Abstrakt
ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) er en større dræber i kræft relaterede menneskelige død . Dens terapeutisk intervention kræver overlegen effektiv molekyle (r), som det ofte bliver resistente over for præsentere kemoterapi muligheder. Her rapporterer vi, at damp af flygtige olie forbindelser opnået fra
Litsea cubeba
frø dræbte humane NSCLC celler, A549, gennem induktion af apoptose og cellecyklusstop. Vapor genereret fra de kombinerede olier (VCO) deaktiverede Akt, en nøglespiller i kræftcellen overlevelse og formering. Interessant VCO dephosphorylerede Akt på både Ser
473 og Thr
308; gennem undertrykkelse af mTOR og pPDK1 hhv. Som en konsekvens af dette, formindsket phosphorylering af Bad forekom sammen med den reducerede Bcl-XL-ekspression. Dette efterfølgende forbedret Bax niveauer tillader frigivelse af mitokondrie cytochrom c i cytosolen, som samtidigt aktiverede caspase 9 og caspase 3 resulterer apoptotisk celledød. Nedskrivning af Akt aktivering med VCO også deaktiveret Mdm2 der foretaget overekspression af p53, som igen opreguleret p21 udtryk. Dette forårsager øget p21-binding til cyclin D1, der standsede G1 til S-fasen progression. Tilsammen VCO producerer to prong virkninger på lungekræft celler, det fremkalder apoptose og blokerede kræft celleproliferation, både skete på grund af deaktivering af Akt. Desuden har en anden afgørende fordel: VCO kunne være direkte leveret til lungekræft væv ved indånding
Henvisning:. Seal S, Chatterjee P, Bhattacharya S, Pal D, Dasgupta S, Kundu R, et al. (2012) Vapor af flygtige olier fra
Litsea cubeba
Seed fremkalder apoptose og deres årsag cellecyklusstop i Lung Cancer Cells. PLoS ONE 7 (10): e47014. doi: 10,1371 /journal.pone.0047014
Redaktør: Gobardhan Das, International Center for Genetic Engineering og Bioteknologi, Indien
Modtaget: Juni 28, 2012; Accepteret: September 11, 2012; Udgivet: 16 oktober, 2012 |
Copyright: © Seal et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Denne forskning arbejde blev støttet af bevilling fra CSIR-Neep Project (HCP-005). Forfatterne SS og pc er taknemmelige for Institut for Videnskab Teknologi, Govt. i Indien, New Delhi; Sushmita Bhattacharya, DP og RK står i gæld til Rådet for videnskabelig og industriel forskning (CSIR), New Delhi, for tildeling af forskningsstipendier. SD er taknemmelige til UGC for Dr. D. S. Kothari PDF CSIR-NEIST for QHF; og Samir Bhattacharya til den indiske National Science Academy for hans Insa Seniorforsker position. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Det medforfatter Prof. Samir Bhattacharya er en PLoS ONE Editorial Board medlem. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.
Introduktion
Lungekræft er en af de mest udbredte kræftformer og en væsentlig årsag til verdensomspændende cancer relateret død i ca. 1,4 millioner patienter hvert år [1]. Blandt lungecancer, ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) omfatter -80% og inden for hvilken adrenocarcinoma er betydeligt høj i forekomst og dødelighed [2]. Kemoterapi og /eller bestråling sædvanligvis mislykkes, fordi NSCLC celler er uløseligt resistente over for sådanne terapier øvrigt prognosen for NSCLC er især dårlig [3], [4]. Alle disse påvirkede et meget begrænset terapeutisk valg for lungekræft. Der er derfor et afgørende behov for at udvikle en target specifik kemo-intervention for at forsinke kræft spredning eller at inducere apoptose eller begge at styre problemet med NSCLC.
For at løse problemet med NSCLC er alarmerende situation, har flere forsøg været gjort for at søge efter egnede molekylære mål at intervenere kræftceller progression og apoptose. I NSCLC celler, Akt /PKB er konstitutivt aktiv kinase, som fremmer cellulær overlevelse [5]. Aktivering af Akt opstår, når den er rekrutteret i cellemembranen gennem sin PH domæne og phosphoryleret ved Thr henholdsvis
308 og Ser
473 gennem mægling af PDK1 (phosphoinositid afhængig kinase 1) og mTOR (pattedyr mål for rapamycin) [6], [7]. Interessant afvigende Akt aktivering høj grad bidrager til lunge carcinogenese [8]. Phosphoryleret Akt (Pakt) er en kraftig promotor af celleoverlevelse som det holder denne vej i live ved at beskytte Bd-XL og antagonisering forskellige komponenter af de apoptotiske kaskader [9]. Selv om der er observeret apoptotiske respons på grund af hæmning af Akt ved varierende grader i flere typer af kræft [10], [11] det kunne være afgørende i lungekræft, fordi forbedret phosphorylerede form af Akt opstår bestandig [12].
