PLoS ONE: LAPTM4B-35, Er en cancerrelateret gen, associeret med dårlig prognose i TNM Stadier I-III Gastric Cancer Patients

Abstrakt

Baggrund

lysosomet-associeret transmembrane protein 4β -35 (LAPTM4B-35), et medlem af det mammale 4-tetratransmembrane spænder proteinsuperfamilien, er blevet rapporteret at være overudtrykt i flere kræftformer. Imidlertid ekspressionen af ​​LAPTM4B-35 og dets rolle i udviklingen af ​​gastrisk cancer (GC) er fortsat ukendt. Formålet med denne undersøgelse var at undersøge LAPTM4B-35-ekspression i GC, dens potentielle relevans for clinicopathologic parametre og rolle LAPTM4B-35 under gastrisk carcinogenese.

Metoder

I den foreliggende undersøgelse, paraffin -embedded prøver med GC (n = 240, herunder 180 parrede prøver) og 24 parrede friske frosne væv blev analyseret. QRT-PCR og immunohistokemi (IHC) blev anvendt til at analysere ekspressionen af ​​LAPTM4B-35 i GC. Virkningerne af LAPTM4B-35 på GC-celleproliferation, migration og invasion blev bestemt ved overekspression og knockdown assays.

Resultater

IHC viste, at LAPTM4B-35 blev udtrykt i 68,3% (123/180 ) af GC væv, mens der i 16,1% (29/180) af deres parrede tilstødende noncancerous gastriske væv (

P

= 0,000).

LAPTM4B-35

mRNA-niveauer i GC væv blev også signifikant forhøjet i forhold til deres parrede tilstødende noncancerous væv (

P

= 0,017). Overekspression af LAPTM4B-35 var signifikant associeret med graden af ​​differentiering, dybde invasion, lymphovascular invasion og lymfeknude metastaser (

P

0,05). Kaplan-Meier overlevelseskurver viste, at patienter med LAPTM4B-35-ekspression havde et signifikant fald i samlet overlevelse (OS) i trin I-III GC patienter (

P

= 0,006). Multivariat analyse viste høj ekspression af LAPTM4B-35 var en uafhængig prognostisk faktor for OS i fase I-III GC patienter (

P

= 0,025).

Konklusion

Disse resultater indikerer, at LAPTM4B-35 overekspression kan være relateret til GC progression og dårlig prognose, og kan således tjene som en ny forudsigelse markør for prognosen hos GC patienter

Henvisning:. Cheng X, Zheng Z, Bu Z, Wu X , Zhang L, Xing X, et al. (2015) LAPTM4B-35, Er en cancerrelateret gen, associeret med dårlig prognose i TNM Stadier I-III Gastric kræftpatienter. PLoS ONE 10 (4): e0121559. doi: 10,1371 /journal.pone.0121559

Academic Redaktør: Ken-ichi Mukaisho, Shiga Universitet Lægevidenskaben, JAPAN

Modtaget: April 10, 2014 Accepteret: 12. februar 2015; Udgivet: April 7, 2015

Copyright: © 2015 Cheng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering: Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr 30.471.677 og 81.141.024) og National Key Technology R D Program (Beijing Municipal Videnskab og Teknologi. Projekt Z121100007512010). De finansieringskilder bidrog til studiedesign, ydeevne, reagenser, materialer, dataanalyse og beslutning om at offentliggøre

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft er den tredje mest almindelige kræft i Kina og den førende årsag til cancer-relaterede dødsfald i Kina [1]. Størstedelen af ​​GC patienter er allerede i fremskredent stadium på diagnosetidspunktet (fase III og IV), hvilket gør prognosen at være trist, trods en forbedring kirurgisk og adjuverende behandling tilgang [2-5]. Uanset kemoterapi og bestemt kurativ kirurgi, næsten 60% af patienter med GC udvikle tilbagefald og til sidst dø af metastatisk sygdom [6]. GC progression er en multifaktoriel og flertrins proces, hvor arvede og miljømæssige faktorer spiller en afgørende rolle [7]. Tidligere observationer indikerer, at klassiske biomarkører og mellemstationer systemer, baseret på kliniske og patologiske fund, kan have deres begrænsninger på kliniske applikationer og IMPEL at udvikle nye molekylære biomarkører, som kan forudsige patientens resultat og behandling [8, 9].

