PLoS ONE: Varianter af PPARD Gene og deres klinisk-patologisk betydning i kolorektal Cancer

Abstrakt

Baggrund

peroxisomproliferatoraktiveret receptor delta (PPARD) er nuklear hormon receptor er involveret i kolorektal cancer ( CRC) differentiering og progression. Formålet med denne undersøgelse var at bestemme forekomsten og spektrum af varianter i

PPARD

gen i CRC, og deres bidrag til klinisk-patologiske endpoints.

Metoder og Resultater

Direkte sekventering af

PPARD

gen blev udført i 303 primære tumorer, i blodprøver fra 50 patienter med ≥3 berørte førstegradsslægtninge, 50 patienter med to berørte førstegradsslægtninge, 50 sporadiske patienter, 360 raske kontrolpersoner, og i 6 tyktarmskræft cellelinjer. Mutation analyse viste 22 forskellige transversioner, 7 af dem var roman. Tre af alle varianter var somatiske (c.548A G, p.Y183C, c.425-9C T, og c.628-16G A). To missense mutationer (p.Y183C og p.R258Q) var sygdomsfremkaldende bruge

i silico

prædiktiv program. Fem tilbagevendende varianter blev påvist i /ved siden af ​​exon 4 (c.1-87T C, c.1-67G A, c.130 + 3G A, og c.1-101-8C T) og exon 7 (c.489T C). Variant c.489C /C opdaget i tumorer var korreleret til værre differentiering (

P

= 0,0397).

Konklusioner

Vi fandt 7 roman varianter blandt 22 arvet eller erhvervet

PPARD

varianter. Somatiske og /eller missense varianter detekteret i CRC patienter er sjældne, men indikerer den kliniske betydning af

PPARD

gen

Henvisning:. Ticha I, Gnosa S, Lindblom A, Liu T, Sun XF (2013) Varianter af

PPARD

Gene og deres klinisk-patologisk betydning i kolorektal cancer. PLoS ONE 8 (12): e83952. doi: 10,1371 /journal.pone.0083952

Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japan

Modtaget: September 17, 2013; Accepteret: November 10, 2013; Udgivet: December 31, 2013

Copyright: © 2013 Ticha et al. . Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering: Grant Support : Dette arbejde blev støttet af tilskud fra svenske Cancer Foundation, Svensk Forskningsråd, og af Forskningsrådet Sundhed i det sydøstlige Sverige. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Worldwide, diagnosticering af kolorektal cancer (CRC) ligger på andenpladsen i hunner og tredje hos mænd, og er den fjerde mest almindelige dødsårsag kræft. Desuden incidensraten af ​​CRC er stigende [1]. Patogenesen af ​​CRC er kompleks og stadig ikke helt forstået. CRC menes at være en multi-trins proces implicerer en ophobning af genomiske aberrationer, svigt af apoptose, og abnormaliteter af multiple signalveje [2]. En nylig undersøgelse af svenske familier ramt af CRC demonstrerer signifikant virkning af den genetiske baggrund af familiære CRC patienter [3]. Disse gener involveret i initiering og progression af CRC er begrænsede. Low-penetrerende gener kan spille en vigtig rolle i kolorektal tumorigenese og har brug for at blive identificeret.

I det sidste årti har stor opmærksomhed været rettet mod undersøgelsen af ​​den rolle, peroxisomproliferatoraktiveret receptor delta (PPARD) i CRC [4]. Tidligere Sun forskningsgruppe udført mRNA og protein analyser i CRC væv og cellelinjer, der foreslog en hæmmende rolle PPARD i kolorektal tumorigenese [5] – [8]. Harman

et al

. [9] gav også stærke beviser for, at PPARD dæmper kolon carcinogenese, brug af genetisk modificerede musemodeller. Specifikt PPARD fremmer differentieringen og hæmmer celleproliferation, som også støttes af andre [10]. Endvidere Sun og kolleger fandt en korrelation mellem højere ekspression af PPARD og gunstige overlevelse i rektale cancerpatienter [6].