Akt regulerer p53, en tumor-suppressor protein, der styrer cellecyklusprogression via Mdm2 (murin dobbelte mutant-2), en ubiquitin ligase. MDM2 er et substrat af Akt, phosphorylering af MDM2 ved Akt virkninger ubiquitinering og proteasomalaktivitet nedbrydning af p53 [13]. Aktiveret Akt eliminerer derfor en væsentlig hindring for kræftcellen progression. Et andet vigtigt aspekt af Akt er dens hæmmende effekt på apoptotiske vej. Bad har et medlem af Bcl
2 familie vist sig at være det første protein, der initierer apoptose ved at forskyde Bcl
2 eller Bcl-XL, der tillader Bax at oligomerisere og skabe porer på den mitokondriske membran til at frigive cytochrom c i cytosolen [14], [15]. Aktiveret Akt phosphorylerer Bad på Ser136 får det til at tage afstand fra Bd-XL fra mitokondrie membran og associeret med en adapter protein 14-3-3 resulterer Dårlig binding til cytosolen [16], [17]. Target baseret forbedring fra NSCLC celle progression eller ødelæggelse er endnu ikke tilgængelig, og da Akt er konstitutivt aktiv her og godt karakteriserede kinase kendt for at støtte kræftcellen overlevelse og progression, ville dens deaktivering være det bedste valg til at håndtere NSCLC.
i denne rapport demonstrerer vi, at flygtige forbindelser fra olien udvindes og renses fra frø af
Litsea cubeba
(lour.) Pers. (Lauraceae), en plante bredt tilgængelige i det nordøstlige region i Indien, ødelægger lungekræft celler gennem deaktivering af Akt. Interessant nok er damp af de olier, som fremkalder apoptose og forhindrer celleproliferation af NSCLC ved at producere defekter i Akt phosphorylering. Dampen af olierne demonstrerede to prong effekter, dvs. induktion af apoptotisk død og retardering af cellecyklusprogression, både sker gennem deaktivering af Akt. forventes denne rapport derfor at have en særlig attraktion som damp induceret ødelæggelse af lungekræft celler ville have væsentlig dimension i forhold til levering til målvæv.
Materialer og metoder
Reagenser
Alle cellekultur materialer blev opnået fra Gibco-BRL, Life Technologies Inc., Gaithersburg, USA. De primære antistoffer til Pakt (Thr308, sc-135.650), pAkt1 /2/3 (Ser473; sc-7985-R), Akt 1/2/3 (sc-8312), pPDK1 (Ser241; sc-101.775), Bcl -XL (sc-7195), pBAD (Ser136; sc-7999), Bad (sc-7869), pMdm2 (Ser166; sc-293.105), p53 (sc-6243), p21 (sc-756), cyclin D1 ( sc-753), poly [ADP-ribosyl] -polymerase (PARP) (sc-7150), cytochrom C (sC- 7159) og β-actin (sc-130.657) blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology Inc., Californien, USA og mTOR (# 2983) blev indkøbt fra Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA, USA. Alkalisk phosphatase og FITC-konjugeret sekundære antistoffer, Annexin V-Cy3 apoptose afsløring kit, protein A agarose og CHAPS blev indkøbt fra Sigma-Aldrich, St. Louis MO, USA. MTT assay kit blev indkøbt fra Milipore, Temecula, CA, USA. Caspase-Glo ™ 3/7 assay kit blev erhvervet fra Promega Corporation, Madison, WI, USA. Mitotracker blev indkøbt fra Molecular Probes, MD, USA, blev JC-1 mitokondrielle membranpotentiale assaykit indkøbt fra Cayman Chemical Company (Ann Harbor, MI, USA). Apoptotisk DNA-stige kit og BrdU mærkning kit blev indkøbt fra Roche Diagnostics (GmbH, Tyskland).