lysosomer-associeret protein transmembrane 4 beta (LAPTM4B) er blevet oprindeligt klonet i hepatocellulære karcinomer (HCCs) ved Shao et al, som ligger ved kromosom 8q22, en region ofte forstærket i brystkræft og HCC [10, 11]. Det koder to proteiner med forskellig molekylvægt, 24 kDa og 35-kDa-proteinerne (LAPTM4B-24 og -35) med fire formodede transmembrane regioner [12]. Lokaliseringen af ​​LAPTM4B-35 blev fundet ikke kun i lysosomer, men også i plasmamembranen og interne organeller såsom Golgi-apparatet og endosomer [13]. Det er blevet rapporteret, at LAPTM4B-35 bredt blev udtrykt i forskellige typer af carcinom. Tidligere rapporter viste, at overekspression af LAPTM4B-35 er forbundet med ugunstige biologiske adfærd og dårlig prognose i mange kræftformer, såsom brystkræft [14], HCC [15-17], galdeblæren karcinom [18, 19], kolorektal cancer [20] , epitelial ovariecancer [21] og endometrisk carcinom [22]. Det er også blevet rapporteret, at allel variation af LAPTM4B var forbundet med genetisk modtagelighed af GC [23]. Desuden overekspression af LAPTM4B-35 ved transfektion af LAPTM4B cDNA fremmer celleproliferation, migration, invasion i HCC xenografter i nøgne mus og inducerer multilægemiddelresistens [24]. Knockdown af LAPTM4B af RNA-interferens omvendt vendt alle disse maligne fænotypiske træk i HCC [24, 25].

Men LAPTM4B-35 udtryk, dets relevans for de clinicopathologic egenskaber, og biologiske rolle LAPTM4B-35 i GC er fortsat uklare. I den foreliggende undersøgelse, vi havde til formål at identificere LAPMT4B-35 ekspression i GC og dens potentielle forbindelser med klinisk-patologiske træk, og dens prognostisk betydning. Desuden in vitro funktionelle assays blev udført for at karakterisere de biologiske virkninger af LAPTMEB-35 gastrisk tumorigenicitet.

Materialer og Metoder

Etik

Alle patienter havde underskrevet informeret samtykke for at opnå vævsprøver, og forsøgsprotokollen blev godkendt af Clinical Research etiske komité af Peking University Cancer Hospital.

Menneskelige gastrisk vævsprøver

i alt 240 (167 mænd og 73 kvinder, alderen 22-87 år, og den mediane alder var 60 år) formalin fast paraffin indlejret GC væv, herunder 180 parrede kræft og matches tilstødende noncancerous maveslimhinden væv, blev indsamlet fra GC patienter, der gennemgår gastrektomi ved Peking University Cancer Hospital fra januar 2003 til december 2011. Den kliniske og histologiske oplysninger for hver enkelt sag blev også indsamlet i henhold til godkendte institutionelle retningslinier. De 1997 UICC-TNM kriterier blev anvendt til klassificering af gastrisk kræft. Den mediane follow-up varighed siden tidspunktet for diagnosen var 26,2 måneder (interval, 2.4-119.0 måneder). I alt 112 (46,7%) patienter døde i opfølgningsperioden.

Immunhistokemi

Paraffinsnit (4 pm) blev afvokset og rehydreret i xylem og ethanol. Immunhistokemi blev udført som tidligere beskrevet [16] under anvendelse af anti-LAPTM4B-35-antistof (1: 200) (Givet af Pro RL Zhou.). Som negative kontroller blev sektionerne behandlet som den samme protokol, bortset fra at de blev inkuberet natten over ved 4 ° C i blokeringsopløsning uden det primære antistof.

