PLoS ONE: Interleukin-6 Expression under Gravitational stress på grund af vibrationer og Hypergravity i follikulært kræft i skjoldbruskkirtlen celler

Abstrakt

Det er kendt, at udsætte cellelinjer

in vitro

til parabolflyvninger ændrer deres genekspression og protein produktionsmønstre. Parabolflyvninger og rumflyvning generelt er ledsaget af forbigående hypergravity og vibrationer, der kan påvirke cellerne og derfor må overvejes også. For at estimere de mulige virkninger af forbigående hypergravity og vibrationer, vi undersøgte virkningerne af disse kræfter separat bruger dedikerede jordbaserede anlæg. Vi placerede follikulært skjoldbruskkirtlen ML-1 og CGTH W-1 kræftceller i en bestemt centrifuge (Musik Multi Sample Incubator Centrifuge; Sahc Short Arm Menneskelig Centrifuge) simulerer hypergravity faser, der opstår i løbet af en (P1) og 31 parabler (P31) af parabolsk flyvninger, henholdsvis. På Vibraplex enheden blev de samme cellelinier behandlet med vibrationer bølger svarende til dem, der opstår i løbet af en hel parabolflyvning der varer i to timer. Efter de forskellige behandlinger, blev cellerne høstet og analyseret ved kvantitativ real-time PCR, der fokuserer på de involverede i dannelsen (

ACTB

,

MYO9

,

Tubb

,

VIM

,

TLN1

, og

ITGB1

) og modulerende (

EZR

,

RDX

, og

MSN

) cytoskelettet, samt de kodning vækstfaktorer (

EGF

,

CTGF

,

IL6

, og

IL8

) eller proteinkinaser (

PRKAA1

og

PRKCA

). Analysen afslørede ændringer i flere gener i begge cellelinier; blev dog færre gener påvirkes i ML-1 end CGTH W-1 celler. Interessant

IL6

var den eneste gen, hvis ekspression blev ændret i begge cellelinier ved hver behandling, mens

PKCA

transkription forblev upåvirket i alle eksperimenter. Vi konkluderer, at en PKCA-uafhængig mekanisme af

IL6

genaktivering er meget følsomme over for fysiske kræfter i skjoldbruskkirtlen celler dyrket

in vitro

som monolag

Henvisning:. Ma X, Wehland M, Aleshcheva G, Hauslage J, Wasser K, Hemmersbach R, et al. (2013) Interleukin-6 Expression under Gravitational stress på grund af vibrationer og Hypergravity i follikulært kræft i skjoldbruskkirtlen celler. PLoS ONE 8 (7): e68140. doi: 10,1371 /journal.pone.0068140

Redaktør: Gayle E. Woloschak, Northwestern University Feinberg School of Medicine, USA

Modtaget: April 15, 2013; Accepteret: 25. maj 2013; Udgivet: 2 juli 2013

Copyright: © 2013 Ma et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af den tyske rumfartsorganisation DLR (BMWi give 50WB1124), såvel som af den Europæiske Rumorganisation (ESA tilskud CORA-GBF-2010-203 med kontraktnummer 4000102119) og Aarhus Universitet, Danmark. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

In vivo

tumorer omfatter neoplastiske celler, ikke-maligne stromale celler og migrerende hæmatopoietiske celler [1]. Forskellige tumorer er domineret af fænotypisk og funktionelt heterogene kræftceller, der styrer de komplekse vekselvirkninger mellem celletyper og regulere tumorvækst, progression, metastase, og angiogenese [2]. Således neoplastiske eller cancerceller er hovedbestanddelen af ​​maligne tumorer. Deres analyse kan indikere mulige måder ondartet tumor udvikling og behandling.

Vi fokuserede på follikulært thyreoidea carcinomer, som er maligne epiteliale tumorer, der udtrykker follikulært mønstre. Normalt er de indkapslede [3] – [5].