Ekstraktion og oprensning af æteriske olier fra
Litsea cubeba
frø
Om 250 g friske modne frø af
Litsea cubeba
, indsamlet i løbet af månederne august til oktober 2009-2011 fra CSIR-NEIST eksperimentel gård, Jorhat, Assam blev gennemvædet i destilleret vand og ekstraheres ved hjælp af en Clavenger apparat i 6 timer. Den æteriske olie aflejres oven vandlaget blev separeret under anvendelse af en skilletragt og tørret over vandfrit natriumsulfat (neutral) og filtreret til opnåelse olie (6,25 g, 2,5% udbytte). Den tyndtlagskromatografi af råolien indikerede tilstedeværelsen af fire forskellige steder. Den rå olie (1 g) blev underkastet kromatografisk oprensning i en silicagel (20 g, 100-200 mesh, Rankem) søjle (1 inch diameter 50 cm længde) pakket i hexan. 30 ml fraktioner blev opsamlet i følgende rækkefølge: fraktionerne 1-10 (hexan), 11-20 (1% ethylacetat i hexan), 21-35 (2% ethylacetat i hexan), 36-60 (3% Ethylacetat i hexan), og fraktion 61-indtil afslutningen af elueringen af forbindelserne (4% ethylacetat i hexan). Fraktioner 11-20 indeholdende 1 (herefter benævnt forbindelse 1 eller C1) (TLC) blev kombineret og koncentreret i en rotationsinddamper for at give en olie (100 mg), og dette blev identificeret som citronellal fra sammenligning med autentisk materiale (TLC, IR, NMR, MS). Fraktioner 23-35 indeholdende 2 (herefter benævnt som forbindelse 2 eller C2) (TLC) blev kombineret og koncentreret i en rotationsinddamper for at give en olieagtig substans (86 mg) og blev identificeret som neo-isopulegol ved sammenligning af dets
1H NMR-spektrum med den rapporteret i litteraturen [18]. Fraktioner 40-60 indeholdende forbindelse 3 (herefter benævnt forbindelse 3 eller C3) (TLC) blev kombineret og koncentreret i en rotationsinddamper som forklaret tidligere, hvilket gav en olieagtig remanens (120 mg), og dette blev identificeret som isopulegol ved direkte sammenligning med
1H NMR-spektret med det rapporteret i litteraturen [18]. Fraktioner 64-76 indeholdende forbindelse 4 (herefter benævnt som forbindelse 4 eller C4) (TLC) blev kombineret og koncentreret til opnåelse af en tyk olie (55 mg), som blev identificeret som citronellol fra sammenligning af dets
1H NMR-spektrum med autentisk prøve .
Forbindelse 1 (C1):
IR (CHC
3): υ 2925, 1724, 1457, 1437, 1219, 1040, 772 cm
-1;
1H NMR (CDC
3, 300 MHz): δ 0,96 (d,
J
= 6,6 Hz, 3H, -CH
Me
), 1,30-138 (m , 2H, -CHMeC
H
2
CH
2), 1,68 (s, 3H, = C
Me
), 1,98 (s, 3H, = C
Me
), 1,98-2,06 9m, 3H, = C
CH
2
– -C
H
Me-), 2,24 (dd,
J
= 7,9, 2,6 Hz, 1 H, -C
H
HCHO), 2,37 (dd,
J
= 5,4, 1,6 Hz, 1 H, -CH
H
CHO), 5,06 (t,
J
= 7,0 Hz, 1 H, -C
H
= CMez
2), 9,75 (s, 1 H, -C
H
O). MS (ESI): 155 (M
++ 1); bp 206 ° C (lit. 207 ° C)
Forbindelse 2 (C2):.
IR (CHC
3): υ 2925, 1722, 1643, 1455, 1445, 1375, 1219, 1024, 889, 772 cm
-1;
1H NMR (CDC
3, 300 MHz): δ 0,87 (d,
J
= 6,6 Hz, 3H, -CH
Me
), 0,92-0,95 (m , 1 H), 1,08-1,12 (t,
J
= 6,6 Hz, 1H), 1,47-1,54 (m, 1H), 1,68-1,75 (m, 3H), 1,79 (s, 3H,
Me
C = CH
2), 1,95-1,99 (m, 2H), 3,98 (m, 1 H, C
H
OH), 4,78 (s, 1H, = C
H
2), 4,95 (s, 1 H, = C
H
2); MS (ESI):. 154 (M
+)
Forbindelse 3 (C3):
IR (CHC
3): υ 2923, 1645, 1455, 1448, 1375, 1219, 1095, 1051, 1027, 886, 772 cm
-1;
1H NMR (CDC
3, 300 MHz): δ 0,90-1,03 (m, 2H), 0,95 (d,
J
= 6,6 Hz, 3H, -CH
Me
), 1,30-1,35 (m, 1H), 1,47-1,54 (m, 1H), 1,63-1,65 (m, 1 H), 1,69 (d,
J
= 1,5 Hz, 3H,
Me
C = CH
2), 1,87-1,89 (m, 1H), 2,03-2,06 (m, 2H), 3,50 (dt, 1H,
J
= 10,4, 4,2 Hz , C
H
OH), 4,85 (s, 1H, = C
H
2), 4,89 (s, 1H, = C
H
2); MS (ESI): 154 (M
+); bp 213 ° C (lit. 212 ° C)
forbindelse 4 (C4):.
