PLoS ONE: Kvantitativ DNA-methylering Analyse af kandidatgener i Livmoderhalskræft

Abstrakt

Der er observeret Aberrant DNA methylering i livmoderhalskræft; dog har de fleste undersøgelser anvendt ikke-kvantitative metoder til måling af DNA methylering. Formålet med denne undersøgelse var at kvantificere methylering inden en udvalgt panel af gener, der tidligere er identificeret som mål for epigenetisk inaktivering i livmoderhalskræft og identificere gener med forhøjet methylering der kan skelne kræft fra normale cervikale væv. Vi identificerede 49 kvinder med invasiv pladecellekræft i livmoderhalsen og 22 kvinder med normale cytologiprøver. Hydrogensulfit-modificeret genomisk DNA blev forstærket og kvantitativ pyrosekventering afsluttet for 10 gener (

APC

,

CCNA

,

CDH1

,

CDH13

,

WIF1

,

TIMP3

,

DAPK1

,

RaRb

,

FHIT

, og

SLIT2

). En Methylering Index blev beregnet som den gennemsnitlige procentvise methylering tværs af alle bindingssteder for CpG analyseret pr gen (~ 4-9 CpG site) pr sekvens. En binær cut-point blev defineret på 15% methylering. Følsomhed, specificitet og arealet under ROC-kurven (AUC) for methylering i enkelte gener eller et panel blev undersøgt. Medianen methylering indeks var signifikant højere i de tilfælde, sammenlignet med kontroller i 8 gener, mens der ikke var forskel i median methylering for 2 gener. Sammenlignet med HPV og alder, kombinationen af ​​DNA methylering niveau af

DAPK1

,

SLIT2

,

WIF1

RaRb

med HPV og alder væsentligt forbedret AUC 0,79-0,99 (95% CI: 0,97-1,00,

p-værdi

= 0,003). Pyrosekventering analyse bekræftede, at adskillige gener er fælles mål for afvigende methylering i livmoderhalskræft og DNA-methylering niveau på fire gener synes at øge specificiteten for at identificere kræft sammenlignet med HPV detektion alene. Ændringer i DNA methylering af specifikke gener i livmoderhalskræft, såsom

DAPK1

,

RaRb

,

WIF1

, og

SLIT2

, kan også forekomme tidligt i cervikal carcinogenese og bør evalueres

Henvisning:. Siegel EM, Riggs BM, Delmas AL, Koch A, Hakam A, Brun KD (2015) Kvantitativ DNA-methylering Analyse af kandidatgener i livmoderhalskræft. PLoS ONE 10 (3): e0122495. doi: 10,1371 /journal.pone.0122495

Academic Redaktør: Osman El-Maarri, University of Bonn, Institut for eksperimentel hæmatologi og transfusion medicin, TYSKLAND

Modtaget: Juni 26, 2014, Accepteret: 22 Februar 2015; Udgivet: Marts 31, 2015

Copyright: © 2015 Siegel et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Data underliggende resultaterne i denne undersøgelse vil foreligge efter anmodning og ikke gjort frit tilgængelige i et offentligt arkiv. Dataene kan ikke gøres offentligt tilgængelige på grund af begrænsninger i vores IRB godkendelse, herunder den lille stikprøvestørrelse, som kan reducere patientens anonymitet og inddragelse af PHI inden datasættet i evalueringen af ​​patientresultater. De endelige datasæt og rå pyrograms er tilgængelige efter anmodning til følgende: Moffitt Cancer Center Information Shared Services Department ([email protected]) eller følgende undersøgelse Principal Efterforskere: Erin M. Siegel (assisterende medlem Institut for Epidemiologisk Kræftforskning Moffitt Cancer Center 12902 Magnolia Drive, Tampa, FL 33612) E-mail: [email protected], Kevin D. Brown (lektor Institut for Biokemi og Molekylær Biologi University of Florida College of Medicine Gainesville, FL 32.610) E-mail: [email protected] ( 352) 273-5458

