PLoS ONE: Hsp90 er en ny Target Molecule of CDDO-Me hæmme spredning af kræft i æggestokkene Cells

Abstrakt

Syntetisk triterpenoid methyl-2-cyano-3, 12-dioxooleana-1, 9 (11) -dien-28-oat (CDDO-Me) er blevet vist som et lovende middel mod kræft i æggestokkene. Imidlertid er den underliggende mekanisme ikke godt forstået. Her viser vi, at CDDO-Me direkte interagerer med Hsp90 i celler ved cellulær termisk ændring-assayet. CDDO-Me behandling fører til opregulering af Hsp70 og nedbrydning af Hsp90 klienter (ErbB2 og AKT), der angiver hæmning af Hsp90 af CDDO-Me i celler. Knockdown af Hsp90 hæmmer markant celledeling og forbedrer anti-spredning effekt af CDDO-Me i H08910 æggestokkene cancerceller. Dithiothreitol inhiberer interaktionen af ​​CDDO-Me med Hsp90 i celler og ophæver CDDO-Me induceret opregulering af Hsp70, nedbrydning af Akt og celleproliferation inhibering. Dette tyder anti-kræft i æggestokkene effekt af CDDO-Me er muligvis medieret af dannelsen af ​​Michael addukter mellem CDDO-Me og reaktive nucleofiler på Hsp90. Denne undersøgelse identificerer Hsp90 som en ny target protein CDDO-Me, og giver en ny indsigt i virkningsmekanismen for CDDO-Me i æggestokkene cancerceller

Henvisning:. Qin DJ, Tang CX, Yang L, Lei H, Wei W, Wang YY, et al. (2015) Hsp90 er en ny Target Molecule of CDDO-Me hæmme spredning af æggestokkene cancerceller. PLoS ONE 10 (7): e0132337. doi: 10,1371 /journal.pone.0132337

Redaktør: L. Michel Espinoza-Fonseca, University of Minnesota, UNITED STATES

Modtaget: May 9, 2015; Accepteret: 12 juni 2015; Udgivet: 2 juli 2015

Copyright: © 2015 Qin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. (. NO 2015CB910403, 2013CB910903) nationale Basic Research Program Kina (973 Program), National Natural Science Foundation of China (91.313.303, 31.100.980, 81.272.886), Videnskab og Teknologi Komité Shanghai (11JC1406500, 13431900501, 13ZR1456900)

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene er en af de førende årsager til kræftdødsfald fra gynækologisk malignitet. Trods store fremskridt i kemoterapi og kirurgisk behandling, 70 til 90% af kvinder med kræft i æggestokkene vil præsentere et komplet respons efter første behandling og udvikle tilbagefald inden for 2 år og 5-års overlevelsesraten for patienter med fremskreden kræft i æggestokkene fortsat på ca. 30% [1]. I USA anslås 22, blev 000 nye tilfælde af kræft i æggestokkene forudsiges at blive diagnosticeret i 2014 resulterer i ~ 14, 000 dødsfald i forbindelse med denne sygdom [2]. Derfor, for at forbedre resultaterne for kvinder med fremskreden kræft i æggestokkene, er blevet afsat en betydelig indsats for at identificere protein målrettede agenter [3].

Heat shock protein 90 (Hsp90) er en meget evolutionært konserveret chaperone protein og er den mest velundersøgt medlem af varmechokprotein familie. Som en ATP-afhængig molekylære chaperone, Hsp90 spiller en kritisk rolle i modningen, stabiliteten, og aktivering af en række forskellige klient proteiner. Selvom rigeligt udtrykt i normale celler, dets overekspression i maligne celler fremmer vedvarende aktivering af mange cellulære kinaser og transkriptionsfaktorer fra malignitet-induceret cellulære belastninger [4]. Interessant nok mange klienter eller interaktionskandidater af Hsp90, såsom epidermal vækstfaktorreceptor (EGFR), human epidermal vækstfaktor receptor 2 (ErbB2), den mammalian target of rapamycin (mTOR) og signal transducer og aktivator af transkription 3 (STAT3), har været impliceret i patogenesen af ​​ovariecancerceller [5-7] og forhøjet Hsp90 niveau er almindelig i peritoneale og pleurale effusioner af patienter med fremskredent ovariecancerceller [8]. Hsp90 er blevet betragtet som et attraktivt mål for ovariecancer [9-10].