IR (CHC
3): υ 3338, 2925, 1452, 1377, 1219, 1058, 1010, 738 cm
-1;
1H NMR (CDC
3, 300 MHz): δ 0,91 (d,
J
= 6,6 Hz, 3H, -CH
Me
), 1,15-129 (m , 2H, -CHMeC
H
2
CH
2), 1,33-1,45 (m, 2H, -C
H
2
CH
2OH ), 1,51-1,53 (m, 1H, -C
H
Me-), 1,60 (s, 3H, = C
Me
), 1,68 (s, 3H, = C
Me
), 1,96-2,01 (m, 3H, = C
CH
2
– O
H
), 3,61-3,74 (m, 2H, – C
H
2OH), 5,07 (t,
J
= 7,0 Hz, 1 H, -C
H
= CMez
2); MS (ESI): 157 (M
++ 1); bp 223 ° C (lit. 222 ° C).
Cell kultur og behandlinger
lungekræft cellelinje A549, var en slags gave fra Dr. Partha P. Banerjee (Georgetown University Medical Centre, Washington DC, USA), hvor han har fået fra American Type Culture Collection (ATCC), USA. Celler blev dyrket i DMEM indeholdende Earles salte og ikke-essentielle aminosyrer suppleret med 10% føtalt bovint serum, penicillin (100 U /ml) og streptomycin (100 ug /ml) i en fugtig 95% O
2/5% CO
2 atmosfære ved 37 ° C. Sammenflydende celler blev sub-dyrket ved trypsinisering og efterfølgende podet i 6 brønds kulturplader indeholdende DMEM med essentielle kosttilskud. Salg
Celler blev podet i en plade med seks holde én brønd blottet for celler. Når konfluens nået, blev råolie eller hver enkelt forbindelse eller VCO fortyndet i DMEM og anvendt i det tomme brønd i pladen primet til behandling. VCO holdige medier blev genopfyldes hver 24 timer for varigheden af eksperimentet. Cellerne blev inkuberet ved forskellige tidsrum med flere fortyndinger af VCO som nævnt under figurerne. Kontrol celler blev holdt i en separat inkubator for at undgå enhver eksponering fra VCO. Ved slutningen af inkubationen blev cellerne lyseret, centrifugeret i 10 minutter ved 10.000 g ved 4 ° C, og supernatanten blev opsamlet. Proteinindholdet i supernatanten blev bestemt ved at følge metoden ifølge Lowry et al. [19]. Krypteret eller p53 siRNA eller Sp1 siRNA blev transficeret under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ved at følge producentens instruktioner.
MTT celleviabilitetstest
Cellelevedygtighed blev bestemt ved anvendelse MTT assay kit (Milipore, Temecula, CA, USA) ved at følge producentens instruktioner. Kort fortalt blev cellerne forgyldt i 96 brønde og blev udsat for forskellige fortyndinger af råolie eller damp olier i 72 timer eller VCO for forskellige tidsperioder. 10 pi 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2-5-diphenyl tetrazoliumbromid (MTT) blev tilsat til hver brønd i 4 timer ved 37 ° C. Efter solubilisering i 100 pi 1 (N) isopropanol /0,04 (N) HCI, absorbans blev aflæst ved 595 nm i en mikropladelæser (Thermo Electron Corporation, MA, USA).
AnnexinV-Cy3 påvisningsassay
AnnexinV-Cy3 apoptose afsløring kit, købt fra Sigma Aldrich, St. Louis MO, USA blev brugt til at skelne mellem levende (grøn fluorescens), nekrotisk (rød fluorescens) og apoptotiske celler (grøn og rød fluorescens). A549-celler inkuberet uden eller med VCO fortyndingsgraden (2 × 10
3) i 36 timer blev vasket grundigt med PBS, høstet og 50 pi af cellesuspensionen blev spottet på poly L-lysin coatede objektglas. Celler blev derefter vasket tre gange med bindingsbuffer og farvet med dobbeltmærkning farvningsopløsning (Annexin V-Cy3 og 6 Carboxy Fluorescein Di-acetat (CFDA) i 10 min. Overskydende mærkning middel blev fjernet ved vask af cellerne tre gange med bindingsbuffer og celler blev observeret under fluorescensmikroskop (Zeiss Axio Anvendelsesområde A1, Carl Zeiss, Gottingen, Tyskland).