Denne ligand-aktiverede transkriptionsfaktor tilhører den nukleare hormon receptor superfamilien, og er kodet af genet

PPARD

(MIM # 600.409), som har ni exoner, fem af dem er kodning, og spænder omkring 85 kb på kromosom 6p21.2 [11]. PPARD kan aktiveres af fedtsyrer og deres derivater, og dets ekspression er relativt høj i mavetarmkanalen sammenlignet med andre væv [12]. PPARD har vist sig at være involveret i regulering af lipid- og glucosemetabolisme og beslægtede lidelser [13] – [15], og betragtes som en lovende mål lægemiddel til behandling af metabolisk syndrom sygdomme [16]

Trods. den spirende konsensus om, at PPARD er en central aktør i CRC, divergerende fund komplicere den særlige rolle i tumorigenese. Hvorvidt PPARD har en fremme eller hæmme rolle i kolorektal carcinogenese er stadig under debat [17], [18]. Genetiske varianter i

PPARD

gen kan være ansvarlig for disse kontroversielle resultater og til dato rolle

PPARD

varianter i CRC er ikke blevet undersøgt. Kun få studier undersøgt sammenhængen mellem polymorfier i

PPARD

gen og funktioner i lipid og kulhydrat metabolisme [19], [20]. Kodning exons 4 til 9 af

PPARD

gen blev sekventeret i den store humane genom-analyse af brystkræft og tarmkræft [21], [22]. Men

PPARD

blev ikke valideret som kandidat kræft-gen i disse analyser. Variant c.489T C (rs2076167) blev lukket inde i en søgen efter kandidat alleler modtagelige for CRC, men ingen sammenhæng med risikoen for CRC blev fundet [23]

PPARD har vist sig at være involveret i CRC udvikling. af vores gruppe og andre. Ikke desto mindre betydningen af ​​

PPARD

genomiske ændringer i CRC er ikke fuldt behandlet. Målene for den foreliggende undersøgelse var (

jeg

) at bestemme hyppigheden og spektrum af varianter i

PPARD

gen i fire forskellige kohorter af CRC patienter, herunder 303 vævsprøver fra CRC, og 150 blodprøver fra: 50 sporadiske CRC patienter, 50 patienter med to berørte førstegradsslægtninge og 50 arvelige patienter med ≥3 påvirket førstegradsslægtninge, og (

ii

) for at evaluere potentielle forhold varianter med klinisk-patologisk variabler. Seks humane tyktarmskræft cellelinjer, der almindeligvis anvendes som

in vivo

tyktarmskræft modeller i Suns laboratorium og af andre, blev inkluderet i denne undersøgelse.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Denne undersøgelse blev godkendt af de etiske komitéer i University of Linköping, Sverige og Karolinska Institutet, Sverige.

Patienter og raske kontrolpersoner

Denne undersøgelse omfattede primært CRC væv, og, når de foreligger, fjernt normal slimhinde fra bærere af

PPARD

variant fra 303 patienter (gruppe i) diagnosticeret på universitetshospitalerne i Linköping og Vrinnevi Hospital i Norrköping. Væv blev indsamlet under primær kirurgi mellem 1989 og 2004, og lagret -70 ° C. Blodprøver mangler for denne kohorte. Endvidere blodprøver fra ubeslægtede CRC patienter: 50 sporadiske CRC patienter (gruppe II), 50 patienter med to berørte førstegradsslægtninge (gruppe III), 50 arvelige patienter med 3 eller flere berørte førstegradsslægtninge (gruppe IV), og 360 ikke-kræft kontroller, blev undersøgt. Blodprøverne (gruppe II-III) blev opnået mellem 2004 og 2009 fra 14 forskellige hospitaler i midten Sverige. For at estimere befolkning hyppigheden af ​​

PPARD

varianter, styre ikke-cancer undergruppe bestående bloddonorer rekrutteret i løbet af året 2010 fra Uppsala-regionen i Sverige, blev anvendt. Begge sager og kontroller var af europæisk afstamning og fra Sverige. Skriftligt informeret samtykke fra donor eller de pårørende blev opnået for brug af deres prøver til forskningsformål. Karakteristik af de patienter og kontroller er vist i tabel 1. De tumorer med bedre differentiering inkluderet godt og moderat differentieret tumorer, og værre differentiering inkluderet dårligt differentieret, mucinøs eller signet-ring celler carcinom. Tumor differentiering data kunne ikke opnås for grupper II til IV.

