Abstrakt
Baggrund
Kirurgiske prøver har længe været brugt som vigtige emner for kræftforskning. I overensstemmelse med en stigning på neoadjuverende terapi, har biopsiprøver nylig blevet bydende nødvendigt for kræft transkriptom. På den anden side, både biopsi og kirurgiske prøver er tilgængelige til ekspression profilering til forudsigelse kliniske resultat af adjuverende behandling; men det er stadig uklart, om kirurgisk prøve udtryk profiler er nyttige for forudsigelse via biopsiprøver, fordi lidt er blevet gjort om sammenlignende genekspression profilering mellem de to slags prøver.
Metode og Resultater
i alt 166 prøver (77 biopsi og 89 kirurgisk) i normale og maligne læsioner i spiserøret blev analyseret ved microarrays. Genekspression profiler blev sammenlignet mellem biopsi og kirurgiske prøver. Kunstigt induceret epithelial-mesenchymal overgang (aiEMT) er fundet i de kirurgiske prøver, og også forekom i mus esophageal epitel cellelag under en iskæmisk tilstand. Identifikation af klinisk signifikante undergrupper blev anset for at blive forstyrret af lidelsen af udtrykket profil gennem denne aiEMT.
Konklusion og betydning
Denne undersøgelse vil fremkalde den grundlæggende fejlfortolkning herunder undervurdering af prognostisk evaluering magt af markører ved overvurdering af EMT i tidligere kræftforskning, og vil give nogle råd til den nærmeste fremtid som følger: 1) Forståelse hvor længe væv var under en iskæmisk tilstand. 2) Udbredelsen af biopsiprøver for
in vivo
udtryk profilering med lave fordomme om grundforskning og klinisk forskning. 3) Kontrol cancer celleindhold og normal- eller nekrotisk væv forurening i biopsiprøver for udbredelsen
Henvisning:. Aoyagi K, Minashi K, Igaki H, Tachimori Y, Nishimura T, Hokamura N, et al. (2011) Kunstigt induceret Epithelial-Mesenchymale Transition i Kirurgiske Emner: dens implikationer i klinisk og Basic Cancer Research. PLoS ONE 6 (4): e18196. doi: 10,1371 /journal.pone.0018196
Redaktør: Irene Oi Lin Ng, The University of Hong Kong, Hongkong
Modtaget: December 24, 2010; Accepteret: 22 Februar 2011; Udgivet: 21 April, 2011
Copyright: © 2011 Aoyagi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Denne undersøgelse blev delvist understøttet af programmet til fremme af grundlæggende Studier i Health Sciences i National Institute of Biomedical Innovation; en Grant-in-Støtte til tredje Omfattende 10-årig strategi for Cancer Kontrol fra Ministeriet for sundhed, arbejde og velfærd Japan; Prinsesse Takamatsu Cancer Research Fund, og Fonden for fremme af Cancer Research (RR: T.N.). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Ingen yderligere eksterne midler modtaget for denne undersøgelse
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
Kræft er en væsentlig årsag til de menneskelige dødsfald i. mange lande. Genekspressionsprofiler fra mikromatrice er individualiseret og nyttige til diagnosticering og prognosticering af sygdomme [1]. Selv om nogle kunstige faktorer såsom iskæmi, hypoxi, hyponutrition, og kold stress eventuelt forekomme under kirurgisk resektion og prøve transport (fig S1), har kirurgiske prøver længe været anvendt som vigtige i forbindelse med klinisk og grundforskning kræft. I overensstemmelse med en stigning på neoadjuvansterapi (i hoved og hals, esophageal, lunge, pancreas, prostata, og brystcancer), biopsiprøver er for nylig blevet bydende nødvendigt for kræft transkriptom. På den anden side, både biopsi og kirurgiske prøver er tilgængelige til ekspression profilering til forudsigelse kliniske resultat af adjuverende terapi (i mave, tyktarm, lever, blære, pankreas, hjerne, nyre, ovarie, cervical, og brystcancer). Målene for microarray analyse var, for de sidste ti år, for det meste kirurgisk samplesfrom udviklingen og udbredelsen af to typer af microarray: oligonukleotid [2], [3] og cDNA [4], [5]. Men om et stort antal akkumulerede kirurgisk prøve udtryk profiler er nyttige for forudsigelse ved brug af biopsiprøver fra forbehandlede patienter er stadig uklart, fordi lidt er blevet gjort om sammenlignende genekspression profilering mellem de to slags prøver.
