PLoS ONE: Bmi1 Forbedrer Tumorigenicitet og Cancer Stem Cell Funktion i pancreas Adenocarcinoma

Abstrakt

Baggrund

Bmi1 er en integreret del af Polycomb Undertrykkende Complex 1 (PRC1) og er involveret i patogenesen af ​​flere cancertyper. Det spiller også en central rolle i driften af ​​endogene stamceller og kræft stamceller. Tidligere arbejde impliceret en rolle for cancer stamceller i patogenesen af ​​kræft i bugspytkirtlen. Vi antager, at Bmi1 spiller en integrerende rolle i at forbedre bugspytkirtlen tumorigenicitet og funktionen af ​​cancer stamceller i bugspytkirtlen duktalt adenokarcinom.

Metoder

Vi målte endogene Bmi1 niveauer i primære humane pancreas duktale adenocarcinomer, pancreas intraepitel neoplasier (PanINs) og normale pancreas ved immunohistokemi og Western blotting. Funktionen af ​​Bmi1 i bugspytkirtelkræft blev vurderet ved ændring af Bmi1 ekspression i flere celler modelsystemer ved måling af celleproliferation, celleapoptose, in vitro invasion, kemoterapi modstand, og in vivo vækst og metastase i en ortotopisk model af pancreascancer. Vi vurderede også kræft stamceller frekvens, tumorsphere dannelse, og in vivo væksten af ​​humane pancreas cancer implanteret efter Bmi1 lyddæmpning.

Resultater

Bmi1 blev overudtrykt i humane PanINs, pancreascancer, og i flere bugspytkirtelkræft cellelinjer. Overekspression af Bmi1 i MiaPaCa2 celler resulterede i øget spredning, in vitro invasion, større in vivo tumorer, flere metastaser og gemcitabin modstand mens modsatte resultater blev set, når Bmi1 blev stille i Panc-1 celler. Bmi1 blev overudtrykt i kræft stamceller ved af primære humane pancreas cancer implanteret. Pancreas tumorspheres viste også høje niveauer af Bmi1. Silencing af Bmi1 hæmmede sekundære og tertiære tumorsphere dannelse, nedsat primære pancreas xenograft vækst, og sænkede andelen af ​​cancer stamceller i xenograftvæv.

Konklusioner

Vores resultater implicerer Bmi1 i invasiv og vækst af kræft i bugspytkirtlen og vise sin centrale rolle i reguleringen af ​​kræft i bugspytkirtlen stamceller

Henvisning:. Proctor E, Waghray M, Lee CJ, GD Heidt, Yalamanchili M, Li C, et al. (2013) Bmi1 Forbedrer Tumorigenicitet og Cancer Stem Cell Funktion i pancreas adenocarcinom. PLoS ONE 8 (2): e55820. doi: 10,1371 /journal.pone.0055820

Redaktør: Klaus Roemer, University of Saarland Medical School, Tyskland

Modtaget: August 31, 2012; Accepteret: 2 Jan 2013; Udgivet: 20 Februar 2013

Copyright: © 2013 Proctor et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Funding var tilvejebragt af National Institutes of Health R01 CA131045 og Rich Rogel Family fond for kræft i bugspytkirtlen Research. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Pancreas duktalt adenokarcinom (PDA) er en meget aggressiv epitelial kræft med den værste prognose for enhver større malignitet med en rapporteret 5-års overlevelse på ca. 5%. Det er den fjerde hyppigste årsag til kræft død om året i USA og ottende hele verden med en forventet forekomst af 43,920 tilfælde i 2012 i USA alene [1]. Trods fremskridt i vores forståelse af denne sygdom, de molekylære begivenheder ligger til grund for udviklingen og progressionen af ​​bugspytkirtelkræft er stadig stort set ukendt og måske nøglen til udviklingen af ​​mere effektive og nye terapeutiske strategier.