JC-1 mitochondriemembran Potential Assay
JC-1-farvning blev udført ved anvendelse JC 1 mitochondrial membranpotentiale assaykit, Cayman Chemical Company, (Ann Arbor, MI, USA) i henhold til fabrikantens protokol. Kort fortalt blev kontrol og VCO (2 × 10
3 fortynding) behandlede celler underkastet JC-1 plet (10 ug /ml) i 20 minutter ved 37 ° C. skiftet i fluorescens som følge af VCO behandlingen blev observeret under fluorescensmikroskop (Zeiss Axio Anvendelsesområde A1, Carl Zeiss, Gottingen, Tyskland).
DNA fragmentation assay
lav-molekylvægt DNA blev ekstraheret fra 1 × 10
6 kontrol eller VCO (2 × 10
3dilution) behandlede celler ved hjælp Apoptotisk DNA-stige kit fra Roche Diagnostics, (GmbH, Tyskland) efter producentens anvisninger. Eluerede DNA-prøver blev derefter fyldt på ethidiumbromidfarvet 1,5% agarosegel og billedet blev taget af Bio-Rad Gel Doc ™ XR +, USA hjælp af Image Lab software.
Elektroforese og immunoblotting
60 ug af protein fra kontrol eller behandlet cellelysater blev opløst på 10% eller 12,5% SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner (Millipore, Bedford, MA) ved hjælp af Semi-Dry trans blot apparat (TE77 Semi-Dry Transfer Unit, GE Healthcare, CA, USA). Membranerne blev først inkuberet natten over ved 4 ° C med forskellige primære antistoffer ved 1:500 fortyndinger efterfulgt af respektive alkalisk phosphatase konjugerede sekundære antistoffer ved 1:2000 fortyndinger ved stuetemperatur i 2 timer. Proteinbåndene blev påvist ved anvendelse af 5-bromro 4-chlor 3-indolylphosphat /nitroblåt tetrazolium (BCIP /NBT). Intensiteten af båndene blev vurderet af Image Lab software (Bio-Rad Gel Doc ™ XR +, USA).
Immunofluorescens undersøgelse af cytochrom c
A549 celler dyrket på sterile ubestrøget dækglas. Både kontrol- og VCO (2 × 10
3-fortynding) behandlede celler blev farvet med Mitotracker (Molecular Probes, MD, USA) ved 1:10,000 fortyndinger (i DMEM) i 15 min. Celler blev yderligere vasket med DMEM og behandlet til fiksering. Efter fiksering blev celler inkuberet med anti-cytochrom c-antistof (1:100) i 2 timer efterfulgt af inkubering med FITC-konjugeret sekundært antistof (1:50) i yderligere 1 time ved stuetemperatur. Cellerne blev counter farves og monteret med DAPI montering medium og observeret under fluorescensmikroskop (Zeiss Axio Anvendelsesområde A1, Carl Zeiss, Göttingen, Tyskland).
Caspase-Glo 3/7 assay
A549-celler blev podet i dyrkningsplader med 96 brønde og inkuberet uden eller med VCO af fortynding (2 × 10
3) i forskellige tidsrum. Ved ophør af inkubationer blev caspase aktivitet målt ved hjælp af Caspase-Glo ™ 3/7, Promega Corporation, Madison, WI, USA ifølge fabrikantens protokol. Luminescens blev målt i en DTX-800 multimode detektor (Beckman Coulter, CA, USA).
BrdU-inkorporering assay
DNA-syntese blev overvåget ved måling af inkorporering af thymidin-analog 5-brom-2 ‘ deoxyuridin (BrdU) i voksende kræftceller ved hjælp BrdU mærkning og påvisning kit. Kontrol- og VCO (2 × 10
3-fortynding) behandlet A549-celler blev opdateres med komplet medium indeholdende reagens BrdU mærkning og inkuberet i 1 time. Celler blev derefter vasket grundigt med vaskebuffer og fikseret med ethanol fiksativ i 20 min ved -20 ° C. Fikserede celler blev vasket og inkuberet med anti-BrdU-antistof-opløsning efterfulgt af anti-muse-Ig fluorescein opløsning. Celler blev derefter monteret på objektglas og observeret under fluorescensmikroskop (Zeiss Axio Anvendelsesområde A1, Carl Zeiss, Gottingen, Tyskland).