C-28 methyl ester af 2-cyano-3, 12-dioxoolen-1, 9-dien-28-syre ( CDDO-Me) er et nyt syntetisk oleanane triterpenoid. CDDO-Me er i øjeblikket i sen-fase klinisk udvikling til behandling af kronisk nyresygdom [11-13], og i fase I /II kliniske forsøg for maligne sygdomme [14-15]. CDDO-Me udviser cytotoksicitet over for en række forskellige cancerceller, herunder ovariecancer [16-17], prostatacancer [18] leukæmi [19], brystcancer [20], lungecancer [21], pancreascancer [22-23] uden manifesterer nogen toksicitet i normale celler. De mekanistiske undersøgelser har afsløret, at CDDO-Me er en multitarget forbindelse. Interessant, nogle proteiner, der berøres af CDDO-Me såsom ErbB2, Akt, STAT3 og mTOR [17] er kunder hos Hsp90. Derfor vi spekuleret på, at Hsp90 kunne være et mål af CDDO-Me, som bidrager til de forskellige aktiviteter CDDO-Me.

I denne undersøgelse har vi påvist, at Hsp90 er et nyt mål protein CDDO-Me i ovariecancerceller, hvilket bidrager til den anti-cancer effekt af CDDO-Me i æggestokkene cancerceller.

Materialer og metoder

Cell kultur

menneskelige epitelial ovariecancerceller SKOV3 blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). HO8910 cellelinje blev opnået fra Shanghai Cell Culture Collection (Shanghai, Kina). HO8910 cellelinie blev dyrket i RPMI-1640 (Gibco, Foster City, CA) suppleret med 10% (vægt /volumen) føtalt bovint serum (FBS, Gibco) og 1% penicillin-streptomycin (Gibco). SKOV3-cellelinien blev dyrket i McCoys 5A (Gibco, Foster City, CA) suppleret med 10% (vægt /volumen) føtalt bovint serum (FBS, Gibco) og 1% penicillin-streptomycin (Gibco). Alle cellelinjer blev holdt ved 37 ° C i en fugtig atmosfære med 5% CO

2.

Western Blotting

Celler blev vasket med PBS og lyseret med lyseringsbuffer (50 mM Tris HCI, pH 6,8, 100 mM DTT, 2% SDS, 10% glycerol). Cellelysater blev centrifugeret ved 20.000 i 10 min, og proteiner i supernatanterne blev kvantificeret. Proteinekstrakter blev ligeledes lastet til 8% til 12% SDS-polyacrylamidgel, elektroforeret og overført til nitrocellulosemembran (Bio-Rad). Blottene blev farvet med 0,2% Ponceau S rød for at sikre lige protein loading. Efter blokering med 5% fedtfri mælk i PBS, blev membranerne probet med antistoffer mod Hsp90 (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA), Hsp70 (Santa Cruz Biotech), vinculin (Santa Cruz Biotech), Akt (Santa Cruz Biotech), ErbB2 (Cell Signaling, Beverly, MA), Erk (Cell Signaling), phosphoryleret Erk (Cell Signaling). Signalerne blev detekteret med et kemiluminescens phototope-HRP kit (Cell Signaling) ifølge producentens instruktioner. Som var nødvendigt, blev blots strippet og testet igen med anti-β-actin antistof som intern kontrol. Alle forsøg blev gentaget tre gange med lignende resultater.