kemostråleterapi (CRT) efterfulgt af kirurgi er den standardbehandling for esophageal cancer i de vestlige lande. I Japan neoadjuverende kemoterapi efterfulgt af kirurgi og endelig CRT er de standardbehandlinger [6], og for lokalt avancerede esophageal kræftformer (Stage II eller III), kirurgi var den standardbehandling der ca. 5 år siden [7]. Det giver os mulighed for at opnå både biopsi og kirurgiske prøver fra esophageal kræftpatienter og sammenligne genekspressionsprofiler mellem disse to slags prøver. Her rapporterer vi, at kunstigt fremkaldt epitelial-mesenkymale overgang (aiEMT) forekommer i kirurgiske prøver. Dens tilstedeværelse har der muligvis forstyrret ikke kun med microarray- eller immunohistochemistory-baserede klinisk forskning, men også med grundforskning.
Resultater
Sammenligning af Expression Profiler mellem biopsi og Kirurgisk resektion Esophageal Tumor prøver fra Forskellige Cases
Vi først sammenlignet genekspression profiler mellem 35 friske biopsi prøver indeholdende nogen nekrotisk læsion og 66 kirurgiske esophageal tumor prøver, som blev indhentet fra en margin på tumoren efter eksponering i 4-7 timer under en iskæmisk tilstand ved uovervåget klyngedannelse med 3.126 forarbejdede gener (materialer og metoder). Der var ingen signifikant forskel i kliniske eller patologiske fordeling etape mellem disse to sæt af esophageal kræft, fordi lokalt avancerede tumorer (Stage II eller III) er vigtige mål for både kemo- og stråleterapi og kirurgi [8] – [10]. Tres af de 66 kirurgiske prøver (90,9%) og 29 af de 35 biopsiprøver (82,9%) optrådt i en (venstre) og b (højre) prøve klynge, (figur 1A). For at undersøge antallet af differentielt udtrykte gener mellem disse to typer af prøver med reproducerbarhed, sammenlignede vi ekspressionsprofiler blandt tre uafhængige prøvesæt (A, B, og C): anden 20 biopsiprøve indstillet versus tre kirurgiske prøvesæt (A, B, og C), der indeholder 20 tilfældigt udvalgte sager fra de 66 sager (figur 1B, øvre). Antallet af differentielt udtrykte gener udvalgt af U-test (p 0,01) var 2, 295, 2.328, og 2, 245 i sæt A, B, og C, henholdsvis. Blandt disse 3 sæt, blev 1.495 gener (65,1% i A, 64,2% i B, og 66,6% i C) almindeligvis identificeret (figur 1B, øvre). Derfor blev mere end 20% (1.495 /6.000, 24,9%) af generne differentielt udtrykt mellem biopsi og kirurgiske prøver, fordi det gennemsnitlige antal af detekterbare gener i hvert tilfælde var ca. 6.000. Disse resultater antydede, at der eksisterer en stor forskel mellem den biopsi og kirurgiske prøver.
(A) Unsupervised klyngedannelse med 3.126 forarbejdede gener. Kirurgiske (a) og biopsiprøve klynger (b) er vist. (B) Sammenligning af ekspressionsprofiler blandt tre uafhængige sæt (A, B, og C): et tilfældigt valgt 20-biopsiprøve indstillet versus tre kirurgiske prøvesæt (A, B, og C) indeholdende 20 uafhængige tilfælde. Antallet af differentielt udtrykte gener udvalgt af U-test (p 0,01): 2, 295 i sæt A, 2328 i sæt B, og 2, 245 i sæt C (Øvre). Antallet af differentielt udtrykte gener med en 3-gange ændring mellem to gennemsnitlige signalintensiteter: 297, 273, og 300. Clustering resultater med disse gensæt (lavere). (C) opreguleret gener i kirurgisk eller biopsiprøver. Ved brug af alle profilerne under stringente selektionsbetingelser (se Materialer og metoder) blev 38 og 219 gener identificeret som op-regulerede gener i biopsi og kirurgiske prøver.