In vivo

, de neoplastiske celler driver udviklingen af ​​kræft er epitelceller på forskellige stadier af dedifferentiering. Neoplastisk thyroide follikulære cancerceller er repræsenteret ved linierne ML-1, FTC-133 og CGTH-W1 til denne undersøgelse [5] – [7]. I de senere år har thyreoideacancerceller blevet vist at være påvirket inkuberet på en Random Positioning Machine (RPM) eller en clinostat, indretninger udviklet til at simulere vægtløshed på Jorden [8] – [12]. Vi fandt ændringer i to- til tre-dimensionelle vækst af kræft i skjoldbruskkirtlen celler dyrket på RPM, ledsaget af en ændring i koncentrationen af ​​forskellige proteiner og ekspression af et stort antal gener [8] – [12].

RPM er et apparat beregnet til at simulere vægtløshed på Jorden. Til dette formål er prøverne roteres rundt om alle tre rumlige retninger på en vilkårlig måde. I løbet af eksperimentet, retningen af ​​tyngdekraften vektor ændrer konstant og virkningerne kan blive udjævnet med tiden [13]. Den ændrede adfærd cancercellerne inkuberet på denne maskine kan skyldes ændret tyngdekraft (simuleret vægtløshed). For at bevise dette, vi udsatte skjoldbruskkirtlen cancerceller og endotelceller til kortsigtet ægte vægtløshed genereret i fly under parabolflyvninger. Udsættelse for real vægtløshed førte til lignende, men ikke identiske, resultater i forhold til de RPM eksperimenter [14], [15]. Disse forskelle kan skyldes det faktum, at RPM ikke simulere vægtløshed for vores valgte cellesystem og undersøgte parametre, eller at vægtløshed afbrydes af hypergravity faser og ledsaget af vibrationer. Under en parabolflyvning, hver af de 31 parabler normalt fløjet omfatter 22 s af vægtløshed og perioder med en

g

og 1,8

g

, samt vibrationer forårsaget af motoren [14], [16].

for at undersøge de komplekse mekaniske virkninger, der påvirker cellerne under en parabolflyvning, er det vigtigt at karakterisere indflydelse kortsigtede hypergravity og vibrationer på celler uden at udsætte dem for vægtløshed. Således udførte vi separate hypergravity og vibrationer simuleringstest anvendelse af fremgangsmåder, der simulerede acceleration profil af en eller 31 paraboler, samt vibrationerne opstår under hele flyvningen. Desuden har vi fokuseret på ekspressionen af ​​de cytokiner IL-6 og IL-8 samt proteinkinaser.

Metoder

Cell Kultur

menneskelige skjoldbruskkirtlen kræftceller ML-1 [5] og CGTH-W1 [6] blev podet i T75 cm

2 eller T25 cm

2 dyrkningskolber og fodret RPMI 1640-medium (Invitrogen, Eggenstein, Tyskland) suppleret med 10% føtalt bovint serum (Biochrom, Berlin, Tyskland), 100 enheder penicillin /ml og 100 ug streptomycin /ml, og dyrket indtil sammenløb.

Hypergravity Eksperimenter

Hypergravity blev genereret ved hjælp af Multi Sample Incubator Centrifuge ( musik, DLR, Köln, Tyskland), der blev anbragt i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO

2. Drevet af et særligt computerprogram, blev cellerne udsat for en hypergravity profil, der opstår i løbet af en parabel (P1) og 31 parabler (P31). Denne enhed blev anvendt til behandling af cellerne, hvis mRNA blev bestemt efterfølgende. Confluently dyrkede celler fra T75 cellekultur kolber blev trypsiniseret og overført til 5-ml rør. Rørene blev fyldt med celledyrkningsmedium og cellerne fik lov til at ækvilibrere før centrifugering. Svarende til fikseringstidspunkter af cellerne under en parabolflyvning blev cellerne eksponeret enten til en cyklus af to 20-s-lang 1.8

g

faser afbrudt af en 22-s pause (P1) eller til 2 h varig 1.8

g

faser (P31). Desuden har vi udført eksperimenter på den korte arm Humant Centrifuge (Sahc, DLR, Köln, Tyskland), med celler fra T75 celle kultur flasker grund af den høje mængde materiale nødvendig til analysen. På denne enhed, vi udsat celler til en kontinuerlig hypergravity fase på ca. 2 timer, svarende til 31 parabler. Vi indsamlede n = 5 statisk en

g

kontrol og n = 5 1,8

g

hyper-

g

prøver til Western blot-analyser (n = 5, P31), som samt n = 5 statisk 1

g

kontroller (P1), n ​​= 5 statisk 1

g

kontroller (P31), og n = 5 1.8

g

hyper-

g

(P1 og P31) for real-time PCR, hhv. Den 1

g

kontroller blev dyrket parallelt i en tilstødende identisk inkubator.