chromatin immunoprecipitation (chip) assay
chip assay blev udført ved anvendelse af en chip assaykit (Upstate, Temecula, CA, USA) efter fabrikantens protokol under anvendelse af anti-p53-antistof. Primere blev brugt til forstærkning kendt p53 respons element på p21 promotor og disse er – RE1: fremad: 5′-CAGGCTGTGGCTCTGATTGG-3’and omvendt: 5′-TTCAGAGTAACAGGCTAAGG -3 « RE2: forward: 5′-GGTCTGCTACTGTGTCCTCC-3 ‘og revers: 5′-CATCTGAACAGAAATCCCAC-3’ [20] og PCR-produkter blev resolveret på ethidiumbromidfarvet 2% agarosegel og billedet blev taget af Bio-Rad Gel Doc ™ XR +, USA bruger Billede Lab software.
Co-immunopræcipitation (Co-IP) assay
200 ug protein fra kontrol eller VCO behandlede celler blev inkuberet natten over med 2 ug anti-p21 og anti β-actin-antistof ved 4 ° C med kontinuerlig omrøring. Protein A agarose blev derefter tilsat og inkuberet i 4 timer ved 4 ° C. Antigen-antistof-komplekser blev opsamlet ved centrifugering ved 10.000 rpm i 2 minutter ved stuetemperatur. Pelleten blev vasket 3 gange for at fjerne eventuelt ubundet protein og koges med 4 × prøvepuffer i 5 minutter i et kogende vandbad. Prøven blev centrifugeret og supernatanten blev sat på 10% SDS-PAGE efterfulgt af immunoblotting med anti-cyclin D1 eller anti-β-actin-antistoffer.
Flow-cytometrisk analyse
I cellecyklus analyse, kontrol og VCO (2 × 10
3dilution) behandlede A549-celler blev trypsiniseret, vasket to gange med PBS, og derefter fikseret i 70% ethanol i 24 timer før DNA-analyse. Efter fjernelse af ethanol ved centrifugering blev cellerne vasket to gange med PBS. Celler blev derefter inkuberet med RNase (100 ug /ml) i 30 minutter og derefter farvet med propidiumiodid (PI-5 ug /ml) i 15 min. Fluorescens af PI-behandlede celler blev målt med flowcytometer (BD FACSAria ™ II). Procentdelene af G1, S og G2-M-celler blev bestemt under anvendelse af FACS Diva Software.
Primær kultur af normale lungeceller
Normale lungeceller blev isoleret fra Sprague Dawley rotter efter Phan et al. [21], kortvarigt, normale sunde rotter blev bedøvet, og lungerne blev derefter perfunderet med sterilt phosphatbufret saltvand (PBS) gennem den højre ventrikel, indtil de var bleg. Derefter lungerne blev fjernet, hakket og fordøjet i PBS indeholdende 0,5% trypsin i 45 minutter ved 37 ° C. Fordøjede celler blev separeret fra ufordøjet væv og debris ved filtrering gennem nylon mesh. Celler blev derefter vasket med PBS og derefter med DMEM indeholdende 10% føtalt bovint serum og antibiotika, og endelig resuspenderet i mediet. Celler blev derefter udpladet i en plade med seks holde én brønd blottet for celler og inkuberet i en fugtig 95% O
2/5% CO
2 atmosfære ved 37 ° C. Efter 1 time blev celler inkuberet med 2 × 10
3 fortynding af C2 eller C3 eller C4 eller VCO i 12 timer. Kontrolceller blev holdt i et separat inkubator at undgå tilstedeværelsen af damp. Ved slutningen af inkubationen blev cellerne lyseret, centrifugeret i 10 minutter ved 10.000 g ved 4 ° C, og supernatanten blev opsamlet. Proteinindholdet i supernatanten blev bestemt ved at følge metoden ifølge Lowry et al. [19].
Statistisk analyse
Data blev afledt af mindst tre uafhængige forsøg og analyseret ved envejs variansanalyse (ANOVA), hvor F-værdien angivet betydning, midler blev sammenlignet ved en post hoc intervaltest multiple. Alle værdier var middel ± SEM.