Fra 1.495 gener, vi yderligere valgt differentielt udtrykte gener blandt de 3 sæt, der havde en 3-gange ændring mellem to gennemsnitlige signalintensiteter for hvert gen mellem biopsi og kirurgiske prøver. Fra sæt A, B, og C, 297, 273, og 300-generne identificeret henholdsvis (figur 1B, lavere). Mere end 80% af disse gener var overudtrykt i de kirurgiske prøver, hvilket tyder på en privilegeret tilstedeværelse af kunstige faktorer eller en forurening af normale portioner.
For at løse rationalet for forskellen, vi endelig udvalgte gener, der udtrykte fortrinsvis i alt 35 biopsi eller 66 kirurgiske prøver under stringente betingelser med U-test (p Men den resterende 2 par viser ikke en sådan forskel (data ikke vist). Derfor blev aiEMT der fandt sted i de kirurgiske prøver i mRNA niveau menes at påvirke kun en delmængde af kirurgiske prøver i niveauet af EMT-relaterede proteiner.
Ved stringent udvælgelse (se materialer og metoder), 41 og 716 gener blev identificeret som op-regulerede gener i biopsi og kirurgiske prøver henholdsvis.
(A) Expression mønstre af 2 repræsentative EMT regulatorer (
ZEB1
og
ZEB2
), 8 typiske EMT markører herunder fibronektin (
FN
), vimentin (
VIM
), 3 kollagener (
COL1A2
,
COL3A1
og
COL14A1
),
FBN1
,
MYH11
, og
ACTC1
, og 2 EMT-relaterede myogene transkriptionsfaktorer (
MEOX2
MEF2C
). (B) Kvantitative realtid RT-PCR resultater af
ZEB1, ZEB2, FN, og VIM
. Lukket kasse: kirurgisk prøve; Åbn:. Biopsiprøve
IHC af vimentin i en yderligere kirurgisk prøve, som indeholdt normale portioner, viste, at normale øsofageale epitelceller ikke blev farvet, men invasive tumorceller var (A, B). I 3 ud af 5 par af biopsi og kirurgiske prøver, overekspression af vimentin blev observeret i de kirurgiske prøver. (Biopsi: C, E, G, kirurgiske: D, F, H)
over-ekspressionen af
ZEB1
,
ZEB2
, og
TWIST1
i kirurgisk resektion normale væv
Vi opnåede 4 biopsi prøver og 5 kirurgiske prøver af ikke -cancerous væv og sammenlignet deres udtryk profiler. På samme måde med de ovennævnte udtryk profiler af tumorvæv (figur 2, 4, S2, og S3), tre EMT regulatorer (
ZEB1
,
ZEB2
, og
TWIST1
) og to typiske EMT markører (
VIM
og blev fundet
FN
), der skal overudtrykt i de 5 kirurgiske prøver (figur 6A). Vores tidligere rapport, der viser inddragelsen af ZEB2 og TWIST1 i EMT af normale og maligne esophageal epitelceller [9] understøtter tilstedeværelsen der kunstigt induceret EMT.
(A) Over-ekspressionen af EMT-regulatorer (
ZEB1
,
ZEB2
, og
TWIST1
) og EMT-markører (
VIM
FN
) i kirurgisk resektion normal esophagus slimhinde. (B) Induktion af mus
Zeb1
,
Zeb2
,
Vim
, og
Fn
under iskæmisk tilstand. Efter resektion af mus spiserøret, placeret vi det på PBS for 0 eller 4 timer ved stuetemperatur (under en iskæmisk tilstand), straks gjort frosne snit, erobrede epitelcelle lag (øverst) ved laser mikrodissektion, forstærkes mRNA ved TALPAT [24] – [28], og opnåede udtryk profiler ved hjælp af musen Expression Array 430 2,0 (Affymetrix, Santa Clara, CA). Eksperimenter blev udført på 3 mus.
Zeb1
,
Zeb2
, Vim
og
Fn
gener induceres 4 timer efter resektion (Nedre). *
P
0,05. (C) Kvantitativ realtids RT-PCR af
Zeb1
,
Zeb2
,
Vim
, og
Fn
. Over-ekspressionen af
Zeb1
,
Zeb2
,
Vim
, og
Fn
, vist ved microarray, blev bekræftet.