Finansiering:. Støtte til denne undersøgelse blev leveret af en University of Florida-Moffitt Collaborative Grant (UF09060) og National Cancer Institute 1RO3 CA143980-01 tilskud til EMS og KDB. Dette arbejde blev støttet delvist af Tissue Core Facility og Collaborative Data Services Core Facility ved H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, en NCI udpeget Comprehensive Cancer Center, under tilskud nummer P30-CA76292. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Epigenetisk gendæmpning via tætte DNA methylering inden CpG øer har vist sig at forekomme i mange tumortyper herunder humane papillomavirus (HPV) associeret livmoderhalskræft [1]. Tumorsuppressorgener (GTS), som er af klar betydning i patogenesen af ​​livmoderhalskræft er fælles mål for gendæmpning i denne sygdom [2,3]. Identifikationen af ​​et panel af afvigende methylerede GTS, der repræsenterer et bredt spektrum af tumor suppressive funktioner (

i

.

e

., Cellesignalering, gentranskription, cellecyklus, apoptose, og celleadhæsion ) har stor løfte om at levere et stærkt sæt af DNA methylering biomarkører til brug i sygdomsdiagnose og /eller prognose [4].

Gener, der koder for en række centrale regulatorer af onkogene Wnt /β-catenin vej, såsom

CDH1

(E-cadherin),

APC

, og

WIF1

, ofte tavshed via tætte methylering af deres promotorregioner i livmoderhalskræft [5]. F.eks

CDH1

gen hypermethylering er observeret i de fleste primære cervikale tumorer og et væsentligt antal af high-grade cervikal intraepithelial neoplasi-3 (CIN3), hvilket antyder, at den epigenetiske status af dette gen har et potentiale ansøgning som biomarkør af livmoderhalskræft malignitet [6]. Andre gener sigende hypermethyleret i livmoderhalskræft med lidt at ingen methylering i normale eller lav kvalitet CIN’er omfatter

DAPK1

[7,8],

RaRb

[8,9],

TIMP3

[10], CCNA [11] og

FHIT

[7]. Imidlertid har der været uoverensstemmelser i den rapporterede forekomst af DNA hypermethylering af flere GTS inden livmoderhalskræft [2,12], som kan skyldes brugen af ​​ikke-kvantitative metoder til påvisning af methylering.

Til dato de fleste af de undersøgelser, der undersøger epigenetisk inaktivering begivenheder i livmoderhalskræft har påberåbt sig semi-kvantitative eller kvalitative metoder til at score gen methylering [2], såsom methylering specifik PCR (MSP) eller semikvantitativ MSP (QMSP) [13]. Men er blevet rapporteret, disse analyser til at overvurdere forekomsten af ​​afvigende methylering for nogle markør loci, især i heterogene populationer af DNA [4]. Inden for det sidste årti har bisulfit pyrosekventering opstået som en kvantitativ metode til måling af DNA-methylering ved individuelle bindingssteder for CpG i en population af DNA-molekyler [14,15]. Pyrosequencing kan bruges med en bred vifte af biologiske prøver (

jeg

.

e

. Formalin-fikseret paraffinindlejrede (FFPE), frosne, væv skrammer,

etc

. ), hvilket gør denne fremgangsmåde medgørlige at anvende i det kliniske miljø [4]. Til dato har der været meget få undersøgelser af DNA-methylering i livmoderhalskræft ved hjælp af denne meget præcise, kvantitativt assay [16].

Til denne undersøgelse valgte vi et sæt af 10 GTS (

APC

,

CCNA

,

CDH1

,

CDH13

,

DAPK1

,

FHIT

,

RaRb

,

SLIT2

,

TIMP3

,

og WIF1

), at baseret på en undersøgelse af litteraturen, havde tidligere vist sig at være mål for afvigende DNA methylering i livmoderhalskræft, men ikke omfattende testet ved hjælp af kvantitative metoder. Desuden genprodukterne fungerer på tværs af forskellige biologiske veje, som hver især er blevet vist at påvirke HPV-associeret cervical carcinogenese [2]. Disse gener blev underkastet pyrosekventering analyse i prøver af pladecellecarcinom (SCC) i livmoderhalsen og normale cervikale celler. Formålet med denne undersøgelse var at identificere genet methylering begivenheder nyttige i skelne kræft fra normale cervikale celler, der kan i sidste ende blive tilføjet til standard diagnostisk test for livmoderhalskræft.