Vibration Eksperimenter

T25 dyrkningskolber indeholdende 90% konfluerende monolag fastsat på Vibraplex platformen i en inkubator ved 37 ° C med 5% CO

2 i luft og behandles ifølge en protokol offentliggjort tidligere [14]. Kort fortalt anvender Vibraplex blev cellerne udsættes for vibrationer kan sammenlignes med dem, der opstår under parabolflyvninger [16]. Frekvenser spænder fra 0,2 Hz til 14 kHz blev tilpasset, svarende til de tre faser: trække op (1,8

g

), frit fald (vægtløshed, μ

g

), og træk (1,8

g

), som registreres og analyseres af Schmidt [16] i ca. 2 timer, hvilket er hvor længe de 31 parabler af rigtige parabolske missioner sidste. Bagefter blev mediet fjernet, og cellerne skrabet af og opsamles i 3 ml kold phosphatpufret saltopløsning (PBS). Efter en efterfølgende centrifugering (4000 rpm) blev pelleten opbevaret ved -80 ° C i Western blot-analyse og PCR.

1

g

kontroller blev dyrket særskilt i samme inkubator. Vi indsamlede n = 5 statiske 1

g

kontroller og n = 5 2 timers vibrationer prøver til Western blot-analyser (n = 5, P31) samt n = 5 prøver til real-time PCR, hhv.

RNA Isolation

Celler til kvantitativ real-time PCR blev fikseret med RNA

senere

(Applied Biosystems, Darmstadt, Tyskland) i forholdet 4:01. Efterfølgende blev kolberne opbevaret ved 4 ° C. Umiddelbart før brug, blev RNAlater erstattet af PBS (Invitrogen, Darmstadt, Tyskland). Cellerne blev skrabet under anvendelse celle skrabere (Sarstedt, Nümbrecht, Tyskland), overført til rør og pelleteret ved centrifugering (2500 x

g

, 10 min, 4 ° C). Af RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) blev anvendt ifølge producentens instruktioner for at isolere total RNA. RNA-koncentrationer og kvalitet blev bestemt spektrofotometrisk ved 260 nm ved hjælp af en NanoDrop instrument (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA). Det isolerede RNA havde en A260 /280-forhold på . 1.5

cDNA for kvantitativ realtids-PCR blev derefter opnået med den første streng cDNA Synthesis Kit (Fermentas, St. Leon-Rot, Tyskland) ved anvendelse af 1 ug totalt RNA i en 20-pi revers transkription reaktionsblandingen.

kvantitativ real-time PCR

Kvantitativ realtids-PCR blev anvendt til at bestemme ekspressionsniveauerne af generne af interesse. Den Primer Express®-softwaren blev anvendt til at udforme passende primere med en T

m på ca. 60 ° C (tabel 1).

De primere blev syntetiseret af TIB Molbiol (Berlin, Tyskland). Alle analyser blev kørt på en StepOnePlus Real-Time PCR System ved hjælp af Power SYBR®Green PCR Master Mix (både Applied Biosystems, Darmstadt, Tyskland). Reaktionsvolumenet var 25 pi, herunder 1 pi template cDNA og en afsluttende primer koncentration på 500 nM. PCR-betingelser var som følger: 10 minutter ved 95 ° C, 40 cykler af 30 sekunder ved 95 ° C og 1 min ved 60 ° C, efterfulgt af en smeltekurveanalyse trin (temperaturgradient fra 60 ° C til 95 ° C med + 0,3 ° C per cyklus). Hvis alle ampliconer viste én enkelt T

m svarende til den, forudsagt af Primer Express software blev PCR reaktionerne betragtes som specifik. Hver prøve blev målt i tre eksemplarer, og vi anvendte sammenlignende C

T (ΔΔC

T) metode til den relative kvantificering af transskription niveauer. 18S rRNA blev anvendt som en husholdning gen at normalisere vores udtryk data.