B-celle- specifik Moloney leukæmivirus insertionssted 1 (Bmi1) er et medlem af gruppen af ​​proteiner Polycomb der oprindeligt blev fundet at inducere murin lymfom dannelse ved samarbejde med c-Myc [2], [3]. Den onkogene modulering af Bmi1 er blevet yderligere belyst i flere aspekter af celleproliferation og udvikling. Bmi1 er blevet vist at spille en kritisk rolle i cellecyklusregulering ved at virke som en transkriptionel repressor af INK4a /ARF locus [4], [5]. Dysregulation af Bmi1 via stabil inaktivering af p16INK4a-pRb og p14ARF-MDM2-p53 pathways er impliceret i onkogenese af det hæmatopoietiske system [6], [7] og i udviklingen af ​​småcellet carcinom i lungen [8]. Bmi1 har også evnen til at målrette andre aspekter af celleældning, som overekspression af Bmi1 har vist sig at udødeliggøre normale fibroblaster og mammaepitelceller via reaktivering af det humane telomerase-revers transkriptase-genet i disse celler [9]. Derudover, robust tyder på, at Bmi1 er kritisk for den invasive potentiale og bidrager til tumorigen kapacitet i tyktarmskræft [10], medulloblastom [11], larynx cancer [12], brystcancer [13], og prostatacancer [14]. Nylige undersøgelser også implicerer Bmi1 som et afgørende protein til vedligeholdelse og selv-fornyelse af normale stamceller, herunder hæmatopoietiske, neurale, myeloid og skællede stamceller [15], [16], [17], [18] samt kræft stamceller i flere tumortyper [14], [19], [20], [21]. Bmi1 har vist sig at opretholde cancer stamceller fornyelse i glioblastoma multiforme og at bestemme den proliferative kapacitet leukæmiske stamceller [22], [23]. Endvidere tab af Bmi1 er blevet observeret at forhindre progression af lungetumorer i et onkogent K-ras-initierede musemodel for lungekræft gennem hæmning af bronchiolalveolar stamceller [24].

Bmi1 er for nylig blevet impliceret i flere aspekter af pancreas biologi. Regulering af INK4a locus ved Bmi1 og MLL1 har været impliceret i opretholdelsen af ​​pankreatisk β-celleproliferation og kapaciteten af ​​p-celler til at komme sig efter pancreasø skader [25]. Bmi1 udtrykker acinar og ø-celler er blevet fundet i det murine bugspytkirtlen og Bmi1 spiller en central rolle i genopretningen af ​​acinære rummet efter cerulein-induceret pancreatitis og difteri toxin-medieret acinar celle ablation i mus [26], [27]. Overekspression af Bmi1 er blevet bemærket i humane pancreas cancer prøver sammenlignet med de normale pancreas [28], [29], [30]. Bmi1 blev opreguleret i pancreas tumorer opstår i Ela-TTA, TetO-Cre, KrasG12V gensplejset musemodel af kræft i bugspytkirtlen [28]. Lignende observationer blev gjort under cerulein pancreatitis [28]. Overekspression af Bmi1 er blevet korreleret med dårligere prognose i en lille gruppe af patienter med pancreascancer [29]. Mens disse data potentielt implicerer Bmi1 i bugspytkirtlen tumorigenese, har vi meget begrænset forståelse af de underliggende mekanismer Bmi1 funktion. I denne undersøgelse, vi undersøger den funktionelle betydning af Bmi1 ekspression i pancreas adenocarcinom hjælp primære humane xenograftmodeller og kræft i bugspytkirtlen cellelinjer. Vores arbejde viser, at Bmi1 understøtter human pancreas vækst kræft ved at regulere cellecyklusprogression og vedligeholdelse af kræft i bugspytkirtlen knoglemarven.

Resultater

Bmi1 er stærkt udtrykt i Panin læsioner, pancreas adenocarcinomer, og i Vælg bugspytkirtelkræft cellelinjer