Materialer og metoder

Patient Valg og data

Ved hjælp af en case-kontrol design, identificerede vi 49 kvinder med invasiv SCC cancer, som var frekvens matchet på alder og etnicitet til kvinder med normale cytologiprøver (kontroller). Sager blev inkluderet, hvis de havde (1) en kirurgisk procedure mellem 1991 og 2006 på Moffitt Cancer Center, (2) arkiveret FFPE tumorblokke, og (3) ingen strålebehandling inden operationen. For kontroller, vi samlet normale cervikale celler fra kvinder med normal cytologi og en høj sandsynlighed for at være HPV positive. Kort fortalt, væskebaseret cytologi (LBC) prøver (N = 22) blev indsamlet fra kvinder, der givet samtykke til at deltage i vores undersøgelse under en klinik besøg på enten en høj risiko seksuelt overført sygdom klinik på Hillsborough County Health Department eller en kolposkopi klinik på Tampa General Hospital, Tampa, Fl. Vi undersøgte også et sæt normal cervikal formalin-fikseret paraffin indstøbt (FFPE) blokke fra kvinder arkiverede fra kvinder, der blev diagnosticeret med enten godartet blødt væv uterusleiomyom (N = 15) for at undersøge methylering niveauer på tværs af væv konserveringsmetoder (LBC vs. FFPE). Alle væv blev patologisk eller cytologisk revideret, og i givet fald tumor stadie, grad, og histologisk diagnose bekræftet. Klinisk-patologisk og resultater data blev indhentet fra Moffitt Cancerregisteret.

Etik Statement

Alle studieaktiviteter og godkendelsesprocedurer blev godkendt af Institutional Review Board på University of South Florida (IRB # 102.998) . FFPE væv blokke fra cases og kontrolpersoner blev indsamlet som led i den kliniske pleje. Et afkald på informeret samtykke blev godkendt til brug af de-identificerede arkiverede væv fra kvinder, der ikke giver informeret samtykke fra University of South Florida IRB. Det var ikke muligt at indhente samtykke til at udnytte de resterende prøver identificeret for denne undersøgelse, som var alle mindst 5 år, når opnået. Kvinder forudsat skriftligt informeret samtykke på en IRB godkendt samtykkeerklæring til indsamling af flydende-baserede cytologiprøver (N = 22).

DNA Isolation og udvinding

FFPE væv blev macrodissected fra tre 10 pM tykke sektioner og DNA ekstraheret under anvendelse af Qiagen QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Valencia, CA) ifølge producentens protokol. For LBC prøver, en alikvot af 1-4 ml PreservCyt blev centrifugeret og DNA ekstraheret fra de pelleterede celler under anvendelse af Qiagen Qiamp DNA Mini Kit (Valencia, CA) ifølge producentens instruktioner. DNA-koncentrationen blev bestemt ved anvendelse af en NanoDrop1000 spektrofotometer (Wilmington, DE).

HPV DNA Detection og Typing

INNO-LiPA HPV Genotypning Ekstra AMP (Innogenetics, Belgien) blev udført for at forstærke en 65 -BP fragment under anvendelse SPF

10 PCR primer sæt ifølge fabrikantens instruktioner. SFP

10 amplimerer fra HPV-positive prøver blev efterfølgende analyseret ved revers hybridisering på HPV revers hybridisering line probe assay (LiPA). LiPA assay detekterer 13 kræftfremkaldende (HPV-16, -18, -31, -33, -35, -39, -45, -51, -52, -56, -58, -59, og -68), 3 sandsynligvis kræftfremkaldende (HPV-53, -66 og -70) og 9 ikke-kræftfremkaldende HPV-typer (HPV-6, -11, -34, -40, -42, -43, -44, -54, og -74) [17]. Positive og negative kontroller inkluderet DNA fra HeLa-cellelinjer, vand og den positive kontrolprøve inkluderet i sættet.

Pyrosequencing

Natriumbisulfit omdannelse af genomisk DNA (10 ug) blev udført under anvendelse EZ DNA-methylering -Direkte kit (Zymo Research, Orange, CA) ifølge producentens anbefalinger. Kvantitativ methylering af DNA-analyse blev udført ved pyrosekventering som tidligere beskrevet [18]. Segmenter af gener blev amplificeret fra bisulfit omdannet DNA ved PCR under anvendelse af primere, der er angivet i S1 tabel. Til isolering af enkeltstrenget amplikon blev den reverse primer, der anvendes i alle PCR-reaktioner syntetiseret med en biotin-del i 5′-terminus. Kort fortalt blev PCR udført i et 30 pi reaktionsvolumen, der indeholdt 1 pi af bisulfit-modificerede DNA-skabelon, PyroMark PCR Master Mix (Qiagen, Valencia, CA), Coral Load koncentrat, 25 mM MgCl