Ekspressionen af ​​LAPTM4B-35 blev vurderet af to erfarne patologer (Y Sun og B Dong), som arbejdede uafhængigt og blev blindet for patienternes kliniske resultater. Uoverensstemmelser mellem observatørerne blev fundet i mindre end 10% af de undersøgte dias, og konsensus blev nået efter yderligere gennemgang. Farvning vurdering blev bare brugt de semikvantitative metoder til at klassificere LAPTM4B-35 udtryk som negative og positive farvede immunoreaktive celler. Forholdet mellem positivitet blev scoret som ” 0 “( 10% positive tumorceller), ” 1″ (10-50% positive tumorceller), og ” 2 “( 50% positive tumorceller). Den farvningsintensitet blev scoret som ” 0 “(ingen farvning eller svagt farvede), ” 1″ (moderat farvning), eller ” 2 “(stærk farvning). Summen af ​​farvningsintensitet score og den procentvise score blev anvendt til at definere LAPMT4B ekspressionsniveauer: 0-2, negativ ekspression og 3-4, positivt udtryk (14). Den positive udtryk kun vurderet af afsnittene med mindst 10% positive område af tumorer.

Celledyrkning, LAPTM4B-35 ekspressionsplasmid og hCas9 /gRNA transfektion

mavekræft cellelinjer (SGC- 7901, BGC-823, MGC-803, MKN-28 og AGS) blev dyrket i DMEM (Wisent Inc., St-Bruno, QC, Canada) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) (HyClone, Logan, UT, USA) og 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C i en atmosfære af 5% CO

2.

pcDNA3

.

0-AF

indeholder hele ORF af LAPTM4B producerer LAPTM4B-35 protein blev begavet af professor RL Zhou [11]. Transfektionen blev udført med lipofectamin 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge fabrikantens protokol. Positive cellekloner blev opnået ved antibiotisk selektion med G418 (Gibco, Grand Island, NY) i en koncentration på 800 ng /ml.

hCas9 og gRNA vektor blev fået fra Kina zebrafisk Resource Center (CZRC). Den fulde længde af Cas9 cDNA blev klonet i pXT7 vektor og lineariseret, og capped mRNA blev syntetiseret under anvendelse mMessage mMACHINE mRNA transkription syntese kits (Life Technologies, Carlsbad, Californien, USA). De gRNA primersekvenserne anvendt var: forward primer, 5′-TACGACTCACTATAGGGGGATGGTGCCGGTGCGGACAGTTT TAGAGCTAGAAATAGC-3 ‘, og revers primer: 5′-AGCACCGACTCGGTGCCACT-3’.The protokol blev efterfulgt af den tidligere offentliggjorte papir [26]. hCas9 mRNA (3 ng /pl) og gRNA (0,2 ng /pl) blev cotransficeret ind i SGC-7901 celle udført med Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA).

RNA-isolering, kvantitativ real-time revers transkription PCR (QRT-PCR)

Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og revers transkriberet til cDNA med M-MLV revers transkriptase (Promega, Madison, WI, USA) ifølge producentens anvisninger. Real-time PCR blev udført under anvendelse af ABI 7500 Fast real-time PCR-system (Life Technologies, Carlsbad, Californien, USA). β-actin blev anvendt som en intern kontrol. Primersekvenserne anvendte er angivet nedenfor: LAPMT4B-35: forward primer: 5′-GGAAGCAGGACAGCCAACTT-3 ‘, revers primer: 5′-TTATTCTCGATCTCACAACCAAAC-3’; β-actin: forward primer: 5’CCTGTGGCATCCACGAAACT-3 ‘reverse primer: 5’GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3’

Cell proliferation assay

Cell proliferation blev målt ved Cell Counting Kit-8. (CCK-8) (Dojindo, Japan) i henhold til producentens protokol. Et volumen på 100 pi cellesuspension (3000 celler per brønd) blev inkuberet i en 96-brønds plade (Costar, Corning, NY) i 24, 48, 72, 96 t. 10 pi af CCK-8-opløsning blev tilsat til hver brønd og inkuberet i 3 timer ved 37 ° C. Absorbans-værdier for alle brønde blev derefter bestemt ved 450 nm med en referencebølgelængde på 630nm i Microplate Reader (Bio-Rad, USA). Eksperimentet blev udført tre gange og gentaget to gange.