Cellular termisk ændring-assayet (CETSA)

PBS fortyndet HO8910 cellesuspensioner var fryse-optøet tre gange med flydende nitrogen. Den opløselige fraktion (lysat) blev separeret fra cellerester ved centrifugering ved 20, 000 x g i 20 minutter ved 4 ° C. Cellelysaterne blev fortyndet med PBS og inddelt i to alikvoter, med en aliquot behandlet med DMSO og den anden alikvot med CDDO-Me (25 uM). Efter 10-30 minutters inkubering ved stuetemperatur blev de respektive lysater blev opdelt i mindre portioner (30 pi) og individuelt opvarmet ved forskellige temperaturer i 3 min (Veriti termisk cyklusapparat, Applied Biosystems /Life Technologies) efterfulgt af afkøling i 3 minutter ved stuetemperatur . De passende temperaturer blev bestemt i præliminære eksperimenter CETSA (data ikke vist). De opvarmede lysater blev centrifugeret ved 20, 000 x g i 20 minutter ved 4 ° C for at adskille de opløselige fraktioner fra præcipitater. Supernatanterne blev overført til nye mikrorør og analyseret ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) efterfulgt af Western blot-analyse. Dosis effekt af CDDO-Me på stabiliteten af ​​Hsp90 blev vurderet på samme måde.

For at undersøge effekten af ​​DTT på bindingen af ​​CDDO-Me til Hsp90 i levende celler, blev HO-8910 celler behandlet med DMSO, DTT (2 mM), CDDO-Me (25 uM), eller CDDO-Me (25 uM) præinkuberet med DTT (2 mM, 30 min) i 3 timer. Derefter blev cellerne høstet og fortyndet i PBS suppleret med komplet proteaseinhibitorcocktail og opvarmet ved 63 ° C i 3 minutter, efterfulgt af afkøling ved stuetemperatur i yderligere 3 min. Cellesuspensionerne blev fryse-optøet to gange med flydende nitrogen. Lysaterne blev centrifugeret ved 20, 000 x g i 20 minutter ved 4 ° C for at adskille de opløselige fraktioner fra præcipitater. Supernatanterne blev overført til nye mikrorør og analyseret ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) efterfulgt af Western blot-analyse.

RNA-interferens og transfektion

lille interfererende RNA (siRNA) målretning human Hsp90 blev syntetiseret af BIOMICS Biotechnologies, Jiangsu, Kina. De targetingsekvenser er som følger, 5′-GUAUUGUCACAAGCACAUAdTdT-3 ‘og 5′-CGUCUCGCAUGGAAGAAGU-3’. Universel negativ kontrol siRNA (5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3 ‘) blev anvendt som kontrol. HO-8910 celler blev podet (3 × 10

5 celler /1500 pl /brønd af en 6-brønds plade), og derefter blandet med lipofectamin-RNA-kompleks opløsning [100 nM RNA, 5 pi lipo2000, 500 pi Opti- MEM /brønd], i henhold til producentens anbefalinger. Otteogfyrre timer efter transfektion af siRNA’er blev celler udsat for immunblotting assay eller andre eksperimenter.

celleproliferationsassay

HO-8910 eller SKOV3-celler blev behandlet med CDDO-Me alene eller i kombination med DTT. Celleproliferation blev bestemt ved anvendelse af en celle Counting Kit (Laboratories, Kumamoto, Japan) ifølge producentens instruktioner.

Statistisk analyse

t-test blev anvendt til at evaluere forskellen mellem to forskellige behandlinger . En

s

værdi på mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

CDDO-Me interagerer med Hsp90 i celler

For at vide, om CDDO-Me interagerer med Hsp90 i celler, CETSA, en nyudviklet metode til at evaluere lægemiddel binde til target protein i celler, blev udført. Ovariecancerceller HO8910 blev lyseret og inkuberet med DMSO eller CDDO-Me i en halv time ved stuetemperatur. Derefter blev flere portioner af cellelysat opvarmet til forskellige temperaturer. Efter afkøling blev prøverne centrifugeret for at adskille de opløselige fraktioner fra udfældede proteiner og tilstedeværelsen af ​​Hsp90 i den opløselige fraktion blev undersøgt ved Western blot. Som vist i fig 1A og 1B, sammenlignet med DMSO, tilstedeværelsen af ​​CDDO-Me markant øgede akkumulering af Hsp90 i den opløselige fraktion ved de undersøgte temperaturer. Vi tester også dosis-respons CDDO-Me på Hsp90 stabilitet til opvarmning. Som vist i fig 1C og 1D, med stigningen i CDDO-Me-koncentration, ophobning af Hsp90 markant forøget. Som en negativ kontrol, CDDO-Me ikke kunne forøge stabiliteten af ​​vinculin i celler. Disse data antyder, at CDDO-Me direkte interagerer med Hsp90 i celler.