2 ( for SLIT2), 10 pM af hver af genspecifikke forward og reverse primer. Termocyklisering blev udført under anvendelse af de følgende generelle betingelser: 95 ° C i 15 minutter, efterfulgt af 50 cykler ved 95 ° C i 30 sek, 47-55 ° C i 30 sek, 72 ° C i 1 min og endelig forlængelse ved 72 ° C i 10 min. Efter amplifikation blev 5-20μl af PCR-produktet blandet med streptavidin-konjugeret sepharose-perler (GE Healthcare) i bindingsbuffer (Qiagen, Germantown, MD) og fortyndet til 60-80μl totalvolumen med dH

2O. Perlerne blev efterfølgende opsamlet ved hjælp af et vakuum forberedelse arbejdsstation, sekventeringsprimer (S1 Table) tilsat og opvarmet til 80 ° C i 2 min. Sekventeringsprimer annealet til det biotinylerede DNA-streng som reaktionsblandingen afkølet til stuetemperatur. Prøver blev pyrosequenced anvendelse af et PyroMark MD-system og CpG methylering målt ved anvendelse PyroMark CpG software. Alle pyrosekventering blev gennemført i gennemsnit på to uafhængige PCR-reaktioner. Kontroller indbefattede pyrosekventering analyse af universelt methyleret humant genomisk DNA (CpGenome DNA, Millipore, Billerica, MA), umethyleret humant genomisk DNA (human sperm DNA), og intet DNA template tilsat til pyrosekventering reaktionen.

Statistisk analyse

Forskelle mellem case og kontrol egenskaber blev testet ved hjælp af Pearsons Chi

2, Fishers ‘Exact eller Studerende T-test. A Methylering Index (MI) blev beregnet som den gennemsnitlige procent methylering tværs af alle bindingssteder for CpG analyseret pr gensekvens (~ 4-9 CpG site). Spearmen rang korrelationskoefficient med Bonferoni korrigeret

p-værdi

blev anvendt til at bestemme, om MI blev korreleret mellem gener. Forskelle i MI mellem cases og kontroller, samlet og stratificeret efter alder (. 44 år vs. ≥ 44 år) og HPV-status (positiv vs. negativ), blev bestemt ved anvendelse af Mann-Whitney test. Følsomhed, specificitet og nøjagtighed [areal under kurven (AUC)] af MI at skelne og kontrolpersoner blev undersøgt. Vi evaluerede inkremental tilføjet af DNA methylering niveau forudsigelsesmodeller, der omfattede kendte risikofaktorer for livmoderhalskræft, alder (kontinuerlig) og HPV positivitet (enhver type vs. ingen) udnytte den metode Janes

et al

. [19]. Først blev logistiske regressionsmodeller passe med og uden methylering variabler; de tilknyttede forudsagte værdier for alle emner inden for datasættet er beregnet ud fra hver model og plottet. Vi testede den lige to ROC kurver ved hjælp af STATA roccomp kommando (Stata v12.0) [20]. Binære cut-points til at klassificere et gen som methyleret blev defineret ved hjælp af en

a priori

cut-punkt i MI 15%. Kriterier for optagelse i DNA methylering gen panel var: (1) væsentlige MI forskelle mellem sager og kontrol; (2) MI var ikke signifikant korreleret på tværs gener (Rho 0,65); hvis Rho≥0.65, blev kun et gen inkluderet; og (3) AUC 0,60 for MI . 15% at skelne sager fra kontroller

Blandt sager, vi vurderet sammenhængen mellem methylering (gener eller gen-panel) og sygdomsfri (DFS) og samlet overlevelse ( OS). DFS blev defineret som tiden fra diagnose til første gentagelse, anden tumor eller død som følge af livmoderhalskræft og OS som tiden fra diagnose til dødsdagen. Kaplan-Meier overlevelse skøn og multivariable Cox regressionsmodeller undersøgt samarbejde med DFS og OS, kontrollere for kendte prognostiske faktorer (fx lokalt fremskreden (≥Stage IIB2), klasse, alder, behandling og HPV). En p-værdi på 0,05 (tosidet) blev betragtet som signifikant. Alle analyser blev udført ved hjælp af Stata /MP Version 12.1 (StataCorp LP, College Station, TX, USA).