sårheling assay

Cell migration blev målt ved sårhelende assay af IncuCyte HD-systemet (IncuCyte ZOOM, Essen BioScience, USA). Celler blev podet i plader med 96 brønde med en densitet på 6 x 10

4 celler pr. Sår blev foretaget gennem konfluent monolag celler med en utrolig blok og cellerne blev vasket med 1 x PBS, dyrket i DMEM medium med 10% føtalt bovint serum. Fotografier af celler blev afbildet ved anvendelse af IncuCyte HD-systemet ved 4-timers intervaller fra 2 separate regioner pr brønd med en 10x objektiv. Værdier fra 2 regioner i hver brønd blev samlet og gennemsnittet for alle 3 replikater

Transwell invasion assays

Transwell (8 um porestørrelse, Cell Biolabs, USA). Blev assayet anvendt til at analysere celleinvasion ifølge producentens instruktioner. 8 × 10

4 celler blev anbragt i de øvre kamre i serumfrie medier, og de nedre kamre blev fyldt med DMEM og 10% FBS. Efter inkubation i 72 timer ved 37 ° C blev ikke-invasive celler på den øverste overflade af membranerne fjernes med en vatpind. Membranerne blev fikseret med methanol i 10 minutter og farvet med 0,5% krystalviolet i 10 minutter. Cellerne på undersiden af ​​filteret var fra fem tilfældigt valgte mikroskopiske synspunkter blev talt.

Western blot-analyse

protein ekspressionsniveauer af GC cellelinjer blev målt ved Western Blot-analyse. Celler blev lyseret i præ-kølet RIPA lysebuffer (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) indeholdende protease inhibitor cocktail (Roche, Basel, Schweiz) i 30 minutter efter centrifugering ved 15.000 g i 20 minutter blev supernatanten opnået. 50 ug af proteinekstrakter blev separeret ved 10% SDS polyacrylamidgelelektroforese og overført til 0,45 um polyvinylidendifluorid (PVDF) membran (Whatman, Tyskland). Membranen blev blokeret i 1 time ved stuetemperatur med blokeringsbuffer (pH 7,6) indeholdende 5% fedtfri tørmælk, derefter inkuberet med anti-LAPTM4B-35-antistof (1: 800; Givet af Prof. RL Zhou) ved 4 ° C natten . Muse anti-humant β-actin-antistof (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) blev påført som en intern kontrol. Immunoreaktive bånd blev visualiseret under anvendelse af et kemiluminescens påvisningssystem (Pierce Biotechnology, Rockford, IL).

Statistisk analyse

Chi-square test blev anvendt til at sammenligne forskellen i LAPTM4B-35-proteinekspression mellem GC væv og tilstødende noncancerous væv. Ubetingede logistisk regressionsanalyse modeller blev brugt til at analysere relationer mellem LAPTM4B-35-ekspression og klinisk-patologiske parametre justeres efter køn status. Forskellen på

LAPMT4B-35

mRNA-ekspression mellem GC og tilstødende noncancerous væv blev analyseret ved Wilcoxon sammenhørende par test.

Samlet overlevelse (OS) kurve blev beregnet med Kaplan-Meier-metoden og analyseret med log-rank test. Relative risici (RRS) af død i forbindelse med LAPTM4B-35-ekspression og andre prediktorvariabler blev estimeret fra den univariate Cox proportional hazard model først. Multivariate Cox modeller blev også konstrueret til at estimere RR for LAPMT4B-35-ekspression. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS software statistisk pakke (version 20.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA). En to-sidet

P Drømmeholdet værdi mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikans.

Resultater

Expression analyse af LAPTM4B-35 i GC cellelinjer og GCS

Vi indledningsvist undersøgt udtryk for

LAPTM4B-35

med RT-PCR i 5 GC cellelinier (MGC-803, BGC-823, MKN-28, SGC-7901 og AGS), og derefter opdaget sin proteinekspression ved Western blot. Resultaterne viste, at LAPTM4B-35 blev udtrykt i alle cellelinjer i både mRNA og protein niveauer (Fig 1A, øvre og nedre panel), så valgte vi BGC-823 og SGC-7901 celler for vores følgende celle funktionstest.