CETSA blev udført på HO8910 celler som beskrevet i materialer og fremgangsmåder. Stabiliseringen virkning CDDO-Me on Hsp90 og vinculin ved forskellige temperaturer (A) og forskellige doser (C) blev vurderet ved Western blot. Intensiteten af ​​Hsp90 båndene blev kvantificeret ved mængden én software (B, D). Hvert forsøg blev gentaget som mindst tre gange.

CDDO-Me hæmmer Hsp90 i celler

Et af kendetegnene ved Hsp90 hæmning er induktion af Hsp70 og har været anvendt dette svar som biomarkør for mange Hsp90 inhibitor kliniske forsøg [24]. Hvis CDDO-Me inhiberer Hsp90, kan det opregulere ekspression af Hsp70. Faktisk CDDO-Me behandling fører til opregulering af Hsp70 i en dosis og tid afhængig måde (Fig 2A og 2B), som ligner den, der observeres i STA-9090, et kendt Hsp90 inhibitor, behandlet SKOV3 og HO8910 celler (S1 Fig ). En anden kendetegnende for Hsp90 hæmning er nedbrydningen af ​​kundens proteiner [25]. Nogle af dem, ligesom ErbB2 er blevet rapporteret at være meget følsomme over for Hsp90 inhibition, hvorimod andre som Akt rapporteres at være mindre følsomme [26-27]. Vi undersøgte proteinniveauet i ErbB2 og Akt i CDDO-Me behandlede celler. Ekspression af ErbB2 kan påvises i SKOV3-celler, men ikke i H08910 celler (data ikke vist). CDDO-Me behandling fører til nedgang i ErbB2 protein i en dosis og tid afhængig måde i SKOV3-celler (Fig 2C og 2D). På Akt protein, CDDO-Me behandling fører til faldet af Akt i en dosis og tid afhængig måde i begge HO8910 celler (fig 2A og 2B) og SKOV3-celler (Fig 2C og 2D). Disse data antyder, at CDDO-Me inhiberer Hsp90-aktivitet i ovariecancerceller.

AD, HO8910 og SKOV3-celler blev behandlet med CDDO-Me at anden dosis (A, C) og anden tid (B, D), og de angivne proteiner blev påvist ved western blot. Hvert forsøg blev gentaget som mindst tre gange.

Knockdown af Hsp90 på effekten af ​​CDDO-Me på ovariecancerceller

For at bestemme om hæmning af Hsp90 korreleret med CDDO-Me induceret inhibering af celleproliferation, anvendtes RNA-interferens at reducere Hsp90 ekspression i HO8910 celler. Som vist i fig 3A, blev Hsp90-protein specifikt reduceret med Hsp90-targeting siRNA (HO8910

siHsp90) sammenlignet med den ikke-specifikke siRNA (HO8910

sinc). Sammenlignet med vektoren transficerede celler, knockdown af Hsp90 signifikant inhiberede cellevækst (figur 3B) og et forstærket CDDO-Me induceret proliferation inhibering (fig 3C) i HO8910 celler. Disse data antyder, at Hsp90 bidrager til CDDO-Me induceret proliferation inhibering i ovariecancercelle.

HO8910 celler blev transficeret med kontrol siRNA (HO8910

sinc) eller Hsp90 specifikke siRNA (HO8910

siHsp90), derefter behandlet med eller uden CDDO-Me angivne antal gange. De angivne proteiner blev påvist ved western blot og intensiteten af ​​båndene blev kvantificeret ved mængden én software (A). Celleproliferation blev undersøgt ved CCK-8 assay (B, C). Hvert eksperiment blev gentaget som mindst tre gange.