cellelinier

Mutation analyse blev udført også i 6 almindeligt anvendte tyktarmskræft cellelinjer. De SW480 og SW620-cellelinier blev opnået fra American Type Culture Collection. SW480-cellelinien blev etableret fra en primær colon adenocarcinoma, og SW620 fra en lymfeknude-metastase, tages fra den samme patient et år senere [24], [25]. Den KM12C blev KM12SM og KM12L4A cellelinjer venligst stillet til rådighed af Prof. I.J. Fidler (M.D. Anderson Cancer Center, Houston, TX) [26], [27]. Den KM12C er afledt fra en patient med stadie II tyktarmskræft. Den KM12SM er en spontan levermetastase opstået fra injektionen af ​​KM12C i coecum af nøgne mus. KM12L4A, en eksperimentel levermetastaser, er frembragt ved gentagen intra-milt injektion og høst af levermetastaser i nøgne mus. Den coloncancercellelinie HCT-116 var en venlig gave fra Prof. B Vogelstein (Kernen celle center, Johns Hopkins University, Baltimore, MD) [28], [29]. Cellelinierne SW480, SW620, KM12C, KM12SM, og KM12L4A blev dyrket i Eagles minimale essentielle medium (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) og cellelinien HCT-116 i McCoys5A (Sigma-Aldrich) suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serumalbumin (GIBCO, Invitrogen, Paisley, UK), 0,5% L-glutamin (GIBCO), 1% af en penicillin og streptomycin cocktail (GIBCO) ved 37 ° C og 5% CO

2 i befugtet inkubator. På KM12 celler 2% vitamin-opløsning (GIBCO) blev tilsat. Cellerne blev høstet ved 80% konfluens.

Isolering af nukleinsyrer fra væv, blod og cellelinier

DNA blev isoleret fra frisk frossen tumorvæv, cellelinier og perifert helblod under anvendelse af standardprocedurer gennemførelse Wizard genomisk DNA Purification System (Promega, Madison, WI) eller DNeasy Blood Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland). Total RNA fra bestemte vævsprøver og dyrkede celler blev isoleret ved anvendelse af RNeasy Mini Kit (Qiagen) ifølge producentens instruktioner.

Mutation Analysis

kodende region af

PPARD

genet blev screenet ved PCR og direkte DNA Sanger-sekventering i 203 tumorer, 150 blodprøver fra CRC patienter (gruppe II-IV) og 6 cellelinjer. På grund af tids- og omkostningseffektivitet, blev yderligere 100 tumorprøver samt kontroller screenet i to hyppigst ændrede regioner udspændende exoner 4 og 7. adenin af translationsinitieringskodon er 102 base af exon 4. Derfor exonerne 4 til 9 og tilstødende intron sekvenser af

PPARD

genet blev amplificeret under anvendelse FastStart High Fidelity PCR System (Roche Applied Science, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. BigDye Terminator

v

3.1 Ready Reaction Mix (Applied Biosystems, Foster City) blev anvendt til sekventering reaktion og separation blev udført på ABI 3500 genetiske analysator (Applied Biosystems). De indsamlede data blev analyseret ved anvendelse af Sequence analysator software (Applied Biosystems). Designede primere anvendt til amplifikation og sekventering analyse er vist i tabel S1. Hver mutation eller mistænkelige fragmenter blev bekræftet af en anden uafhængig PCR-amplifikation og sekvensanalyse.