Vi først forsøgte at bestemme ekspressionen af ​​Bmi1 i prøver af humane primære pancreascancer og sammenlignet ekspressionsniveauerne til prøver af normal bugspytkirtel. Vævssnit fra 10 forskellige primære humane pancreas adenocarcinomer, 10 normale bugspytkirtel prøver, og 16 præ-neoplastiske Panin læsioner med varierende grader af epitelial dysplasi (Panin 1 til PanIN3) blev undersøgt for Bmi1 udtryk efter immunhistokemisk farvning. Ved mikroskopisk evaluering, fandt vi, at Panin læsioner og snit af human pancreas adenocarcinom viste markante opregulering af ekspression af Bmi1 når sammenlignet med normale pancreas væv (figur 1A). Et betydeligt antal af Panin læsioner (med moderate til svære dysplasi) og adenocarcinom sektioner farvet for både cytoplasmatiske og nukleare Bmi1 (pile i figur 1A panel vi). Interessant nok blev Bmi1 farvning overvejende udtrykt i dysplastiske kirtelvæv af både Panin og adenocarcinom prøver, med meget mindre udtalt farvning påvist i et undersæt af celler i det stromale komponent i de neoplastiske prøver. I alt blev Bmi1 udtrykt i 10/16 Panin læsioner sektioner og 8/10 primære pancreas adenokarcinomer. RT-PCR (data ikke vist) og Western blot-analyse af normale og cancer væv (figur 1B) opsummerede resultaterne ses i vores immunhistokemisk analyse. Vi undersøgte også fem bugspytkirtelkræft cellelinjer, MiaPaCa2, Panc-1, ASPC-1, BxPC-3 og Capan2 til ekspression af Bmi1 hjælp Western blot-analyse (figur 1C). Høje niveauer af Bmi1 udtryk blev noteret i BxPC3, Panc-1, AsPC-1, og Capan2 human bugspytkirtelkræft cellelinjer, mens udtryk var lav i MiaPaCa2 bugspytkirtelkræft cellelinje. Disse data indikerer, at Bmi1 ekspression er almindelig i neoplastisk pancreasvæv og i pancreas cancercellelinier. De høje niveauer af Bmi1 udtryk ses i precursor læsioner af kræft i bugspytkirtlen (PanINs) antyder også, at ekspressionen af ​​Bmi1 sker på et tidligt tidspunkt i bugspytkirtlen onkogenese og kan potentielt spille en rolle i bugspytkirtelkræft progression.

A. Immunhistokemi for Bmi1 ekspression blev udført på bugspytkirtlen vævsprøver med varierende grader af dysplasi spænder fra normal (n = 10) gennem Panin (n = 16) til invasiv adenokarcinom i pancreas (n = 10). Som negative kontroller vi udsat vævsprøver til farvning procedure i mangel af specifikke Bmi1 antistof (1:100, Cell signalering). Billederne blev taget til fange ved 10x, 40x, og 60x forstørrelse. Repræsentative billeder viser nogle celler, der udtrykker Bmi1in normalt bugspytkirtlen væv (i, ii, iii), høje niveauer af udtryk i Panin læsioner (IV, V, VI), og væsentlig overekspression i adenocarcinom (VII, VIII, IX). B. Western blot analyse af Bmi1 udtryk i normale bugspytkirtel lysater (n = 10) og kræft i bugspytkirtlen væv lysater (n = 10) fra forskellige patienter blev udført. Bmi1 er overudtrykt i tumorlysater sammenlignet med normale kontroller bugspytkirtlen væv. Beta actin blev anvendt som indlæsning kontrol. C. Endogen Bmi1 udtryk i bugspytkirtelkræft cellelinjer blev bestemt ved Western blot analyse. β-actin tjente som en belastning kontrol.

Bmi1 påvirker bugspytkirtelkræft celledeling in vitro

I betragtning af den øgede ekspression af Bmi1 i bugspytkirtlen epitel neoplastisk væv og dets kendte cellecyklus regulerende rolle, vi næste spurgt, om dens overekspression spiller en funktionel rolle i bugspytkirtelkræftceller. Vi valgte Panc-1 og MiPaCa2 cellelinier for disse forsøg på grund af deres differentielle niveauer af Bmi1 ekspression (figur 1C). Vi overudtrykt Bmi1 i MiaPaCa2 celler og tavshed Bmi1 i Panc-1 celler med lentivirale konstruktioner. Overekspression eller Knockdown af Bmi1 i disse cellelinjer blev bekræftet ved Western blot-analyse (figur 2A). Transfektion af kontrol lentiviral-GFP-vektoren alene påvirkede ikke Bmi1 ekspression i enten cellelinje (figur 2A). Forøget ekspression af Bmi1 i MiaPaCa2 celler signifikant forøget celleproliferation sammenlignet med kontrol MiaPaCa2 celler (235 ± 11% vs. 333 ± 9% ved 72 timer, p 0,0001, n = 6 eksperimenter, figur 2B). Silencing af Bmi1 udtryk i Panc-1 cellelinje inhiberede celleproliferation sammenlignet med lentiviral kontrol shRNA inficerede celler, selv om vores resultater ikke nåede statistisk signifikans (177 ± 12% vs. 141 ± 16% på dag 4, p = 0,11, n = 6 eksperimenter, figur 2B). Disse data viser, at forhøjede niveauer af ekspression af Bmi1 i bugspytkirtelkræft cellelinjer forbedrer celleproliferation.

