinde erhvervet resistens over for EGFR-TKI’er forårsaget af de tre store resistensmekanismer (T790M, MET, og AXL), kunne HSP90 hæmning være en lovende mulighed for at behandle EGFR-TKI modstand.

i de nuværende undersøgelser, har vi vist, at AUY922 fuldstændig undertrykt tumorvækst i begge celler. Men viste både resistente celler, det andet mønster i vækstrate og genvækst efter seponering. HCC827 /GR celler vokser hurtigere end HCC827 /ER celler under forudsætning af stoffri og de viste genvækst efter tilbagetrækning narkotika. Vækstraten for HCC827 /ER celler var langsommere end HCC827 /GR celler

in vitro

(S2 Fig.). Selvom forskellige faktorer kan påvirke tumorvækst i xenograftmodeller, kan forskellene i væksthastighed påvirke tumorvækst. Faktisk HCC827 /ER-celler havde en lavere EGFR samt Akt aktivitet end HCC827 /GR-celler i basisniveauet (data ikke vist). Der var ingen forskelle i apoptose, nekrose, cellecyklusstop (G2 /M arrest, S3 Fig.) Og proliferation mellem disse to tumorer. Således forskellige reaktion på tilbagetrækning lægemiddel forblev uklart.

Metastase afhænger flere processer, såsom frigørelsen af ​​tumorceller fra den primære tumor, migration, invasion af de omkringliggende stroma og blodkar, og overlevelse og proliferation på fjerne steder. Hepatocytvækstfaktor (HGF) er den eneste kendte ligand af markedsøkonomisk behandling og det er anerkendt som en fibroblast-afledt faktor, der fremmer epitelcelle løsrivelse og stimulerer invasion [36,37]. MET påvirker celle migration, vækst i embryogenese, og styrer vækst og metastase i cancerceller [38]. Følgelig Wu et al. har vist, at LY2801653 (en MET inhibitor) i væsentlig grad hæmmer både primær tumorvækst og metastasering til lymfeknuder og brystvæggen i H441 ortotopisk modeller [39]. AXL er også forbundet med tumorcelleinvasion og metastase og fremmer tumorvækst i forskellige former for kræft. Tvunget ektopisk AXL udtryk fremkalder de meget invasive egenskaber set i MCF7 brystkræftceller fra indledende svagt invasive fænotyper, hvorimod bruge shRNA behandling for at inducere AXL knockdown nedsætter invasive og migrerende kapacitet stærkt invasive kræftceller [29]. Desuden er AXL nødvendig for MDA-MB-231 brystcancerceller til at metastasere til lungerne i ortotopisk modeller [27]. I vores nuværende analyser, AUY922 reduceret markant de invasive og vandrende kapaciteter både tumorceller med markedsøkonomisk eller AXL aktivering. Yderligere undersøgelser af den rolle, HSP90 hæmmere i cancer metastaser er nødvendige.

I resumé, AUY922 udøver effektiv kontrol over maligne fænotyper, der er drevet af MET og AXL, herunder resistens, i lungekræft.

Støtte Information

S1 fig. Cellerne blev behandlet med 0,1 pmol /L AUY922 i en tidsafhængig måde. Salg Eksperimenter blev udført som beskrevet i fig. 2A og B.

doi: 10,1371 /journal.pone.0119832.s001

(TIF)

S2 Fig. Celler (5 x 10

3) blev podet i plader med 24 brønde med udfyldte medier indeholdende 10% FBS Salg Celleantallene blev bestemt med en ADAM-MC automatisk celletæller

doi:.. 10,1371 /tidsskrift. pone.0119832.s002

(TIF)

S3 fig. Tumorvæv fra hver gruppe blev homogeniseret for lysat forberedelse og analyseret ved Western blot til evalueres G2 /M arrest.

Cyclin B1, p21 og cdc2 antistoffer blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), og p-cdc2 ( Tyr15) blev opnået fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0119832.s003

(TIF)