# p 0,05, sammenlignet med kontrol siRNA transficerede celler

Samspillet mellem CDDO-Me med Hsp90 i æggestokkene cancerceller ved sine a, p-umættede carbonylgrupper på ringene A og C.

struktur-aktivitet analyse har vist, at den a, p-umættede carbonylgrupper på ringene A og C er nøglen til aktiviteten af ​​CDDO-Me (fig 4A) [11]. DTT kunne danne reversible addukter med CDDO-Me a, p-umættede carbonylgrupper og ophæver dets aktivitet. For at teste om interaktionen af ​​CDDO-Me med Hsp90 i levende celler afhænger af den α, β-umættet carbonyldel, CDDO-Me (25 uM) præinkuberet med eller uden DTT (2 mM) blev anvendt til behandling HO8910 celler efterfulgt med CETSA undersøgelse. Faktisk DTT kunne ophævede den stabiliserende virkning af CDDO-Me on Hsp90 (Fig 4B). I overensstemmelse hermed DTT behandling inhiberede fuldstændigt CDDO-Me (2 uM) inducerede stigning af Hsp70 (Fig 4C og 4D) og inhibering af celleproliferation (Fig 4E og 4F). DTT har været meget anvendt som antioxidant til at reducere ROS niveauet i celler og CDDO-Me har også vist sig at forøge ROS niveauet i celler. Således kan DTT inhibere Hsp70-ekspression ved at reducere ROS. Men H

2O

2 behandling ikke opregulere ekspression af Hsp70 (S2 Fig). Disse data antyder, at CDDO-Me kan interagere med Hsp90 gennem sine a, p-umættede carbonylgrupper.

A. Kemiske struktur af CDDO-Me. B. Living HO8910 celler behandlet med DTT, DMSO, CDDO-Me (25 uM) og CDDO-Me (25 uM) præinkuberet med DTT (2 mM), derefter blev underkastet CETSA som beskrevet i materiale og metoder. Stabilitets- ændringer i Hsp90 blev vurderet ved Western blot (B). HO8910 og SKOV3-celler blev behandlet med CDDO-Me (2 uM) i 24 timer i nærvær eller fravær af DTT (2 mM). De angivne proteiner blev påvist ved western blot (C, D) og cellelevedygtighed blev undersøgt ved CCK-8 assay (E, F). Hvert eksperiment blev gentaget som mindst tre gange. * P. 0,05

Diskussion

CDDO-Me har vist stor effekt mod en række kræftformer, herunder kræft i æggestokkene. Det underliggende virkningsmekanisme af CDDO-Me on ovariecancerceller er mindre klar. I denne undersøgelse har vi vist, at Hsp90 er et hidtil ukendt målprotein af CDDO-Me og målretning Hsp90 bidrager til CDDO-Me induceret celledød af ovariecancerceller.

Intensive undersøgelser af virkningen af ​​CDDO-Me har afsløret en masse målproteiner herunder Akt, Nrf2, PTEN, ErbB2, IKKβ, STAT3, mTOR, PPARy et.al [12]. Interessant, nogle af dem, såsom ErbB2, STAT3 og Akt er substrater af Hsp90 vi derfor postulerer, at CDDO-Me kan direkte inhibere Hsp90, som igen medierer det multiple virkning CDDO-Me. For at teste denne hypotese, vi brugte CETSA metode til at vurdere samspillet mellem CDDO-Me og Hsp90. CETSA udnytter konceptet, at målrette proteiner normalt få stabiliseret når narkotika molekyler binder. Sammenlignet med andre metoder til at bekræfte interaktionen af ​​forbindelser med små molekyler med proteiner, CETSA er mere realistisk at udføre og kan direkte måle, om et lægemiddelmolekyle nå sine mål i celler og dyremodeller [28-29]. Ved hjælp af denne metode, viste vi, at CDDO-Me interagerer med Hsp90 i celler. Dette blev yderligere understøttet af induktionen af ​​Hsp70, et univers respons observeret i celler efter behandling med Hsp90-inhibitorer, især dem rettet mod N-terminalen af ​​Hsp90 [30]. Desuden kunne kunden proteinerne af Hsp90, såsom ErbB2 og Akt, også reduceres ved CDDO-Me behandling. Foreslår derfor, vi, at CDDO-Me interagerer med Hsp90 og hæmmer dets aktivitet i celler.