Revers transkriptase-PCR-analyse under anvendelse højkapacitets cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) blev udført ifølge producentens instruktioner i 3 tilfælde udføre varianter c.130 + 3G A og c.1-101-8C T med tilgængelige RNA fra tilsvarende tumor og normalt væv. En 856 bp cDNA-fragment afgrænset af primerne RP_01 /02F 5′-CAGTGTTGTACAGTGTTTTG-3 ‘passage krydset af exon 1 og 2, og PRD_08R 5′-TCTGCCTGCCACAATGTCTC-3’ beliggende i exon 8 blev PCR-amplificeret og gælder sekventeret (fig. 1) . Det samme cDNA fragment blev sekventeret i SW480, SW620, KM12C, KM12SM, og KM12L4A cellelinjer

Repræsentant sekventering analyse af cDNA isoleret fra normal slimhinde fra bærer af varianter c.130 + 3G . A (intron 4) og c.1-101-8C T (intron 3) viser mangler i exon 4; wt – vildtypesekvensen, mut – muterede sekvens. Exon krydset angives af

stiplet linje

. Exon 3 var fraværende i både vildtype og muteret allel.

nomenklatur mutationer

Mutationer blev beskrevet i henhold til nomenklaturen systemet anbefales af Human Genome Variation Society (lastvogne) [30 ]. Udpegning af de genomiske ændringer i

PPARD

gen er baseret på GenBank reference- sekvenser NG_012345.1 og NM_001171818.1. Mutationer, som ikke blev fundet i litteraturen, den enkelt-nukleotid polymorfisme Database (dbSNP, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/, adgang den 8. august, 2013) [31], eller i fortegnelsen over Somatiske mutationer i Cancer (COSMIC, https://www.sanger.ac.uk/cosmic, adgang den 8. august 2013 [32], blev betragtet som roman. Der er forskel på beskrivelsen af ​​varianter c.1-87C T (rs2016520) i 5′-utranslaterede region (UTR) af exon 4 og synonym substitution c.489C T (rs2076167; p.N163) i exon 7. Ifølge GenBank referencesekvensen (NCBI) vildtypeallelen er C, men ifølge den genotypebestemmelse i kontrolgruppen (tabel 2) C-allelen er mindre for begge varianter. det er i konkordans med to andre undersøgelser, der udføres genotypebestemmelse herunder disse to polymorfier i større kohorter [15], [19] . Notatet Skogsberg

et al

[15] navngivet variant c.1-87T .. C som + 294T /C Herved vi nævne disse varianter c.1-87T C og c.489T C.

i silico

Prediction Værktøjer til at vurdere konsekvenserne af Detected missense varianter

til vurdering af funktionel betydning af detekterede missense varianter vi ansat flere udbredte

i silico

forudsigelse programmer. Disse programmer antyder den mulige interferens med den biologiske funktion og stabilitet af protein: Sigt som en del af en erhvervsmæssig Alamut 2.0 program (Interactive Biosoftware, Roven, Frankrig), PolyPhen-2 (https://genetics.bwh.harvard.edu/pph2 /), PROVEAN (https://provean.jcvi.org/index.php), Juster GVGD (https://agvgd.iarc.fr), Mutation Taster (https://www.mutationtaster.org), MUpro ( https://mupro.proteomics.ics.uci.edu).

statistiske Analyser

Analyser blev udført ved hjælp af Statistica 10 (SatSoft, Tulsa, OK). Den chi-square test blev anvendt til at bestemme forholdet mellem tilbagevendende

PPARD

varianter og klinisk-patologiske variabler, for at vurdere forskellene i ombygninger frekvenser mellem grupperne II-IV og kontrol, samt at teste fordelingen af ​​genotyper i styringer til en afgang fra Hardy-Weinberg ligevægt. Cox proportional hazard model blev anvendt til at teste forholdet mellem PPARD varianter og patientoverlevelse, og Kaplan-Meier-metoden blev anvendt til overlevelseskurver. Alle tests var to sider, og en

P

-værdi mindre end 0,05 blev betragtet som signifikant.

Resultater

Varianter af

PPARD

Gene i CRC Patienter, Sund Controls, og cellelinier

Direkte DNA-sekvens analyse af

PPARD

gen viser 22 forskellige enkelt nukleotid varianter af disse fem var tilbagevendende og 7 var nye varianter (tabel 2 og 3). Hyppigheden af ​​fem tilbagevendende

PPARD

varianter i forskellige CRC patientkohorter, raske kontrolpersoner, og cellelinier er vist i tabel 2. Genotypiske fordelinger af arvelige tilbagevendende enkelt nukleotid varianter var i overensstemmelse med Hardy-Weinberg ligevægt (data ikke vist ). Alle fundne varianter var overgange (4 missense, 3 tavs, og 15 ikke-kodende varianter). For at evaluere de forventede effekter af missense varianter på protein-funktion, seks

i silico

forudsigelsesværktøjer blev brugt. Faktisk blev somatisk mutation p.Y183C, og mutation p.R258Q kategoriseret som skadelig (tabel 4).