(A) mRNA (øvre panel) og protein (nederste panel) ekspression af LAPTM4B-35 i fem gastriske cancercellelinier. (B) i forhold mRNA ekspressionen af ​​

LAPTM4B-35

i mavekræft og deres tilstødende noncancerous væv.

LAPTM4B-35

ekspression blev også påvist i 24 par af reseceret GC prøver ved QRT-PCR. Som vi kan se i figur 1B,

LAPTM4B-35

udtryk i GC væv var signifikant forhøjet sammenlignet med parrede tilstødende noncancerous væv (

P

= 0,017) (figur 1B).

LAPTM4B-35 protein-ekspression blev hyppigt observeret i humane GC

Vi undersøgte udtryk for LAPTM4B-35 i GC og tilstødende noncancerous væv ved hjælp af immunhistokemisk analyse. LAPTM4B-35 udtrykte ikke i normal gastrisk mucosa (Fig 2A), men udtrykt i den intestinale metaplasi, dysplasi læsioner (data ikke vist) og tumorceller, og hovedsagelig lokaliseret i cytoplasmaet eller på cellemembranen (Fig 2B og 2D -2H). LAPTM4B-35 ofte observeret i GC væv sammenlignet med matchede tilstødende noncancerous slimhinde (68,3% vs. 16,1%,

P

= 0,000) (Tabel 1).

(A) LAPTM4B-35 var ikke udtrykkes i normal maveslimhinden. (B) LAPTM4B-35 blev udtrykt i dysplasi læsion. (C) LAPTM4B-35 negativ farvning i GC væv. (E-H) LAPTM4B-35 positiv farvning i GC væv. Original forstørrelse:. 100 ×

Forholdet mellem LAPTM4B-35-ekspression og klinisk-patologiske karakteristika

Vi analyserede forholdet mellem LAPTM4B-35-ekspression og klinisk-patologiske karakteristika GC patienter. Som køn, de objekter i vores undersøgelse har deres afvigelse (167 vs. 73, tabel 2), vi beregnet deres forhold ved logistisk regressionsanalyse og justeret for køn status. LAPTM4B-35 blev observeret hyppigere dårligt differentierede GCS sammenlignet med moderate-godt differentierede dem (65,4% vs. 57,9%,

P

= 0,017). Endvidere blev LAPTM4B-35-ekspression er forbundet med lymphovascular invasion (

P

= 0,000), dybde invasion (

P

= 0,016) og lymfeknude metastaser (

P

= 0,029) (tabel 2).

LAPTM4B-35 udtryk og prognose af GC patienter

fig 3 viser analysen af ​​LAPTM4B-35-ekspression og kliniske resultater. Kaplan-Meier overlevelseskurver viste, at der var en tendens til kortere samlet overlevelse (OS) i GC patienter med LAPTM4B-35 positivt udtryk i forhold til de negative (

P

= 0,064, log-rank = 3,425) (Fig 3A). Efter patienterne blev stratificeret efter TNM I-III eller patienter uden lypmphovascular invasion, patienter med LAPTM4B-35 positive udtryk viste signifikant kortere OS end de negative (

P

= 0,006 og

P

= 0,001 henholdsvis) (fig 3B og 3D).

A, Kaplan-Meier-overlevelseskurver for OS i GC patienter med LAPTM4B-35 positive og negative udtryk. (B, C, D) Kaplan-Meier-kurver for OS i undergruppe af GC patienter stratificeret efter TNM stadie I-III, IV og patienter uden lymphovascular invasion henholdsvis.