Endelig, for at undersøge, om disse 5 gener induceres i epitelceller ved kirurgisk resektion-relateret iskæmi, vi resektion en mus spiserøret, og placeret den på PBS for 0 eller 4 timer, og straks stilles frosne snit efterfulgt af laser-fanget mikrodissektion af de epiteliale cellelag (figur 6b, øvre). Expression profiler af de mus epitel cellelag på 0 eller 4 timer efter resektion afslørede, at mus
Zeb1
,
Zeb2
,
Vim
, og
Fn
blev induceret 4 timer efter resektion (figur 6b, lavere). Kvantitativ real-time RT-PCR bekræftede overekspression af
Zeb1
,
Zeb2
,
Vim
, og
Fn
efter resektion (figur 6C) . Da den samlede følsomhed muse Affymetrix arrays er kendt for at være lavere end i mennesker, og anvendelse af en lille mængde RNA, såsom laser-indfanget individer vides også at reducere microarray følsomhed,
Twist1
mRNA selv kunne ikke påvises i denne mus eksperiment (data ikke vist).
for at undersøge om aiEMT i mRNA-niveauer påvirker IHC, udførte vi IHC på en typisk mesenchymale markør vimentin 8 timer efter resektion. Her bestemmes vi betingelser, hvorunder normale epitel celle lag farves. I alle de 3 uafhængige undersøgte prøver, blev den normale epitelceller cellelag ikke fundet farves stærkt 8 timer efter resektion (Figur 7A-C). Forskellen mellem mRNA niveauet og protein niveau kan forklares ved følgende to grunde: 1), selv om udifferentierede lag (basal og parabasale) er blevet rapporteret til at udtrykke EMT-relaterede gener, herunder
VIM
[4], deres ekspressionsniveauer var meget lavere end tumor (figur 5B). 2) Det kan også være svært at vise den omtrentlige 2-gange ændring i mRNA-niveauet (figur 6B, C) som i proteinniveauet ved IHC, fordi IHC er ringere end RT-PCR i både følsomhed og kvantificering.
efter resektion af mus spiserøret, placeret vi det på PBS for 0, 4, 8 timer ved stuetemperatur (under en iskæmisk tilstand), straks stilles frosne snit, og IHC af vimentin blev udført under mere følsomme betingelser som figur 5 . Eksperimenter blev udført på 3 mus (A-C). Over-ekspressionen af vimentin i musen esophageal epitel ikke blev observeret selv efter 8 timers eksponering under en iskæmisk tilstand. Pil: vimentin-positive glat muskulatur, pilehoved:. Mus stratificeret øsofageale epiteliale cellelag
Alle de resultater antyder, at EMT, især i mRNA-niveauet, induceres kunstigt i både normale og maligne epitel celler ved kirurgisk resektion hændelser (iskæmi-induceret hypoxi og hyponutrition, og hypoxi-induceret inflammation, etc.).
Kunstigt induceret EMT (aiEMT) ved kirurgisk resektion Forhindrer Microarray-baserede undergruppe Identifikation
Identifikation af klinisk signifikante undergrupper er meget vigtigt for personlig medicin og for lægemiddeludvikling mod vanskelige sager. Når vi anvendt udtrykket profiler af de 35 biopsi prøver fra patienter behandlet af kemo- og stråleterapi [8], uovervåget klyngedannelse med 5.570 forarbejdede gener (materialer og metoder) identificerede en god responder gruppen bestående af 9 patienter (7/9, 78% viser fuldstændig reaktion på kemostråleterapi) fra 35 (figur 8A, venstre). Men når profilerne af 66 kirurgiske prøver blev anvendt, uovervåget klyngedannelse med 2.016 forarbejdede gener kunne ikke påvise nogen undergruppe (figur 8A, højre). Således biopsiprøve ekspressionsprofiler syntes at være mere effektiv i undergruppe identifikation end de kirurgiske prøver. Faktisk vi tidligere rapporteret, at biopsi prøve udtryk profiler kunne skelne langsigtede eller kortsigtede overlevende ved en endelig kemostråleterapi [8]; dog kirurgiske prøve ekspressionsprofiler aldrig identificeret dårlige prognostiske undergrupper med omfattende lymfeknudemetastase [10]. Desuden i de kirurgiske prøver blev EMT accelereret i 36 (85,7%) ud af 42 esophageal kræft [9]. Denne høje procentdel synes at være forårsaget af aiEMT.