A. Bmi1 proteinekspression blev analyseret efter transfektion af MiaPaCa2 (øverst) og Panc-1 (nederst) bugspytkirtelkræftceller med en lentiviral vektor (Bmi1) kodende Bmi1 eller Bmi1 shRNA (Bmi1 shRNA) som tidligere [40] beskrevne. En lentiviral vektor der udtrykker GFP (GFP) eller kontrol shRNA blev anvendt som negativ kontrol. B.

In vitro

celledeling af MiaPaCa2 celler (til venstre) og Panc-1 celler (til højre) efter modulation af Bmi1 ekspression blev vurderet af MTS assay (Promega, Madison, WI). Cellereplikation blev registreret som beregnet procent proliferation stigning afledt reagens optagelse på tidspunktet (t) minus basal reagens optagelse på dag 0. Bottom paneler viser de observerede ændringer i proliferation 72 timer efter udpladning. Data er udtrykt som middelværdi ± SEM. * P 0,05, ** p 0,0001, n = 6 uafhængige eksperimenter. C. Repræsentative cellecyklus histogrammer efter flow cytometri af propidiumiodid (PI) farvet Panc-1 celler viser reduktion i procentdelen af ​​celler ind S-fasen på Bmi1 udtryk hæmning.

Ændringer i Bmi1 udtryk resultat i ændret progression gennem cellecyklus men ingen ændringer i hastigheden af ​​apoptose

de observerede ændringer i celledeling efter Bmi1 udtryk ændringer kan skyldes ændringer i cellecyklusprogression med eller uden en ændring i hastigheden af ​​apoptose . Vi anvendte flowcytometrisk analyse med propidiumiodid at studere fordelingen af ​​Panc-1 og MiaPaCa2 cellelinier med ændrede niveauer af Bmi-1 i de forskellige faser af cellecyklussen at behandle dette punkt. I MiaPaCa2 celler, induktion af Bmi1 udtryk viste en mild, men ikke-signifikant stigning i procentdelen af ​​celler, der kommer ind i S-fasen (44,7 ± 1,7% til 50,7% ± 2,3%, p = 0,63, n = 3 eksperimenter, data ikke vist ). Ændringen af ​​Bmi1 ekspression ført til en mere udtalt effekt i Panc-1-celler, da tabet af Bmi1 i disse celler forårsagede et signifikant fald i andelen af ​​aktivt delende S-fase celler fra 54,9 ± 2,5% til 42,0 ± 1,4% ( * p 0,05, n = 3 eksperimenter, figur 2c). Ændring i ekspressionen af ​​Bmi1 forårsagede ikke signifikante ændringer i apoptose som målt ved sub-G0 /G1 fraktion og TUNEL farvning i både MiaPaCa2 og Panc-1 cellelinier (data ikke vist).

Bmi1 øger pancreas cancer kapacitet

celleinvasion

Bmi1 overekspression er tidligere blevet forbundet med dårligere prognose og en mere invasiv fænotype i andre maligniteter. Vi spurgte, om Bmi1 udtryk havde en sådan virkning i bugspytkirtelkræftceller hjælp af Matrigel in vitro invasion assay. MiaPaCa2 celler med forhøjet Bmi1 ekspression viste næsten 2-fold øget kapacitet (149 ± 26 vs 363 ± 30, * p 0,0003) for invasion sammenlignet med vildtype styrevektor celler (figur 3A, venstre). Nedregulering af Bmi1 i Panc-1-celler resulterede i en markant nedsat evne til at cellerne undergår invasion (61 ± 12 vs 14 ± 4, s 0,004, figur 3A, højre). Disse data antyder, at Bmi1 ekspression ikke kun forbedrer proliferation men også den invasive kapacitet bugspytkirtelkræftceller. Da Bmi1 ekspression forbedret cellulær invasion, testede vi evnen hos Bmi1 at modulere regulatorer af epitel mesenkymale overgang (EMT), en proces, der er forbundet med en invasiv fænotype. Vi fandt forøget Bmi1 ekspression i MiaPaCa-2-celler har korrelerer med forøget ekspression af EMT markører vimentin og ZEB1, mens knockdown af Bmi1 i Panc-1-celler fører til nedregulering af disse markører og snail (figur 3B), hvilket viser en klar sammenhæng mellem Bmi1 og udtryk af EMT markører i bugspytkirtelkræftceller.