Resultater
Bioaktivitet guidet isolering og oprensning af olie fra frø af
Litsea cubeba
Den udvundne råolie damp fra
Litsea cubeba Salg frø blev undersøgt for anti-cancer-aktivitet i A549 lungecancerceller. Adskillige fortyndinger fra råolie blev fremstillet og hver fortynding blev tilsat i en af de 6 brønd dyrkningsplader mens andre 5 brønde indeholdt A549 NSCLC-celler. Dampen genereres fra hver fortynding forventedes breder sig i hele pladen og nå kræftceller. Dosisafhængig eksponering af dampe faldt levedygtigheden af A549 celler betydeligt på 72 timer med [10
3] og [10
2] fortyndinger hvorimod indtil [10
4] fortyndinger dampen havde nogen bemærkelsesværdig effekt på overlevelsesevne af celler (fig. 1A). Kromatografisk oprensning af
Litsea cubeba
frø æteriske olier gav anledning til fire typer af forbindelser, identificeret gennem Masse og
1H NMR-spektret med autentiske forbindelser og deres kemiske natur blev registreret som følger – C1: citronellal; C2: neo-isopulegol; C3: isopulegol og C4: citronellol (. Figur 1B) blev hver for sig tilsat ved en fortynding på [2 × 10
3] i en af de 6 brønds dyrkningsplade, andre 5 brønde indeholdt A549-celler. De dampe dannet efter tilsætning af olien til brønden blev udsat for celler i 72 timer. Det kunne ses fra fig. 1C, at C1 havde ringe aktivitet, C2 og C3 udviste 3 gange højere aktivitet sammenlignet med C1, mens C4 havde højeste aktivitet, hidtil dødelighed celle er berørt.
(A) Cellelevedygtighed af A549 lungecancerceller blev målt når de udsættes for dampe af forskellige fortyndinger (10
6 til 10
2) af råolie til 72 timer ved hjælp MTT assay og dataene blev udtrykt som% af celle overlevelsesevne i forhold til kontrol. (B) Kemiske strukturer af fire mest tilgængelige forbindelser (C1 Citronellal; C2 neo-isopulegol, C3 isopulegol; C4 citronellol) isoleret fra
Litsea cubeba
frø æterisk olie. blev observeret (C) Procentdel af celledød, når A549-celler blev udsat individuelt med disse forbindelser i 72 timer. (D) Effekt af VCO (C2:C3:C4 som 01:01:01) og C4 på celledød ved 72 timer blev observeret af MTT assay, som blev visualiseret ved mikroskopiske billeder. (E) Cell overlevelsesevne blev målt med forskellige tidsintervaller (24, 48, 72 h) med VCO eksponering på A549-celler. (F) Western blot af Akt-phosphorylering ved Thr
308, Ser
473 og total Akt i A549-celler behandlet uden (Con) med C1, C2, C3, C4 og VCO i 36 timer. β-actin tjente som intern loading kontrol. Værdier er middelværdier ± SEM af 3 individuelle eksperimenter. * P 0,05, ** p 0,01 versus kontrol og # p. 0,05 versus C4
Vi kombinerede C2, C3 og C4 på 1:01:01 forholdet at observere, om dampen ud af disse kombinationer kunne producere yderligere eller synergistisk effekt på celledød i C4. Dampen fra de kombinerede olier (VCO) udviste signifikant (p 0,05) større aktivitet i dræbende A549-celler sammenlignet med damp C4 alene (figur 1D.) At C2 og C3 producere yderligere effekter til C4. Vi brugte derfor dampen fra disse kombinerede olier dvs. VCO. Da VCO blev eksponeret ved forskellige tidsperioder, celledød forekom lineært mod tiden (Fig. 1E), hvilket indikerer muligheden for apoptose induktion ved VCO. Vi har udført eksperimenter for at undersøge mulighederne i C1, C2, C3, C4 forbindelse ved at bestemme hæmning af Akt aktivering. Eftersom i A549 lungecancerceller Pakt udtrykkes konstitutivt, blev Akt phosphorylering taget som markør for at evaluere anticancervirkning. C4 viste større inhiberende virkning i forhold til andre forbindelser (C1, C2, C3,), men VCO som er en kombination af C2, C3 og C4 producerede signifikant højere inhiberende virkning sammenlignet med C4 (fig. 1F). På dette tidspunkt, om VCO producerer cytotoksisk virkning på normale lungeceller ville være et relevant spørgsmål. For at overholde denne, dampe af C2, C3, C4 individuelt og VCO blev udsat for primær kultur af lungeceller fremstillet ud fra rotte. Vapor fra olier og VCO gav ikke nogen negativ effekt i cellen morfologi sammenlignet med de ubehandlede celler. Derudover har vi også bestemt inhiberingen af Pakt grund VCO i normale lungeceller og fandt, at der ikke var nogen ændring i Pakt (fig. S1A og B). Alle disse tyder på, at ved denne dosis af VCO, normale lunger celler påvirkes ikke mens samme dosis sker betydelig dødelighed af lungekræft celler.