Tilbagevendende

PPARD

Variant i relation til klinisk-patologisk variabler

Foreningen af ​​tilbagevendende varianter med klinisk-patologiske karakteristika, herunder køn, alder, tumor placering, fase og differentiering, blev undersøgt. Variant c.489C /C blev signifikant relateret til værre differentiering sammenlign T /C og T /T genotyper (

P

= 0,0397, tabel 5). De klinisk-patologiske data for patienter med påvist variant c.489C /C er vist i tabel S3.

Der var ingen signifikant sammenhæng af tilbagevendende

PPARD

varianter med andre klinisk-patologiske variabler, herunder køn , alder, tumor placering og scene. (

P

0,05, data ikke vist)

Karakterisering af tilbagevendende

PPARD

Varianter

i alt 196 varianter i 106 (35%) patienter ud af gruppe i, 28 varianter i 17 (34%) patienter ud af gruppe II, 45 varianter i 22 (44%) patienter ud af gruppe III, og 22 varianter i 11 (22% ) patienter ud af gruppe IV blev påvist. Fem germlinie tilbagevendende forandringer (Tabel 2), fire er placeret i eller ved exon 4 (c.1-87T C, c.1-67G A, og fælles varianter c.130 + 3G A og c.1-101 8C T) og en i exon 7 (c.489T C) tegnede sig for langt størstedelen af ​​alle identificerede varianter, og ofte skete sammen uden en streng mønster af variant kombination. Flertal af bærere af mindst én mindre C-allel ved positionen c.1-87 ved 5′-UTR blev også bærere af mindst én mindre C-allel ved positionen c.489. Bærere af varianten c.1-67G A ved 5′-UTR af exon 4 gennemførte også en anden variant, enten c.489T /C eller c.489C /C undtagen med et tilfælde (gruppe II) med varianter c. 1-101-8C T og c.130 + 3G A. Kimcellelinjen intron varianter c.1-101-8C T og c.130 + 3G A, ligger otte basepar opstrøms og 3 basepar nedstrøms for exon 4 henholdsvis altid forekom sammen. Alle patienter og kontroller med disse varianter var bærere af heterozygot variant c.489T /C, bortset fra to patienter (gruppe II) – en der foretaget varianter c.489C /C og c.1-67G /A, og en bærer af variant c .1-67G /A.

Mutation analyser i blodprøver viste, at mængden af ​​de patienter, der bærer arvelige ændringer var lavere i gruppe IV sammenligne med gruppe II og III kombineret (

P

= 0,037 ), mens der ikke blev observeret nogen forskel mellem gruppe II og III (

P

= 0,305; tabel 2). Hyppigheden af ​​tilbagevendende varianter i exon 4 og 7 var ikke signifikant forskellig mellem styring befolkning og undergrupper II, III eller IV, med undtagelse af fælles varianter c.1-101-8C T og c.130 + 3G A, der blev fundet i 10% af patienterne i gruppe III sammenlignet med 2,5% i kontroller (

P

= 0,003; tabel 2).

fælles varianter c.1-101-8C T og c.130 + 3G A er i nærheden af ​​konsensus splejsningssteder og har potentiale til at ændre posttranskriptionel splejsning. For at evaluere virkningen af ​​disse varianter, blev RNA fra tumor og normalt væv af 3 berørte individer og upåvirket kontrol udtrukket og revers transkription blev udført. Sekvensanalyse af PCR-fragment, der omfatter regionen fra enden af ​​exon 1 til exon 8 af cDNA, afslørede skipping af exon 4 (fig. 1). Alle analyserede prøver manglede exon 3. sekventering af det samme cDNA-fragment i cellelinier viste også mangler i exon 3 (data ikke vist). Fem kendte alternative transcript varianter af PPARD er blevet beskrevet (https://www.ncbi.nlm.nih.gov, Gene ID: 5467) og kun en af ​​disse varianter indeholder exon 3 i mRNA-sekvens. Alternativ transkript nummer 4 med fravær af exon 3 og 4 har alternative startkodon i exon 2 og udtrykke protein isoform 3, som afviger i N-terminus på grund af mangler en del af 5′-kodende sekvens. Andre transcript varianter har startcodon i exon 4.