Resultater

Karakteristik af sager (N = 49) og kontrol (N = 22) er præsenteret i tabel 1. Den gennemsnitlige alder af sager var lidt højere end kontroller (47 ± 15 år

vs

43 ± 16 år, henholdsvis.); men dette ikke var en signifikant forskel (

p-værdi

= 0,32). HPV-DNA blev påvist i 96% (47/49) af tilfældene og 55% (11/22) af kontroller (

p-værdi

0,0001). Blandt tilfælde, 88% af tumorer var HPV-16 eller -18 positiv i forhold til 14% af kontrollerne. Fifty-én procent af tilfældene havde en tidlig fase diagnose (Stage IA1 /1B1), mens 41% havde lokalt fremskreden sygdom (fase 1B2 eller højere).

Kvantitativ DNA-methylering Analyse

DNA methylering i

APC

,

CCNA

,

CDH1

,

CDH13

,

DAPK1

,

FHIT

,

RaRb

,

SLIT2

,

TIMP3

,

og WIF1

gener, som hver har tidligere vist sig at være et mål for afvigende DNA-methylering i livmoderhalskræft [2], blev kvantificeret ved pyrosekventering. Denne metode kvantificerer, ved en målrettet genomisk region 30-50bp den procentvise methylering på individuelle bindingssteder for CpG i en population af DNA-molekyler. Tætte cytosin methylering i CpG-øer, og mere specifikt i umiddelbar nærhed af det transkriptionelle startsted (TSS), er forbundet med hindret samling af den basale transkriptionelle maskineri inden kernepromotoren resulterer i blokeret transkriptionel initiering og gendæmpning [21]. Således blev Pyrosequencing analyser udviklet af vores gruppe designet til at måle cytosin methylering på, eller tæt, TSS (figur 1). Begrænsninger såsom nukleotidsekvensen af ​​området, der skal analyseres og tekniske aspekter af assayet (

i

.

e

., Skal amplifikation /sekventeringsprimere ikke indeholde CpG-dinukleotider, effektive og specifikke PCR amplifikation,

etc

.) i sidste ende påvirket regionen analyseres for hvert gen i vores panel. Alle Pyrosequencing analyser anvendt i denne undersøgelse er udviklet af vores gruppe og er ikke tidligere blevet beskrevet bortset fra et kommercielt tilgængeligt assay for

DAPK1

. Figur 1 illustrerer gen arkitektur (

jeg

.

e

., Placering og størrelse af CpG ø, region og antal CpG-dinukleotider analyserede), og giver et repræsentativt pyrogram for hvert gen, der angiver procent methylering af hvert CpG-dinukleotid undersøgt. DNA-methylering indeks (MI) blev beregnet som gennemsnittet methylering tværs af alle CpG sites inden for regionen sekventeret ved pyrosekventering.

Illustreret er den genomiske struktur af hvert locus undersøges i denne undersøgelse. Inkluderet er den relative placering af exon 1, det transkriptionelle startsted (TSS), associeret CpG ø, og regionen analyseret for methylering af pyrosekventering. Der er også vist en repræsentativ pyrogram og målt cytosin-methylering ved hvert CpG-dinukleotid analyseres i designet pyrosekventering assay. Gener analyseret er

APC Hotel (A),

CDH1

(B),

CCNA

(C),

CDH13

(D),

FHIT

(E);

RaRb

(F);

SLIT2

(G);

TIMP3

(H);

WIF1

(I) og

DAPK1 Hotel (J).

Generelt fandt vi alle Pyrosequencing analyser til at udføre godt, med lave assay fejlrater, høj intra-class korrelationskoefficienter (ICC), og konsekvent høje methylering niveauer for positive kontroller. Vi observerede meget lave fejlrater (≤1%) for analyser med PCR amplikoner 190 bps i størrelse. Undtagelsen blev designet