VCO inducerer apoptose i lunge kræftceller
For at undersøge VCO effekt på A549 lungekræft celledød, brugte vi dobbelt fluorescens farvning med 6-CFDA og Annexin V-Cy3 for differentiering af levende, apoptotiske og nekrotiske celler. VCO-induceret phosphatidylserin translokation fra den indre til den ydre folder af plasmamembranen blev anerkendt af phosphatidylserin protein Annexin V konjugeret med Cy3. Ved 36 timer, udviste kontrol A549-celler farvning kun med 6-CFDA (grøn) hvorimod behandling med VCO øget antallet af Annexin V-Cy3 (rød) og 6-CFDA (grøn) dobbelt-farvede celler (fig. 2A), og denne forøget med tiden indikerer forøgelse af apoptotiske celler (fig. 2B). For at udvide vores observation videre, brugte vi JC-1 fluorescerende farvestof for behandlingen mitochondriemembranpotential. I levende celler, på grund af den fysiologiske membranpotentiale, JC-1 associeret med mitochondriale membran og danner J-aggregater, der udsender rød fluorescens mens depolariseret mitokondriemembran i apoptotiske celler indeholdt monomert JC-1, der fluorescerer grønt. Det kunne ses fra fig. 2C, at A549-celler blev udsender rød fluorescens henviser VCO inkuberet celler blev mærket med grøn fluorescens indikerer cellulær apoptose. VCO induceret apoptotisk celledød i lunge kræftceller var også tydeligt fra DNA stigen grundet oligonucleosomal fragmentering af kromatin (fig. 2D). Disse resultater indikerer, at VCO inducerer apoptose kun lungecancerceller.
(A) Annexin-Cy3 (rød) og 6-CFDA (grøn) dobbelt farvning af apoptotiske celler blev undersøgt ved fluorescensmikroskopi hvor VCO behandlede A549-celler viste både grønne og røde pletter og kontrol (ubehandlede) celler farves kun grønt. (B) Procentdel af apoptotiske A549-celler blev målt ved forskellige tidspunkter (0 timer, 12 timer, 24 timer, 36 timer) med VCO behandlinger. (C) mitrokondriemembranen blev observeret i kontrol og VCO eksponeret (36 timer) A549 lungecancerceller af JC-1-farvning-assay. (D) Apoptotisk DNA-fragmentering blev observeret ved VCO behandlet A-549 celler på 1,5% agarosegelelektroforese. Data er præsenteret som middelværdi ± SEM for tre uafhængige forsøg. * P 0,05, ** p 0,01 versus kontrol (0 h). Bar repræsenterer 20 um.
Hæmning af Akt phosphorylering med VCO krænker nedstrøms signalering for celle overlevelse
I størstedelen af kræftceller, Akt er en primær valg for terapeutisk intervention siden det spiller en central rolle i at fremme udødelighed og spredning af kræftceller. Phosphorylering af Akt på Thr
308 og Ser
473 er kritiske i at opretholde disse to vitale egenskaber. VCO behandling faldt dramatisk Akt fosforylering på Thr
308 og Ser
473 uden nævneværdig ændring af totalt Akt proteinniveau i A549 cancerceller (fig. 3A, B øverste panel). 36 timers VCO behandling reducerede Pakt Thr
308-niveau med 70% og Pakt Ser
473-niveau med 95% i forhold til 0 h dvs. kontrol kræftceller (fig. 3A, B nederste panel). Dette indikerer, at VCO kraftigt deaktiverer Akt, der tillader apoptosecyklus til fremskridt. Aktivering af Akt er reguleret af to diskrete kinases- mTOR og PDK1, tidligere ansvarlig for Akt fosforylering på Ser
473 mens sidstnævnte phosphorylerer på Thr
308. Vi undersøgte derfor PDK1 phosphorylering og mTOR udtryk som reaktion på VCO. Der var betydelige fald i PDK1 phosphorylering og mTOR udtryk i A549 celler på grund af VCO eksponering (fig. 3C, D). Siden Akt medierer sin virkning på den hæmning af apoptose gennem Bad, deaktivering af Akt grundet VCO kunne alvorligt kompromitterer med aktiveringen af Bad.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.