Analyse i tilfældige 20 parrede prøver (prøver, der var heterozygote eller homozygote af muterede variant i mindst en af ​​de polymorfe steder c.1-87 eller c.489) afslørede lige heterozygositet i de polymorfe sites c.1-87T /C og c.489T /C i 4 normale væv, mens i matchede tumor DNA-prøver blev observeret anderledes del af begge alleler gentagne gange (figur 2).

N – normalt væv, T – tumorvæv; # 516 er eksempel på sekvensanalyse med det samme mønster i normalt og tumorvæv.

Karakterisering af Novel og /eller somatisk

PPARD

Varianter

Syv nye varianter blev påvist i patienter, kontroller og /eller i cellelinier (tabel 3). Ud af disse tre varianter var missense og 6 beliggende i introns. En af disse hidtil ukendte introniske varianter var somatiske, en blev fundet i kontrolgruppen, og et i HCT-116-cellelinjen. Alle disse varianter var heterozygote og opdages kun én gang. Udover nye varianter, blev påvist yderligere 2 sporadisk og 8 sjældne varianter. Karakteristik af patienterne med detekterede sjældne variant er rapporteret i tabel S2

Interessant to af tre detekterede somatiske varianter, c.425-9C . T (syv basepar fra 3’konsensus-splejsningssted) og c .548A G (i exon 7, der fører til ændring af stærkt konserverede aminosyren tyrosin til cystein ved codon 183, og forekom sammen med fælles varianter c.1-101-8C T og c.130 + 3G A) , blev påvist hverken i to andre DNA-prøver udvundet fra rumligt forskellige dele af tumor eller i tilsvarende normale slimhinde

missense mutation c.773G . A (p.R258Q) i exon 8 blev påvist i SW480 ( cellelinie afledt fra colon adenocarcinom), men ikke i SW620-celler (cellelinie afledt fra lymfeknudemetastase). Denne variant forekommer i et ligandbindingsdomæne og fører til ændringen af ​​stærkt konserverede aminosyre arginin til glutamin

Både missense varianter c.548A . G (p.Y183C) og c.773G A (s. R258Q) blev foreslået at være patogene bruge

i silico

prædiktive programmer (tabel 4).

diskussion

den foreliggende undersøgelse viser for første gang, sekvensanalyse af

PPARD

gen i forskellige grupper af CRC patienter, raske kontroller og tyktarmskræft cellelinje modeller. Vi har detekteret 5 tilbagevendende og 17 sjældne varianter, hvoraf 7 blev rapporteret for første gang i denne undersøgelse. To eller flere

PPARD

varianter, mest tilbagevendende ændringer, forekom sammen i størstedelen af ​​patienter med påvist variant. To ud af fire fundne missense varianter (p.Y183C og p.R258Q) blev klassificeret af

i silico

forudsigelse programmer så sandsynligt patogene.

Endnu mere interessant, analyser i en kohorte af 303 CRC patienter (gruppe i) viste, at bærere af tilbagevendende variant c.489C /C haft værre differentieret tumor forhold til c.489C /T og c.489T /T. Det er dog ikke klart, om denne variant driver udvikling af tumor, eller hvis det er bare en passager mutation uden direkte effekt på egnethed af tumorcellerne.

Det er blevet foreslået, at kræft i proksimale og distale tyktarmen kan være to forskellige cancertyper med forskellige genetiske og miljømæssige risikofaktorer, og der blev beskrevet genetiske forskelle mellem de kræftformer, der opstår i den proksimale og den distale colon [33]. Alligevel har vi ikke afsløre signifikante forskelle i fordelingen af ​​ændringer mellem colon og rektal carcinomer, hverken mellem venstre og højre sidet tumorer.