(A) Unsupervised gruppering af 35 biopsi og 66 kirurgisk resektion esophageal tumor prøver med 5.570 og 2.016 forarbejdede gener hhv. En prøve klynge med 2.971 gener forekommer kun i de biopsi prøver. (B) Sammenligning af antallet af behandlede gener for uovervåget etablering af samarbejde mellem biopsi og kirurgiske prøver. Antallet af behandlede gener og almindeligt udvalgte gener er indikeret. (C) Frekvens fordeling for procentdel af prøver af færdigbehandlet-gen sæt. Hver distribution af 5, 570 gener i biopsiprøver (venstre) og 2.016 gener i kirurgiske prøver (højre) er angivet.
For at løse grunden undergruppe er vanskeligt i kirurgiske prøver, vi sammenlignet antallet og fordeling af hvert af de forarbejdede gener, som blev brugt til uovervåget klyngedannelse. Vi først valgte gener med en signalintensitet på over 1.000 i mere end 10% af prøverne. Fra 35 biopsi og 66 kirurgiske prøver, 6.551 og 4.797 gener henholdsvis blev udvalgt. Fra disse gener, vi endelig valgt mere end 3-fold ændrede gener ved at sammenligne den gennemsnitlige signalintensitet af hvert gen i mere end 10% af prøverne. I de 35 biopsiprøver, 85% (5570) af 6.551 først forarbejdede gener forblev, mens antallet af endelige forarbejdede gener faldet fra 4.797 første forarbejdede gener til 2016 (42%) (figur 8B, øvre). Af de 2.016 endeligt forarbejdede gener i de kirurgiske prøver blev 1.724 (86%), som indgår i de 5.570 endeligt forarbejdede gener i biopsiprøver; dog 3.846 (69%) af 5,570 gener var unikke for de biopsiprøver (figur 8B, lavere). Endvidere frekvensfordelingen (for procentdelen af prøver) af disse to færdigbehandlet-gensæt viser, at ca. 60% af de 2.016 forarbejdede gener i de kirurgiske prøver udtrykker i kun et begrænset antal tilfælde (0-10%) (figur 8C) . Følgelig kan aiEMT i kirurgiske prøver mindske antallet af behandlede gener nyttige for undergruppe identifikation.
Diskussion
Vi har for nylig rapporteret tilstedeværelsen af krydstale mellem Hedgehog (Hh) og EMT signalering i normal og malign epitelceller i spiserøret [9]. I denne rapport,
ZEB2
viste sig at være en nedstrøms gen af både en primær transkriptionel transducer GLI1 i Hh-signalering og anden EMT regulator, TWIST1, og at ZEB2 yderligere opreguleret 5 kemokin eller vækstfaktorreceptorer,
PDGFRA
,
EDNRA
,
CXCR4
,
VEGFR2
, og
trkB
(Figur S4). HH signalet blok inhiberede esophageal keratinocytdifferentiering og cancercelleinvasion og vækst. Derfor overekspression af
ZEB2
og
TWIST1
i kirurgiske prøver af både normale og tumorvæv kan fremkalde EMT, hvilket resulterer i overekspression af repræsentative EMT markører
VIM
,
FN
, og
cols
(figur 2, 4, 6, S2, og S3) og membran signal transducere
IL8
,
CXCL4
,
CCL5
,
CXCR4
,
PDGFRB
, og
TLR2
(figur 2). Over-ekspression af membranen signaltransducere kan aktivere yderligere nedstrøms kaskader. Dette er en væsentlig årsag til den store forskel på udtryk profiler mellem biopsi og kirurgiske prøver (figur 1 og 3).