Resultatet af univariate og multivariate Cox modeller til OS af GC patienter i TNM fase i-III udstillet, at dybden af ​​invasion (RR = 3,103, 95% CI: 1,427-6,748;

P

= 0,004), lymfeknude metastaser (RR = 3,015, 95% CI: 1,552-5,858;

P

= 0,001) og LAPTM4B-35 ekspressionsniveauet (RR = 2,249, 95% CI: 1,242-4,072;

P

= 0,007) signifikant påvirket overlevelse GC (tabel 3); desuden LAPTM4B-35 positivt udtryk var en uafhængig prognostisk faktor (RR = 1,897, 95% CI: 1,041-3,457;

P

= 0,025). Lymfeknudemetastase (RR = 2,665, 95% CI: 1,362-5,213;

P

= 0,001) også uafhængigt forudsagt OS (tabel 3)

LAPTM4B-35 forfremmet tumor celle. proliferation

for at undersøge virkningen af ​​LAPMT4B-35 i funktionen af ​​cellebiologi blev to cellelinier etableret. BGC-823 og SGC-7901 celler præsenterer relativt lavere eller højere udtryk for LAPTM4B-35 blev hver udvalgt til overekspression og knockdown assay (Fig 1A). I den første, cellelinien BGC-823-AF overudtrykker LAPTM4B-35 stabilt blev etableret, og MOCK blev anvendt som kontrol for denne cellelinje. For det andet blev LAPTM4B-35 stabilt slået ned towarding til SGC-7901 (hCas9 /gRNA) af type II grupperet regelmæssigt spatierede korte palindrome repeats (CRISPR) systemet, og resultaterne blev identificeret ved Western blot (Fig 4A).

(A) ekspression af LAPTM4B-35 i BGC-823 og SGC-7901 efter transfektion med LAPTM4B ekspressionsvektor og hCas9 /gRNA blev identificeret ved Western-blot. BGC-823-AF viser BGC-823-overudtrykkende klon. (B) Vækstkurver bestemt ved CCK-8 assay. Venstre panel: overekspression af LAPTM4B-35 fremmer hurtig stigning i BGC-823 celleproliferation sammenlignet med vildtype og MOCK. Midterste panel: knockdown af LAPTM4B-35 udtryk hæmmer celledeling i forhold til kontrol og SGC-7901. Højre panel: anden celle proliferation tilstand efter inkubation 3 dage BGC-823 og 2 dage for SGC-7901. *

P

0,05, BGC-823-AF vs MOCK, knockdown vs SGC-7901. For alle data middelværdi og standardafvigelse repræsenterer gennemsnittet af tre uafhængige forsøg.

Cell proliferationsassay blev målt ved CCK-8 celletælling kit. Absorbansen værdien af ​​BGC-823-AF celler i 72 timer efter spredning var signifikant højere end de forælder celler og imiterede celler, og resultatet var lige overfor ved at banke ned af LAPTM4B-35 i SGC-7901-celler (Fig 4B).

LAPTM4B-35 forbedrede tumor celle migration og invasion evne

Efter transfektion med pcDNA3.0-aF og hCas9 /gRNA, vi udførte sårheling assay til at analysere migration evne LAPTM4B-35 overekspression /knockdown gastriske kræftceller (fig 5A). Resultaterne viste, at LAPTM4B-35 forfremmet BGC-823 (BGC-823-AF) celle migration sammenlignet med BGC-823 og MOCK (

P

0,05), og nedregulering af LAPTM4B-35 udtryk kunne vende denne fænomen i SGC-7901 celler (

P

0,05, figur 5B)

(A) venstre øverste panel:. sårhelende assay af BGC-823-aF, MOCK og BGC-823; venstre nedre panel: sårhelende assay af hCas9 /gRNA, kontrol og SGC-7901. Billeder blev taget til fange af en omvendt fase-kontrast mikroskop ved 24 timer efter sårede. Forstørrelse = 100 ×. (B) Kvantificering af sårhelende satser. For alle data middelværdi og standardafvigelse repræsenterer gennemsnittet af tre uafhængige forsøg.