Endvidere tre somatiske

PPARD

varianter, c.425-9C T, c.548A G (p.Y183C), og c.628-16G A, blev påvist i tre sporadiske kolon tumorer (gruppe i). Vi observerede en heterogen somatisk variant, som ikke kunne påvises i hvert sekventeret tumor del. Varianten c.548A G er blevet annonceret i COSMIC database af somatiske mutationer i en patient ramt af pladecellekræft [32]. Op til dato, indeholder COSMIC 40 forskellige

PPARD

somatiske varianter, spredt i hele genet, detekteret i 43 unikke patienter. Ud af disse blev 3 tavse og 7 missense varianter findes i 10 mucinøse kolon adenokarcinomer, og en missense variant i rektal tumor prøve. Somatiske

PPARD

varianter blev også beskrevet i lunge, bryst, ovarie, endometrier, lever og prostata tumor, og neuroblastom. Tilstedeværelsen af ​​somatiske varianter i CRC tumorer understøtter relevansen af ​​

PPARD

i CRC tumorigenese.

Screening i patienten blodprøver afslørede lignende hyppighed af de tilbagevendende varianter placeret i eller ved siden af, exons 4 eller 7, blandt de patientgrupper II, III og IV i sammenligning med kontrolgruppen undtagen med en højere forekomst af leddet varianter c.1-101-8C T og c.130 + 3G a i gruppe III. Interessant, observerede vi den højeste frekvens af germlinie varianter i populationen lav risiko for patienter med to berørte førstegradsslægtninge (gruppe III) mens den laveste frekvens blev observeret i højrisikogruppe for arvelige CRC patienter (gruppe IV). Imidlertid er enhver væsentlig fortolkning af data begrænset af små prøvesæt og efter lidt, selv om statistisk signifikant forskelle. Yderligere analyser af større serie af patienter ønskes til nøjagtige komparative analyser

Vi fandt roman missense mutation c.773G . A (p.R258Q) i det primære coloncancercellelinie SW480 og ikke i lymfeknuder metastatisk celle line SW620. En unik egenskab ved SW480 og SW620 cellelinjer er, at de stammer fra primære og sekundære tumorer reseceret fra den samme patient. En anden variant, c.1078 + 22G A, er kun til stede i primær tumor afledt celle linjer KM12C, men ikke i de eksperimentelle metastatisk cellelinjer KM12SM og KM12L4A. Distinct mutation status i primære tumorcellelinjer og metastatiske cellelinier, samt påvisning af somatiske varianter kun i en del af tumor (c.425-9C T og c.548A G) er i overensstemmelse med de i modellen af ​​klonal evolution af kræft og intratumor genetiske heterogenitet [34], [35]. Rumlig fordeling af subkloner med forskellige genomiske afvigelser inden tumor og metastase blev beskrevet for nylig [36]. Forekomsten af ​​

PPARD

mutation i primære cellelinier, men ikke i metastatisk cellelinie kan også forklares ved sletning i

PPARD

loci under tumor og metastase-dannelse. Endvidere DNA-sekvensanalyse i de matchede prøver (gruppe I) udviste i flere tilfælde forskellige andel af alleler i to polymorfe sites, placeret i exon 4 og 7, når der sammenlignes tumor med normalt væv. I betragtning af, at

PPARD

genet er lokaliseret i det humane leukocyt antigen (HLA) kompleks på kromosomale region 6p, som ofte påvirket af deletioner og omlejringer i humane cancere [37], [38], vores observation kan foreslå tab af heterozygositet i

PPARD

loci i tumor celle subkloner under tumor udvikling.