Omfattende forurening af normale mesenkymale dele i kirurgisk resektion tumorvæv kan også forklare den overekspression af dem EMT regulatorer og EMT-beslægtede gener, selvom trænede patologer omhyggeligt udskårne prøver bulk-væv fra de vigtigste tumor, hvilket giver en klar margin fra det omgivende normale væv (materialer og metoder). Imidlertid blev over-ekspression observeres også hos kirurgisk resektion normale væv og mus epiteliale cellelag 4 timer efter resektion (figur 6). Derfor konkluderede vi, at kunstigt induceret EMT, betegnet aiEMT, forekom i både normale og maligne epitelceller fra de kirurgisk resektion bivirkninger (iskæmi-induceret hypoksi, iskæmi-induceret hyponutrition, og hypoxi-induceret inflammation, etc.) (fig S1 ).
for nylig har de hypoxi-inducerbare faktorer (HIF-1A eller HIF-2A) blevet rapporteret at direkte regulere TWIST1 [13], [14] og LOXL2, som efter sigende stabiliserede en EMT regulator, SNAI1 /SNEGLEN, gennem fysisk interaktion på SLUG domæne og snegl lysinrester K98 og K137 [15]. Den SNAI1 bindingssted blev også fundet i 5′-promotorregionen af
ZEB2
[16]. Over-ekspressionen af både
HIF1A
LOXL2
blev kun observeret i kirurgisk resektion tumorvæv opnået fra forskellige tilfælde (Figur S5). Desuden andre
HIF1
familier (
HIF1B
HIF2A
) blev aldrig over-udtrykt i nogen af de kirurgiske prøver. Derfor udredning af de molekylære mekanismer i aiEMT i kirurgiske prøver stadig til fremtidige undersøgelser. Vi bemærkede dog, at iskæmi-induceret hypoxi og /eller betændelse er blevet rapporteret til at frigive undertrykkelse af NFKB [17], som regulerer
ZEB1
,
ZEB2
, og
TWIST1
[18], [19], og at TGF-β-signalering kan være involveret i aiEMT, fordi overekspression af
NFKB1
TGFBR2
blev fundet i kirurgiske prøver (Figur S6).
som nævnt i indledningen, kirurgiske prøver er blevet brugt som vigtige emner for klinisk forskning og grundforskning kræft i mange år. Derfor kan aiEMT i kirurgiske prøver er muligvis forstyrret eller ikke alene afskåret microarray- eller immunhistokemi-baserede kliniske forskning (diagnostisk markør identifikation, undergruppe, hvilket gør prædiktorer, og prognose evaluering, etc.), men også grundforskning (gør et signal pathway kort , terapeutisk mål identifikation, etc.). Denne undersøgelse vil sandsynligvis fremkalde grundlæggende fejlfortolkning herunder undervurdering af den prognostiske evaluering magt markører ved overvurdering af EMT i tidligere kræftforskning, og vil give nogle råd til den nærmeste fremtid som følger: 1) Forståelse hvor længe væv var under en iskæmisk tilstand ( fra start af resektion til lager eller RNA forberedelse). Den samlede tid bør aldrig overstige 4 timer. 2) Udbredelsen af biopsiprøver for
in vivo
udtryk profilering med lave fordomme om grundforskning og klinisk forskning; for eksempel til kliniske resultat forudsigelse af ikke blot neoadjuverende men også adjuverende kemoterapi, strålebehandling, og kemostråleterapi som i tidligere beretninger [8], [20] – [23]. 3) Kontrol cancer celleindhold og normal- eller nekrotisk væv forurening i biopsiprøver for udbredelsen. I sampling af en nål biopsi, bør indhentes tumor portioner (2mm x 2mm) fra en margen (omkreds) af tumoren ved udelukkelse af centrale nekrotiske læsioner under endoskopi. Hvis nekrotiske læsioner alvorligt var forurenet i prøverne, bør disse prøver udelukkes ved at kvantificere og kvalificere RNA. Hvis prøverne indeholdt omfattende normale læsioner, kan sådanne prøver udelukkes ved udtrykket profil-baserede scoring metode hjælp af normale og /eller tumor specifikke gener.
Materialer og Metoder
vævsprøver
Alle kræft i spiserøret (planocellulære karcinomer) og ikke-kræft væv blev leveret af det centrale Sygehus eller East Hospital på National cancer center efter at have indhentet skriftligt informeret samtykke fra hver patient og godkendelse af center s etiske komité.
alle kirurgiske prøver blev opnået fra patienter uden neoadjuvansterapi, og alle biopsi prøver blev opnået før behandling. For de kirurgiske prøver, trænede patologer omhyggeligt udskåret bulk- vævsprøver fra den vigtigste tumor, hvilket giver en klar margin fra det omgivende normale væv. Således har vi fået kirurgiske prøver fra en margin (omkreds) af tumoren. For nål biopsi prøver blev tumor portioner (2 mm x 2 mm) opnået under endoskopi fra en margin på tumoren ved udelukkelse af eventuelle centrale nekrotiske læsioner. Hvis prøverne blev alvorligt forurenet med nekrotiske læsioner, blev disse prøver udelukket ved at kvantificere og kvalificere RNA. Hvis prøverne indeholdt omfattende normale læsioner, vi udelukkede sådanne prøver ved udtrykket profil-baserede scoring metode hjælp af normale og /eller tumor specifikke gener (under forberedelse).