TIMP3

assay, hvor vi stødte på en fejlrate ~ 6% til at forstærke den målrettede region og en ~ 8% fejlrate at indhente pyrosekventering data af tilstrækkelig kvalitet. APC, som havde en amplikonstørrelse af 194 bps, havde også en fejlrate til amplifikation af target-området af ~ 6%; men alle amplikoner genereret pyrosekventering data af høj kvalitet. Vi opnåede data af høj kvalitet fra ≥90% af patientprøver, med kun én prøve udelukket på grund af utilstrækkelig DNA til forstærkning. ICC for pyrosekventering analyser var 0,94 for alle gener undtagen FHIT (ICC = 0,69), som havde lav inden for og mellem-personers variabilitet (1,41 og 2,11, henholdsvis). Endelig blev den positive kontrol for fuldt methylerede DNA konsekvent methylerede tværs af alle Pyrosequencing assays og batches (middelværdi ± SD = 90 ± 6%). I tilfælde af

CCNA

, vores undersøgelse omfatter analyse af 20 tilfælde og 22 kontroller (tabel 2) på grund af utilstrækkelige mængder af DNA for at fuldføre undersøgelsen af ​​dette gen på alle prøver.

methylering niveauer på tværs CpG steder i et gen var relativt stabilt som afbildet i S1 fig for

DAPK1

,

RaRb

,

og SLIT2

. Figur 2 viser fordelingen af ​​MI (

jeg

.

e

., Median og interkvartile område) for hvert gen undersøgt ved pyrosekventering. Den mediane MI var signifikant højere i DNA høstet fra SCC prøver sammenlignet med DNA fra normale cytologiprøver i 8 ud af de 10 undersøgte gener (

DAPK1

,

RaRb

,

CCNA

,

SLIT2

,

WIF1

,

APC

,

CDH1

, og

FHIT

). Omvendt

CDH13

, og

TIMP3

viste ingen signifikant forskel i median MI mellem cases og kontroller. Tabel 2 viser en detaljeret oversigt over MI for alle gener ved tilfælde status. Blandt kontroller, medianen MI var 5% for alle gener undtagen

TIMP3

(12,4%) og

SLIT2

(7,1%) og methylering niveauer over 15% blev kun observeret i to gener (

TIMP3 og CDH13)

. Blandt tilfælde medianen MI var 10% for

DAPK1

,

CCNA

,

SLIT2

,

WIF1

,

og TIMP3

(tabel 2). Understreger den heterogene karakter af DNA methylering i cancerceller, målt vi en bred vifte i MI i flere gener på tværs af alle analyserede tilfælde. For eksempel medianen

DAPK1

MI var 12% med et interval fra 1% til 96%. Vi har testet for en potentiel sammenhæng i methylering mellem gener og kun

SLIT2

CCNA

viste en signifikant korrelation (Rho = 0,68;

p-værdi

0,001).

Gener bestilles pr Mann-Whitney

p-værdi (

** p-værdi 0,0001 og * p-værdi 0,05). Methylering indeks (MI) af hvert gen præsenteres for normal cervikal prøve (N) og cancer (T) som et boxplot. Whiskers af boxplot markerer 5

th og 95

th percentiler, kassen markerer 25

th (lav grænse boks), median og 75 (øvre grænse af boks) fraktiler, og ekstreme værdier (●).

Vi udforskes, hvis DNA-methylering niveauer varierede efter alder og HPV-status. Samlet set median

RaRb

,

CDH1

,

og CDH13

methylering var højere blandt kontrol- kvinder ≥ 44 år gammel (

p-værdi

= 0,02 ,

p-værdi

= 0.01, og

p-værdi

= 0,04, henholdsvis). De store forskelle i median methylering mellem cases og kontroller blev opretholdt, når stratificeret efter alder ( 44 år eller ≥44 år) for

DAPK1

,

RaRb

,

CCNA og WIF; mens SLIT2

,

APC

,

CHD1 og FHIT var kun signifikant forskellig blandt yngre sager og kontroller

(data ikke vist). Blandt kontroller, DNA MI var ens blandt HPV positive og HPV negative kvinder. Endvidere, når begrænser til HPV-positive sager og kontroller, fandt vi meget lignende resultater for median forskelle i methylering og følsomhed /specificitet (data ikke vist).

methylering Niveauer Skelne Sager fra Controls

Ved hjælp af en konservativ

a priori

grænse på MI 15% for at definere et gen som methyleret,

DAPK1

genet blev klassificeret som methyleret i 44% af tilfældene, og 0% af kontrollen.