af note, langt de fleste fundne ændringer er transkriptionelt tavse, enten placeret i 5′- eller 3 ‘ -UTRs eller i introns. Flere linjer af beviser tyder på, at enhver nukleotid variant (intron, nonsens, missense, synonym) kan betragtes som potentielt skadelige, fordi det kan ændre normale præ-mRNA splejsning

via

ændringer i konsensus splejsningssekvenser, skabelse af nye kryptiske sekvenser, påvirkning af translationel sats eller ændringer af mRNA eller proteinstabilitet [39] – [41]. Sådanne tidligere forsømte varianter kunne være modtagelige for arvelige sygdomme. Desværre, i vores undersøgelse var det umuligt at teste alle varianter på mRNA-niveauet på grund af manglen af ​​de særlige vævs- eller blodprøver for RNA-isolering. Alligevel sekvensanalyse af cDNA i bærere af nedarvet fælles varianter c.130 + 3G A og c.1-101-8C T afslørede springer i exon 4, hvilket kan føre til oversættelse af PPARD isoformen med ændret N-terminalen af protein sammenligning med vildtype formular.

PPARD

varianter på 5′-UTR kan være af særlig interesse, på grund af den hypotese regulerende rolle af mRNA-ekspression. Men i kohorte af 303 CRC patienter, vi ikke finde en sammenhæng mellem tilbagevendende varianter i 5′-UTR (c.1-87C T og c.1-67G A). Og klinisk-patologiske variabler

Vi ønsker at styrke betydningen af ​​karakterisering af den genetiske baggrund af cellelinier, der anvendes som modelsystemer. For eksempel viste to laboratorier, PPARD proteinekspression var afhængig af APC /

beta

catenin vej [42], [43]. Deres konklusion var baseret på observation, at relativ udtryk for PPARD var enten tilsvarende eller lavere i SW480 celler, der har en mutant

APC

genet og en vildtype

beta

catenin gen. I den foreliggende undersøgelse opdaget vi missense

PPARD

mutation (p.R258Q) i SW480 celler, der kan have indflydelse på fortolkningen af ​​disse resultater og viser begrænset brug af SW480 cellelinje for

in vivo

undersøgelser . Endvidere omfattende analyse af

PPARD

gen kunne være nyttigt i drug design, da PPARD giver et attraktivt mål for terapeutisk intervention hidtil hos patienter med metabolisk syndrom [16].

Det kan konkluderes, vi identificeret 22

PPARD

varianter, selvom potentielt funktionelle varianter påvist i

PPARD

gen er sjældne. Synonym variant c.489T C (p.N163N; rs2076167) kunne være af klinisk interesse vedrørende dens association med dårligere differentieret CRC. I sidste ende vil fremtidige undersøgelser i en uafhængig klinisk prøve serien bidrage til at løse, om nogen af ​​de

PPARD

varianter er potentielle modifikatorer af CRC modtagelighed eller prognose.

Støtte oplysninger

tabel S1. .

Primere anvendt til PCR-amplifikation og sekvensanalyse

doi: 10,1371 /journal.pone.0083952.s001

(DOCX)

tabel S2.

Rare

PPARD

varianter i forhold til de klinisk-patologiske karakteristika

doi:. 10,1371 /journal.pone.0083952.s002

(DOCX)

tabel S3.

homozygotisk variant c.489C i forhold til de klinisk-patologiske karakteristika

doi:. 10,1371 /journal.pone.0083952.s003

(DOCX)

Tak

Vi takker til klinikere og patienter for deres samarbejde. De særlige tak tilhører Dr. Gunnar Arbman (Institut for Kirurgi i Östergötland, Norrköping, Sverige) til indsamling af prøver og data, Assoc. Prof. Zdenek Kleibl MD, Ph.D (Institut for Biokemi og Experimental Oncology, Charles University i Prag, Tjekkiet) til de kritiske diskussioner, Brandon R. Macias Ph.D (UCSD Medical Center, University of California, San Diego, Californien ) og Veronika Patcha Brodin Ph.D (Division of Oncology, Institut for Klinisk og Eksperimentel Medicin, det Sundhedsvidenskabelige Fakultet, Rådets Amt Östergötland, Linköping Universitet, Linköping, Sverige) til korrekturlæsning af manuskriptet, og Birgitta Holmlund (Department Klinisk og Eksperimentel Medicin, University of Linköping, Linköping, Sverige) for fremragende teknisk bistand under DNA isolation.