A. Overekspression af Bmi1 i MiaPaCa2 celler øger deres invasiv i in vitro Matrigel invasion assays (venstre panel). I modsætning hertil Bmi1 nedregulering i Panc-1-celler fører til nedsat tumorcelleinvasion (højre panel). Data er udtrykt som middelværdi ± SEM. * P 0,0003, ** p 0,004, n = 6 uafhængige eksperimenter. B. Overekspression af Bmi1 i MiaPaCa2 celler fører til opregulering af EMT markører vimentin, og ZEB1, mens nedregulering af Bmi1 i Panc-1 celler fører til reduceret ekspression af EMT markører. Data udtrykkes som middelværdien ± SEM sammenlignet med kontrolceller (* p 0,005). C. Cell overlevelse GFP eller Bmi1 transficerede MiaPaCa2 celler (venstre) efter behandling med gemcitabin i 48 timer. Data blev registreret som gange ændring i forhold til kontrol ubehandlede gruppe og udtrykt som middelværdien ± SEM (* p 0,05 vs kontrol). q-RT-PCR-analyse af MRP5 udtryk i GFP eller Bmi1 transficerede MiaPaCa2 celler (til højre) efter gemcitabin behandling. Data er normaliseret GAPDH og udtrykt som gennemsnit ± SEM (* p 0,05 vs kontrol).

Bmi1 forbedrer gemcitabin modstand

EMT fænotype er blevet beskrevet at bidrage til ikke kun bugspytkirtelkræft invasion, men også behandling modstand i bugspytkirtelkræftceller [31], [32]. Vi hypotese derfor, at Bmi-1 kan regulere modstanden mod kemoterapeutiske stoffer i bugspytkirtelkræftceller. For at teste denne hypotese blev MiaPaCa2 celler, der udtrykker GFP alene eller Bmi1 efterladt ubehandlet eller behandlet med 100 pM gemcitabin i 48 timer og assays blev udført for at vurdere celleoverlevelse. Kvantitativ RT-PCR blev udført for at måle ændringer i ekspression af ABC transporter gen MRP5. Medlemmer af MRP familie er vigtigt ved mediering lægemiddelresistens, og MRP5 er blevet vist at blive udtrykt til væsentligt høje niveauer i pancreascancer sammenlignet med kontrolgruppen af ​​pancreas væv, hvilket tyder det kan have en rolle i lægemiddelresistens [33]. MiaPaCa2 celler med forhøjet ekspression af Bmi1 havde forøget resistens mod celledød som respons på gemcitabin og forøget ekspression af lægemidlet resistensgenet MRP5 sammenlignet med kontrolceller. Disse data tyder Bmi1 deltager i terapeutisk modstand i bugspytkirtelkræftceller og at MRP5 kan bidrage til denne fænotype.

Bmi1 forbedrer bugspytkirtelkræft celle tumorigenicitet in vivo

Da vores in vitro-undersøgelser antydet, at Bmi1 spiller en regulerende rolle i bugspytkirtelkræft celleproliferation og invasion, ønskede vi at behandle biologiske betydning af disse resultater i en in vivo ortotopisk model af pancreascancer. For at løse dette punkt, vi injicerede lentivirale transducerede cellelinjer i pancreas haler af modtagere NOD /SCID-mus og målte resulterende tumorvækst og udvikling af ekstrapankreatisk metastaser i disse mus. Efter induktion af Bmi1 udtryk viste MiaPaCa2 celler signifikant større

in vivo

tumorvækst. Bmi1 inducerede MiaPaCa2 celler viste forbedret indpodning, med 100% (5/5) ortotopisk tumordannelse mens kun 3/5 mus injiceret med vildtype MiaPaCa2 celler viste pancreatisk tumor indpodning (tabel 1). Desuden blev en tendens til større tumorstørrelse set i tumorerne dannet af Bmi1 udtrykkende celler sammenlignet med kontrolgruppen MiaPaCa2 celler (0,27 ± 0,17 cm3 vs. 0,98 ± 0,41 cm3, p = NS, Figur 4A). Alle mus injiceret med enten kontrol Panc-1-celler (5/5) eller Bmi1 tavshed Panc-1-celler (5/5) viste tumordannelse i bugspytkirtlen, men Bmi1 tavshed Panc-1-celler dannede tumorer, der var 2,5 gange mindre i gennemsnit end tumorer afledt af kontrol Bmi1 udtrykker Panc-1 celler (1,21 ± 0,23 cm3 vs. 0,42 ± 0,09 cm

3, * p 0,05, figur 4A, nederste panel). Ud over større tumorstørrelse, de viste Bmi1 udtrykkende celler forbedret metastatisk potentiale

in vivo

. Obduktioner udføres i dyr 28 dage efter injektion af Bmi1 udtrykker MiaPaCa2 celler afslørede grov metastaser af tumor til ekstra-pancreas steder, herunder bughinden, lever og tarm i (3/5 dyr, figur 4B), mens der ikke brutto metastatiske indskud (0 /5) observeret i mus injiceret med vildtype MiaPaCa2 celler efter 28 dage (tabel 1). Disse data bekræfter vores in vitro observationer og støtte den tanke, at Bmi1 koordinerer de proliferative og invasive programmer i bugspytkirtelkræftceller.