SLIT2

og

RaRb

blev methylerede over 15% i 61% og 23% af tilfældene, henholdsvis, og ingen af ​​kontrollerne. Brug MI 15%,

DAPK1

SLIT2

havde 100% specificitet og 43% og 61% sensitivitet henholdsvis (tabel 3). Alle undtagen to gener havde høj specificitet (100%) uden kontrol er klassificeret som methylerede over 15% (

jeg

.

e

., Ingen falske positiver). Dernæst undersøgte vi, om DNA MI målt inden for en kombination af gener forbedret adskillelse af grupper. Panelet af gener blev udvalgt under anvendelse af

a priori Salg kriterier (se Materialer og fremgangsmåder). Af de 8 gener med betydeligt højere MI i tilfælde, (1)

CCNA

blev udelukket på grund af signifikant sammenhæng med

SLIT2

og (2)

APC

,

CDH1

FHIT

blev udelukket på grund af lav AUC ( 0,60). De resterende gener (

DAPK1

,

RaRb

,

SLIT2

WIF1

) blev evalueret for deres evne til at identificere livmoderhalskræft tilfælde i relation til HPV infektion og alder. Vi evaluerede inkremental at tilføje DNA methylering niveauer til forudsigelse modeller, der omfattede kendte risikofaktorer for livmoderhalskræft, alder (kontinuerlig) og HPV-status (positiv vs. negativ) udnytte en metode Janes

et al

. [19,20]. ROC model med enhver HPV-infektion (ja vs. nej) og alder (løbende) havde en forudsagt AUC på 0,79. Brug af denne som en reference, vi statistisk sammenlignet den forudsagte AUC fra modeller, der tilsættes DNA MI for de fire gener, i alle kombinationer. Kombinationen af ​​

DAPK1

,

SLIT2

,

WIF1

RaRb

(kontinuerlig) væsentligt forbedret den forudsagte AUC 0,79-0,98 (95% CI : 0,97-1,00,

p-værdi

= 0,002) (figur 3) for at identificere sager vs. kontroller. Ved definition positiv methylering som en MI 15%, kombinationen af ​​

DAPK1

,

SLIT2

,

WIF1

RaRb

(none

vs

1-4 gener 15% denatureret) havde den højeste sensitivitet (90%) og specificitet (100%), med AUC på 0,95 (95% CI: 0,91 til 0,99)

ROC af forudsagt følsomhed og en-specificitet, når DNA MI for

DAPK1

,

RaRb

,

SLIT2

WIF1

gener blev sat til en model med HPV status og alder. Testen af ​​ligestilling mellem AUC for HPV og alder (AUC = 79%, stiplet linie) i forhold til methylering indeks for

DAPK1

,

RaRb

,

SLIT2

WIF1

, HPV, og alder (AUC = 98%, optrukket linie),

p-værdi

= 0,0002.

Gene methylering, Tumor Kendetegn og patientoverlevelse

livmoderhalskræft tilfælde blev diagnosticeret mellem 1993 og 2001 med en median follow-up tid på 5 år (2,4 måneder-17 år).

TIMP3

blev klassificeret som afvigende methylerede ( 15%) oftere i dårligt-opdelte tumorer i forhold til dem godt til moderat differentieret (63% vs. 8%,

p-værdi

= 0,004).

DAPK1

blev hyppigere methylerede (MI 15) i lokalt avancerede tumorer (fase 2B2) (65% vs. 22%,

p-værdi

= 0,007). Der var en tendens til højere

DAPK1

methylering i tumorer, der gik igen distalt (median MI = 36%) sammenlignet med dem, der aldrig gentaget sig (median MI = 13%) eller gentog lokalt (median MI = 5%) (

p-værdi

= 0,08). Median DFS og OS var 10,3 år og 8 år, hhv. Der var ingen signifikante sammenhænge mellem individuelle gen methylering eller den definerede panel af gener (

DAPK1

,

SLIT2

,

WIF1

RaRb

) og DFS eller OS (data ikke vist).