Den overordnede proces, en kræft i spiserøret operation kræver megen tid . Derfor blev kirurgiske prøver udskåret fra en margin på tumoren ved uddannede patologer efter udsættelse i 4-7 timer under en iskæmisk tilstand, og blev straks frosset ved -80 ° C indtil anvendelse. Tværtimod blev nålen biopsiprøver reseceret under endoskopi straks frosset ved -80 ° C indtil anvendelse. Klinisk-patologisk oplysninger gives i tabel S3, S4, S5.
Laser mikrodissektion efterfulgt af RNA Extraction og Forstærkning
Cryostatsektioner (8 pm) af frosne mus esophageal prøver blev laser-mikrodissekeres med mmi CellCut systemet (MMI Inc., Rockledge, FL). Totalt RNA blev isoleret ved at suspendere cellerne i en ISOGEN lyseringsbuffer (Nippon Gene, Toyama, Japan) efterfulgt af udfældning med isopropanol. RNA blev amplificeret ved en effektiv fremgangsmåde til high-fidelity-mRNA-amplifikation, kaldet TALPAT (T7 RNA polymerase promoter-bundet, adaptorligering-medieret, og PCR-amplifikation efterfulgt af
in vitro
T7-transkription) [24-28 ]
microarray analyse
genekspression profiler blev opnået fra 166 prøver:. tumor sæt (forskellige tilfælde) af uafhængige 35 og 20 biopsi prøver og 66 kirurgiske prøver, en anden tumor sæt (identisk sag) af 18 biopsiprøver og 18 kirurgiske prøver, en normal sæt af 4 biopsiprøver og 5 kirurgiske prøver. Totale RNA’er ekstraheret fra bulk vævsprøver var biotinmærket og hybridiseret til high-density oligonukleotid mikroanalyse (Human Genome U95Av2 eller U133PLUS2.0 Array, Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) i overensstemmelse med producentens anvisninger. For laser-fanget mus esophageal epitel cellelag blev Mouse Genome 430 2.0 Array brugt. De scannede data af arrayene blev forarbejdet af Affymetrix Microarray Suite 4.0 eller 5.0, som skaleres den gennemsnitlige intensitet af alle gener på hvert array til et mål signal på 1.000 til pålideligt sammenligne variable multiple arrays. Alle microarray data er blevet deponeret i en MIAME kompatibel database, GEO; tiltrædelsen nummer SuperSeries GSE22954.
Gene Selection fra Microarray Data og Hierarkisk Clustering
Hierarkisk klyngedannelse er almindeligt anvendt som en af de uovervågede læringsmetoder. Hierarkisk gruppering af microarray data blev udført ved brug af GeneSpring (Agilent Technologies Ltd., CA, USA), Microsoft Excel, og Cluster TreeView software [29] .For opsyn klyngedannelse (figur 1A og 8A), vi først udvalgte gener med et signal intensitet på mere end 1.000 i mere end 10% af prøverne, og fra disse gener, vi endelig valgt mere end 3 gange ændrede gener ved at sammenligne den gennemsnitlige signalintensitet af hvert gen i mere end 10% af prøverne. For overudtrykte gener i de kirurgiske eller biopsiprøver, vi først udvalgte gener ved U-test (p 0,01), permutation test, og 2- eller 3-gange ændring mellem de gennemsnitlige signalintensiteter for de to sæt prøver, og fra første valgte gener vi endelig valgte gener med mere end 1.000 i gennemsnit signalintensitet.
Semi-kvantitative og kvantitativ RT-PCR
Totalt RNA blev isoleret ved at suspendere cellerne i Isogen lysepuffer (Nippon Gene, Toyama, Japan) efterfulgt af udfældning med isopropanol.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.