Derfor blev virkningen af ​​LAPTM4B-35 om invasionsevne af tumorceller undersøgt under anvendelse Transwell assay (Fig 6A). Vi fandt, at det invaderede celletal var signifikant højere i LAPTM4B-35-transfekterede BGC-823 celler og lavere i de Knockdown SGC-7901 celler, end i deres kontrol- celler, henholdsvis (

P

0,05, fig 6B). Disse resultater tyder på, at LAPTM4B-35 fremmer migration og invasion af gastriske kræftceller

(A), øverste venstre panel:. Transwell assay af BGC-823-AF, Mock og BGC-823 celler; venstre nedre panel: transwell assay af hCas9 /gRNA, kontrol og SGC-7901. Invasive celler blev talt i tilfældigt 5 udvalgte mikroskopiske felter. Forstørrelse = 100 ×. (B) Kvantificering af trækkende og invasive celler. For alle data på middelværdi og standardafvigelse repræsenterer gennemsnittet af tre uafhængige forsøg.

Diskussion

GC er en meget heterogen sygdom, hvor selv samme kliniske og patologiske træk fører til forskellige resultater [ ,,,0],27, 28], hvilket indikerer, at TNM for GC har deres begrænsning og IMPEL at søge efter nye molekylære biomarkører, som kan forudsige patientens udfald og behandling. Den onkogen LAPTM4B-35 er beliggende på kromosom 8q22, og gevinst på DNA-kopi nummer på kromosom 8q22 er en hyppig fund i GC ifølge vores tidligere undersøgelse (upublicerede data). I brystkræft, overekspression af LAPTM4B-35 og 8q22 forstærkning blev bidraget til

de nove

kemoresistens til antracykliner og er tolerant for metastatisk tilbagefald [29].

I denne undersøgelse undersøgte vi

LAPTM4B-35

udtryk i 24 gastrisk kræft og deres parrede noncancerous gastrisk kirurgiske prøver ved QRT-PCR og fandt, at

LAPTM4B-35

mRNA udtryk niveau i mavekræft var signifikant forhøjet sammenlignet med i den parrede noncancerous væv gruppe. Desuden immunhistokemisk analyse i 180 par mavekræft viste LAPTM4B-35 blev overudtrykt i GC væv (68,3%) sammenlignet med deres parrede noncancerous slimhinde (16,1%). LAPTM4B-35 fremmer tumorvækst og tolerance over for den metaboliske og genetiske stress gennem induktion af autophagy [30, 31]. I vores nuværende undersøgelse blev funktionen af ​​LAPTM4B i gastrisk cancer undersøgt ved in vitro-assays. Overekspression af LAPTM4B-35 i BGC-823 celler også øget cellernes levedygtighed i serum fri dyrkningsbetingelser så godt. Hvis dette fænomen skyldes autophage er nødvendig for at blive undersøgt.

Desuden har vi også analyseret korrelationen mellem LAPTM4B-35 udtryk med klinisk-patologiske parametre i mavekræft. Høj LAPTM4B-35-ekspression var signifikant korreleret med graden af ​​differentiering, lymphovascular invasion, dybde invasion og lymfeknude metastaser, hvilket tyder på, at LAPTM4B-35 kan i udstrakt grad aktiveres i gastrisk kræft og det kan spille en afgørende rolle i gastrisk carcinogenese og tumor progression. Som tumoren lymphovascular invasion og lymphonode metastaser er meget vigtige kliniske prognostiske indikatorer for tumor tilbagefald, vi gjorde en overlevelse analyse. Kaplan-Meier kurver for forskellige niveauer af LAPTM4B-35-ekspression og tumor stadie eller lymphovascular invasion afslørede, at LAPTM4B-35 positive patienter har betydeligt dårligere OS sammenlignet med LAPTM4B-35 negative i TNM stadier I-III eller uden lymphovascular invasion undergruppe. Multivariat Cox regressionsanalyse i denne undergruppe viste, at blandt alle analyserede faktorer, LAPTM4B-35-ekspression er en uafhængig prognostisk faktor i mavecancerpatienter i TNM stadie I-III, men i fase IV. Det er rimeligt, fordi patienten i fase IV er ude af stand til at modtage radikal operation og kan behandles med mange andre forskellige palliative behandlinger, som alle ville have betydning for prognosen. Disse resultater indikerer, at tilbøjeligheden til LAPTM4B-35 specifikt kan forudsiger de mest aggressive og dødelige typer af mavekræft i tilfælde med tidlig og uden distal metastase eller uden lymphovascular invasion.