A. Repræsentative billeder vist demonstrere relativ tumorstørrelse forskel på 28 dage efter ortotopisk pancreas implantation af MiaPaCa2 (øverst) og Panc-1-celler (nederst) i NOD-SCID mus efter modulering Bmi1 ekspression. Tumoren volumen blev beregnet ved hjælp af formlen for volumen af ​​en ellipsoide struktur (4/3 * π * bredde /2 * længde /2 * højde /2). Data udtrykkes som middelværdien ± SEM (* p 0,05, n = 5 uafhængige forsøg). B. Den viste billede repræsenterer forbedret metastatisk potentiale i MiaPaCa2 celler efter induceret ekspression af Bmi1. * Markerede websteder viser brutto metastaser af MiaPaCa2 tumor til ekstrapankreatisk steder i NOD-SCID-mus 28 dage efter ortotopisk injektion af celler.

Bmi1 er stærkt udtrykt i bugspytkirtelkræft stamceller og styrer deres egen -renewal

Vores laboratorium har tidligere identificeret en population af højt tumorigen subpopulation af celler, der viser egenskaber ved selv-fornyelse og differentiering i bugspytkirtelkræft [34]. Vi antager, at Bmi1 kan spille en funktionel rolle i disse bugspytkirtelkræft stamceller (CSCS) givet sit engagement i andre stamceller systemer. Vi vendte til lav passage primære humane pancreas cancer xenografter at behandle dette spørgsmål. Ved hjælp af fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS), vi isolerede de CSCS gennem en kombination af CD44, CD24, og ESA (også kendt som EpCAM eller epithelial celleadhæsionsmolekyle) celleoverfladeekspression [34]. Kvantitativ RT-PCR blev udført for at måle Bmi1 niveauer i CSCS (celleoverflademarkører CD44

+ CD24

+ ESA

+) og sammenlignet med de resterende bulk-tumorceller høstet fra de humane pancreas cancer-xenotransplantater dyrket i NOD-SCID-mus. Normale bugspytkirtel ekstrakter tjente som en ekstra kontrol. Især pancreas CSCS har en signifikant højere ekspression af Bmi1 mRNA (ca. 9-fold, * p 0,05) i sammenligning med normale celler og markør negative bulk-tumorceller (op til 3 gange, s 0,05, figur 5A)

A. CD44

+ /CD24

+ /ESA

+ -celler blev isoleret ved anvendelse af flowcytometri fra pancreas cancer væv som tidligere beskrevet [34]. Total RNA blev isoleret og mRNA blev kvantificeret ved q- RT-PCR i normale pancreas, bulk-CD44

– /CD24

– /ESA- bugspytkirtelkræftceller og CD44

+ /CD24

+ /ESA

+ bugspytkirtelkræftceller. Data udtrykkes som middelværdien ± SEM (* p 0,05, n = 3 uafhængige eksperimenter, hver udført tredobbelt). B. immunfluorescensfarvning af Bmi1 i tumorspheres dannet af CD44

+ /CD24

+ /ESA

+ -celler. C. Silencing Bmi1 hæmmer evnen af ​​CD44

+ /CD24

+ /ESA

+ celler til at danne kugler med seriel passage. Data udtrykkes som middelværdien ± SEM (* p 0,05, n = 3 uafhængige eksperimenter, hver udført tredobbelt)