Discussion

Denne undersøgelse anvendte kvantitativ pyrosekventering at måle niveauet af methylering af DNA inden for 10 TSG i normale cervikale og livmoderhalskræft prøver. Siden introduktionen, har denne teknik støt vundet fordel som en foretrukken værktøj til at måle DNA methylering [14]. Adskillige undersøgelser har evalueret både nøjagtigheden og præcisionen af ​​pyrosekventering til analyse af DNA-methylering i heterogene blandinger af DNA. Brug definerede forhold mellem methyleret og umethyleret DNA, Murphy

et al

. [22] målte ensartet høj Pearson korrelationskoefficienter (R

2 0,99), når korrelering målt

vs

. beregnet DNA-methylering i et panel af gener. Fra disse og andre lignende undersøgelser [23,24], har pyrosekventering stadighed vist til nøjagtigt at måle CpG-methylering i heterogene blandinger af DNA. Reed

et al

. [23] observeret, at ved måling DNA-methylering i blandinger indeholdende lavt ( 10%) CpG methylering, pyrosekventering almindeligvis lidt overvurderet DNA-methylering, hvilket er i overensstemmelse med resultater opnået ved andre grupper [22,24]. For eksempel har vi målt methylering værdier i intervallet fra 0 til 4% CpG-methylering når umethyleret kontrol DNA-prøver (human sperm genomisk DNA) blev analyseret for

APC

gen methylering (data ikke vist). Denne variabilitet i analysen af ​​lave niveauer af DNA-methylering, som ligner Kombineret bisulfit restriktionsanalyse (COBRA), bedt Colella

et al

. [14] at foreslå mindst en tærskel på 10% methylering anvendes til at erklære et gen som methyleret. På grund af denne bekymring, vi udnyttet en

a priori

niveau . 15% at klassificere gener som methylerede

Anvendelse af kvantitative metoder til at bestemme DNA-methylering niveauer er afgørende for præcist at klassificere methylering status. Ikke-og semi-kvantitative metoder anvendes til at vurdere DNA methylering tendens til at overvurdere methylering prævalens, der fører til et højt antal falske positiver (

jeg

.

e

. Lav specificitet). Denne overvurdering er tydeligt af det faktum, at gener som tidligere rapporteret som methyleret i livmoderhalskræft hjælp ikke- eller semi-kvantitative metoder havde meget lave niveauer af methylering målt i Pyrosekventering analyser anvendt i denne undersøgelse (

jeg

.

e

. 10% methylering). For eksempel er den gennemsnitlige methylering frekvens indberettet for

CDH1 Hotel (58%, interval: 0-91%) [2] er højere end observeret i denne undersøgelse, hvor der ikke tumorer blev methylerede højere end 10%. Blandt undersøgelser, der brugte semi-kvantitative metoder [6,10,25], Wisman

et al

. også rapporteret ingen methylering af

CDH1

i SCC [25]. Shivapurkar

et al

. rapporterede en median procent methylering som 3,65 (Range 0-53%); men når de har anvendt den fælles QMSP cut-punkt, når klassificering af et gen som methyleret (PFM 0), 89% af tumorer blev klassificeret som havende

CDH1

methylerede [6]. Dette understreger den potentielle overvurdering af

CDH1

methylering frekvens i livmoderhalskræft. Vi observerede, at kun 7% tilfælde, og ingen af ​​kontrollerne havde

APC

MI 15%, hvilket svarer til to undersøgelser, der brugte QMSP at måle

APC

methylering [25,26], og adskiller sig fra Yang

et al

. der rapporterede, at 63% af livmoderhalskræft blev methylerede [9]. Hyppigheden af ​​DNA methylering indberettet for

FHIT

bruge MSP var 39% (Range 8% -80%) [7,27-29]; dog ligner vores resultater, Wisman

et al

. rapporterede et fravær af

FHIT

methylering i SCC hjælp QMSP [25].

CDH13

methylering af QMSP er blevet rapporteret at forekomme i 40% og 82% af tumorer [2], som adskiller sig fra vores fund af 6% af tumorer med MI over 15%.

Pyrosekventering analyse bekræftede tidligere undersøgelser tyder på, at

DAPK1

,

SLIT2

,

WIF1

RaRb

gener er fælles mål for afvigende methylering i livmoderhalskræft [8, 9,25,27-32].

DAPK1

gen koder for et calmodulin-afhængig serin-threonin-kinase, der er en positiv mediator af gamma-interferon induceret celledød [33] og

DAPK1

silencing menes at frembringe en apoptose-resistent /pro-overlevelse fænotype [34]. Interessant, fandt vi, at

DAPK1

methylering var en af ​​de bedste samlede prædiktorer for livmoderhalskræft.