Et vigtigt spørgsmål er, om samspillet mellem CDDO-Me med Hsp90 bidrager til anticancer effekt af CDDO-Me på æggestokkene cancerceller . Ligner der blev observeret i CDDO-Me behandlede celle, specifikt tavshed af Hsp90 resultater i induktion af Hsp70 og nedregulering af Akt i HO8910 celler (Fig 3A) [31-32]. Desuden kunne knockdown af Hsp90 væsentlig grad at øge udbredelsen hæmning effekt af CDDO-Me i HO8910 celler. Disse data understøtter, at målrette Hsp90 bidrager anti-kræft i æggestokkene effekt af CDDO-Me. Som CDDO-Me er en kendt flere mål sammensatte, vi ikke udelukke, at andre målproteiner også bidrage til anti-kræft i æggestokkene effekt af CDDO-Me.

CDDO-Me har to α, β- umættet carbonyldel. Den foreslåede mekanisme ligger til grund for anti-cancer effekt af CDDO-Me er ved dannelsen af ​​Michael addukter mellem CDDO-Me og reaktive nucleofiler, såsom gratis thioler på målproteiner [33]. CDDO-Me kan interagere med Hsp90 på lignende måde, fordi DTT, en -SH gruppe indeholdende forbindelse, ophæver CDDO-Me-induceret stabilisering af Hsp90 som respons på opvarmning. Desuden CDDO-Me induceret opregulering af Hsp70 og reduktion af Akt kunne også vendes ved DTT i celler. Som CDDO-Me kan øge ROS niveauet i cancerceller og hæmme ROS blokerer virkningen af ​​CDDO-Me [23], kan man argumentere for, at effekten af ​​DTT på Hsp70 kan skyldes dets antioxidant aktivitet. Forøgelse ROS ved H

2O

2 kunne ikke opregulere ekspressionen af ​​Hsp70 (S2 Fig). Således DTT sandsynligvis vender effekten af ​​CDDO-Me ved direkte at interagere med CDDO-Me. Bindingsstedet for CDDO-Me on Hsp90 er i øjeblikket ikke kendt. Der er 6 cysteiner i Hsp90-protein. Hvilket cystein (e) bidrage til interaktionen af ​​CDDO-Me med Hsp90 garanterer yderligere undersøgelse.

Så vidt vi ved, er dette den første rapport, der viser, at Hsp90 er et nyt mål protein CDDO-Me. Målretning Hsp90 tilvejebringer en hidtil ukendt forklaring på de multiple virkninger af CDDO-Me observeret i forskellige cancerceller. Anvendelsen af ​​CDDO-Me til kræftceller med Hsp90 overekspression fortjener yderligere prækliniske og kliniske undersøgelser.

Støtte Information

S1 Fig. STA-9090 inhiberer Hsp90 i celler.

HO8910 (A) og SKOV3 (B) celler blev behandlet med STA-9090 for forskellige tidspunkter og de angivne proteiner blev påvist ved western blot. Hvert forsøg blev gentaget som mindst tre gange

doi:. 10,1371 /journal.pone.0132337.s001

(TIF)

S2 Fig. H

2O

2 aktiverer Erk, men ikke opregulere Hsp70.

HO8910 (A) og SKOV3 (B) celler blev behandlet med H

2O

2 (10 uM) til forskellige tidspunkter og de angivne proteiner blev påvist ved western blot. Hvert forsøg blev gentaget som mindst tre gange

doi:. 10,1371 /journal.pone.0132337.s002

(TIF)