Sorterede CSCS blev også testet

in vitro

i tumorsphere. assays for at bestemme om Bmi1 deltager i CSC fornyelse ved seriepassage. Ekspression af Bmi1 i tumorspheres blev vurderet via immunfluorescensmikroskopi (figur 5B). Høje niveauer af Bmi1 ekspression blev set i tumorspheres beriget med cancer stamceller, som svarede til den observerede forøgelse i Bmi1 mRNA ekspressionsniveauer på RT-PCR. Vi derefter transduceret de tumorspheres med Bmi1 shRNA-holdige eller kontrol lentivirus og seriel passage kuglerne. Første passage sfære dannelse var ikke signifikant forskellig mellem Bmi1 tavshed CSCS og lentivirale inficerede kontroller (34 ± 6 enheder /HPF vs. 30 ± 6 enheder /HPF, p = NS, figur 5C). Men ved efterfølgende passage, vises Bmi1 lyddæmpede celler, faldende evne til at danne nye tumorspheres. Ved passage tre, Bmi1 tavshed celler viste en omtrent 7 gange formindskelse i deres evne til at danne nye tumorspheres sammenlignet med vildtype kontroller (34 ± 7 enheder /HPF vs. 6 ± 1 enheder /HPF, s 0,05, figur 5C) . Disse eksperimenter implicerer Bmi1 i reguleringen af ​​pancreas CSC fornyelse.

Bmi1 lyddæmpning i CSCS resulterer i mindre tumorer og faldt CSCS selvfornyelse in vivo

For at teste in vivo relevansen af ​​de tumorsphere eksperimenter vi implanteret lige mange Bmi1 tavshed og kontrol lentiviral transficeret CD44

+ CD24

+ ESA

+ CSCS afledt af primære humane pancreas cancer-xenotransplantater i subcutaneum af NOD /SCID-mus og målte resulterende tumorvækst. Bmi1 lyddæmpede tumorer var signifikant mindre i forhold til kontrol- tumorer ved analyse 30 dage efter implantation (0,4 ± 0,2 cm

3 vs. 1,3 ± 0,2 cm

3, * p 0,05, figur 6A). Når tumorerne blev analyseret for deres CSC indhold via flowcytometri viste Bmi1 lyddæmpede tumorer et signifikant fald i CD44

+ CD24

+ ESA

+ CSC population i sammenligning med deres kontrol modstykker (0,20 ± 0,04% vs. 1,2 ± 0,1%, * p = 0,0007, figur 6B). Denne in vivo-data, sammen med in vitro tumorsphere resultater støtter rolle Bmi1 i opretholdelsen af ​​pancreas CSC rummet ved at regulere deres selvfornyelse.

A. Silencing af Bmi1 hæmmer tumor spredning. Repræsentativt fotografi (øverst) i tumorxenotransplantater vist. Venstre – kontrol tumor, højre – Bmi1 tavshed tumor. Søjlediagram viser tumorvolumen forskel på 28 dage. Data udtrykkes som middelværdien ± SEM (* p 0,05, n = 4 uafhængige forsøg). B. Silencing af Bmi1 direkte påvirker CSC nummer i tumorxenoplantater. Repræsentant flowcytometri plots (øverst) af CD44

+ /CD24

+ /ESA

+ celletal i kontrol (til venstre) og Bmi1 tavshed (til højre) xenografter på 28 dage. Søjlediagram (nederst) kvantificerer CSC tal i xenotransplantater på 28 dage efter dæmpning af Bmi1. Data udtrykkes som middelværdien ± SEM (* p = 0,0007, n = 4 uafhængige forsøg).

Diskussion

Den nuværende undersøgelse giver klare beviser for den integrerede inddragelse af Bmi1 i patogenesen af ​​pancreascancer. Overekspression af Bmi1 konsekvent observeret i bugspytkirtelkræft væv sammenlignet med normale kontroller. De fleste humane pancreas cancer cellelinjer blev også observeret at have høj endogen udtryk for Bmi1. Vigtigt er det, blev Bmi1 overekspression observeret i et flertal (10/16) af de præ-neoplastiske Panin læsioner med moderate til svære grader af epitelial dysplasi. Disse data tyder på, at Bmi1 udtryk optræder på et relativt tidligt tidspunkt i bugspytkirtlen carcinogenese og, støtter tidligere offentliggjorte observationer i humane og murine pancreas kræftmodeller [28], [29], [30]. På trods af disse resultater, en funktionel rolle for Bmi1 er ikke tidligere blevet belyst i human eller murine bugspytkirtelkræft.