I vores foreliggende undersøgelse fandt vi, at LAPTM4B -35 positivt udtryk generelt korreleret med dårligere prognose i GC patienter stratificeret af tumor stadie eller lymphovascular invasion. For funktionen af ​​LAPTM4B-35 i GC, vi yderligere udføres in vitro assay. Overekspression af LAPTM4B-35 i BGS-823-celler viste en signifikant stigning i celleproliferation, migration og invasion, og nedregulering af LAPMT4B-35 blyholdig til de modsatte resultater. Zhou et al. har vist, at LAPTM4B-35 overekspression fremmer celle overlevelse, dereguleret proliferation og migration i HCC celler [12]. Nylige undersøgelser har rapporteret, at LAPTM4B-35 var forbundet væsentligt med en dårligere klinisk resultat i mange humane maligniteter, såsom HCC [16], metastatisk ovariecancer tumor [32], galdeblæren [19, 33], ekstrahepatisk cholangiocarcinom [34] og endometriecancer [22]. Disse akkumulerede beviser støtter vores nyeste resultater, hvilket indikerer, at LAPTM4B-35 overekspression kan spille en vigtig rolle i den maligne transformation og progression af GC.

De molekylære mekanismer i LAPTM4B-35 i tumor progression egenskaber er stadig uklart. Nogle tidligere undersøgelser viste, at LAPTM4B-35 er nødvendig for lysosom homeostase, forsuring og funktion, og at LAPTM4B-35 gør tumorceller resistente over for lysosomer-medieret celledød udløst af miljømæssige og genotoksiske belastninger [30, 31]. Overekspression af LAPTM4B-35 kunne aktivere nogle proto-onkogener, såsom c-myc, c-jun og c-fos [35], og fremme proliferation, migration og invasion i nogle humane cancer linjer, der vil øge væksten og metastaser af HCC xenografter i nøgne mus [36]. Relaterede undersøgelse indebar, at LAPTM4B kan forbedre celledeling eller overlevelse gennem inddragelse i signaltransduktionsvejen, såsom phosphatidylinositol 3-kinase-protein kinase B vej. Og LAPTM4B-35 kan interagere med visse cancer-relaterede proteiner, som proteinphosphatase 2A og proteinkinase C [10]. Li et al fandt, at LAPTM4B-35 motiverer multilægemiddelresistens af cancerceller ved at fremme drug efflux og anti-apoptose ved at aktivere PI3K /AKT signalering [24], hvilket indikerer, at LAPTM4B-35 kan være et nyt mål for terapi. Den funktionelle rolle og mekanisme LAPTM4B i GC har brug for yderligere undersøgelse.

Som konklusion, den aktuelle undersøgelse viser, at LPTM4B-35 overekspression spiller en vigtig rolle i at fremme celleproliferation, migration og invasion i gastrisk kræft. LAPTM4B-35 positivt udtryk i mavekræft væv korreleret med dårligt resultat, og viste sig at være en uafhængig prognostisk faktor i undergruppe af GC patient i TNM stadier I-III eller uden lymphovascular invasion. Således kan LAPTM4B-35 udgør en nyttig biomarkør at forudsige prognosen hos visse undergruppe af GC. Hertil kommer, som de roller LAPTM4B-35 i begrænsende lysosomer-medieret celledød og fremme autophagy har betydelige overlevelse virkninger i kræftceller, og LAPTM4B-35 blev over-udtryk i en stor del af mavekræft, kan det være et nyttigt mål til behandling af undertype gruppen af ​​mavekræft.

Støtte Information

S1 datasæt. Individuelle resultater af relativ mRNA af LAPTM4B-35-ekspression, celleproliferation, migration og invasion, overlevelse pathients og klinisk-patologisk features.

(Excel)

doi:10.1371/journal.pone.0121559.s001

(XLS)

Acknowledgments

We tak Guoshuang Feng (fra kinesisk center for sygdomskontrol og forebyggelse) for hans venlige hjælp i statistik data.