Vi funktionelt valideret betydningen af ​​Bmi1 udtryk i bugspytkirtelkræft hjælp bugspytkirtelkræft cellelinjer og primære humane tumorxenoplantater. Bmi1 overekspression i MiaPaCa2 bugspytkirtelkræftceller førte til øget spredning og forbedret invasion i in vitro Matrigel analyser. Omvendt Bmi1 knockdown i Panc-1 celler hæmmede deres proliferation. Disse observationer blev yderligere bekræftet ved implantation i NOD-SCID-mus, hvor Bmi1 overekspression i MiaPaCa2 celler resulterede i øget tumorstørrelse og metastatisk cellernes evne. I modsætning hertil selvom Panc-1-celler havde ækvivalent indpodning uanset Bmi1 status, tumorerne følger af Panc-1-celler, der mangler Bmi1 var betydeligt mindre end dem fra kontrol- Panc-1-celler. Forøget Bmi1 ekspression er blevet associeret med øget aggression i andre typer cancer [6], [10], [35], [36] og korrelerer med tumorinvasion og metastase i brystcancer [10], [13]. Vores resultater i humane bugspytkirtelkræft cellelinjer og primære humane xenografter yderligere udvide disse observationer og implicere Bmi1 inducere EMT og resistens derved regulerer bugspytkirtlen vækst kræft og aggressivitet.

tumorfremkaldende eller cancer stamceller har været isoleret i menneskelig pancreascancer [34]. Som i normale stamceller, er Bmi1 menes at være et afgørende element i de maskiner, der vedligeholder selv-fornyelse i CSCS. Dette blev demonstreret at være tilfældet i det hæmatopoietiske system samt bryst, hjerne og prostata [14], [17], [19], [20]. I vores undersøgelse, da Bmi1 udtryk blev stille i CD44

+ CD24

+ ESA

+ bugspytkirtlen CSC befolkning, både

in vitro

CSC formering og

in vivo

tumorvækst blev hæmmet betydeligt. Endvidere blev et markant fald i antallet af CSCS bemærket, når Bmi1 lyddæmpede tumorer blev analyseret for deres CSC indhold. Disse data for første gang eksperimentelt implicerer Bmi1 som en vigtig regulator af pancreas CSC vedligeholdelse og pancreas tumor initiering. Yderligere undersøgelse er i gang af den rolle Bmi1 i de komplekse regulerende transkriptionelle programmer kontrollerer fornyelse og vedligeholdelse af stamceller tilstand. Bmi1 er blevet impliceret i stamcelle fornyelse og proliferation i mange normale såvel som cancervæv herunder hæmatopoietiske system, nervesystem, brystet, prostata, lungerne, tarmen, og den normale pancreas. En kritisk observation, når man gennemgår fleste af disse undersøgelser, er, at Bmi1 funktion hovedsagelig har været impliceret i disse organsystemer ved hjælp af genetisk manipulerede musemodeller. Der er en mangel på data, der undersøger Bmi1 funktion i humane væv direkte. Vores undersøgelse implicerer Bmi1 som en direkte regulator af pankreatisk tumorigenese med primære human patient-afledte lav passage xenotransplantater og pancreatiske cellelinjer. Det supplerer resultaterne af de andre undersøgelser og yderligere cementerer rolle Bmi1 som en vigtig regulator af kræft stamceller fornyelse, som direkte påvirker tumor indledning og vækst in vivo. Det er den første undersøgelse for at indblande Bmi1 direkte i bugspytkirtlen tumorigenese. Det er svært at ekstrapolere hvordan Bmi1 udtryk i bugspytkirtelkræft stamceller vedrører normal pancreas homøostase som den eneste papir adressering Bmi1 funktion og ikke bare udtryk i den voksne pancreas fokuserer på en musemodel og ikke human pancreas [27]. Det er bemærkelsesværdigt, at i dette dokument Bmi1 blev ikke udtrykkes i celler, der udtrykker normalt accepterede pancreasstamfaderceller markører, såsom PDX-1, Nestin, og Sox9, men blev i stedet til stede i hvad syntes at være fuldstændigt differentierede acinære celler. Derfor er det svært at gisne om rolle Bmi1 i normal bugspytkirtlen homøostase i mennesket, men vores arbejde klart implicerer Bmi1 i human pancreas tumorigenese.

De underliggende molekylære mekanismer i Bmi1 funktion i kræft er ikke helt forstået. Bmi1 regulerer cellecyklusprogression i det mindste delvist af den transkriptionelle regulering af INK4a locus, som indeholder p16INK4a og p14ARF (p16 og p19 i mus) cyclinafhængige kinaseinhibitorer [4], [5]. INK4a locus afbrydes i mange pancreascancer og mutationer i eller dæmpning af p16 /p14-ekspression er impliceret som en vigtig begivenhed i bugspytkirtelkræft progression [37]. Nylige undersøgelser har vist, at afvigende Bmi1 ekspression kan ikke nødvendigvis være forbundet med nedregulering af p16INK4a ekspression [38], [39], [40]. Hver prøve blev analyseret i tre eksemplarer.