Western blot-analyse

Efter behandlingen blev prøver til Western blot-analyse fastsættes ved tilsætning af ethanol op til en slutkoncentration på 70 %. Til analyse blev SDS-PAGE, immunblotting og densitometri udført på seks replikater ifølge rutinemæssige protokoller [17] – [19]. Antistoffer mod de følgende antigener blev anvendt: α-tubulin, pan-actin, β-actin, moesin og ezrin (fortyndingerne var 1:1000, bortset pan-actin, 1:4000). Alle antistoffer blev indkøbt fra Cell Signaling Technology Inc. (MA, USA). For densitometrisk kvantificering af de bands, blev de farvede membraner scannet og analyseret ved hjælp af billede J (https://rsb.info.nih.gov/ij/) software [20]. Da ingen egnet protein blev konstateret, at kunne tjene som et loading kontrol under de undersøgte eksperimentelle betingelser, vi omhyggeligt lastet lige mængder af protein (40 ug i 10 uL) på hver gel vognbane og normaliseret de densitometriske data til denne værdi.

STRING 9.0 Network Analysis

De undersøgte proteiner blev tabuleret. For hvert protein, blev posten nummer og gen navn UniProtKB erhvervet i UniProtKB og disse navne blev brugt for netværket generation med STRING 9.0 (www.string-db.org) [21]. De UniProtKB postnumre blev indsat i input form, som “flere proteiner” og “Homo sapiens” blev udvalgt som organismen. Den resulterende netværk synspunkt blev hentet som a.jpg billede.

Statistisk analyse

Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS 16.0 software (SPSSS, Inc, Chicago, IL, USA). Vi anvendes enten envejs ANOVA eller Mann-Whitney-U test givet fald. Forskelle blev betragtet som signifikante på niveauet for

s

0,05. Alle data er repræsenteret som middelværdi ± standardafvigelse.

Resultater

Valgte gener og proteiner

For at teste indflydelsen af ​​vibrationer og hypergravity på celle adfærd, vi undersøgte to kræft i skjoldbruskkirtlen cellelinier. Vi vurderede cytoskeletale proteiner, fordi vi tidligere havde observeret, at cytoskelettet blev påvirket under parabolflyvninger [14]. Således har vi fokuseret på gener og proteiner involveret i at danne (actin, myosin, tubulin, vimentin, Tallinn, og integrin) og modulerende (ezrin, radixin, og moesin) cytoskelettet. Desuden har vi undersøgt de kodende for vækstfaktorer (IL-6, IL-8, EGF, og CTGF) og proteinkinaser (PRKCA og PRKAA1). Trods den funktionelle mangfoldighed af proteinerne, de danner et netværk af interaktioner (fig. 1), med undtagelse af PRKAA1, den katalytiske subunit af AMP-aktiveret protein kinase (AMPK), som spiller en central rolle i regulering cellulær energimetabolisme.

variation i mRNA ekspression induceret af vibration

Begge cellelinjer fortsatte med at vokse i løbet af vibrationer behandling varede to timer. Bagefter mikroskopisk observation afslørede, at cellebinding stadig varede. bestemmelse af mRNA koncentrationer af proteinerne demonstrerede dog, at ML-1 og CGTH-W1-celler blev påvirket forskelligt af vibrationer. Mens kun

IL6

mRNA koncentrationerne faldt i ML-1-celler, koncentrationerne af de andre undersøgte transkripter forblev uændret (fig. 2). I CGTH W-1 celler, mRNA’erne af

CTGF

,

IL6

,

ACTB

,

MSN, ITGB1

og

PRKAA1

blev opreguleret, mens

Tubb

mRNA blev nedreguleret. Alle de andre mRNA-niveauer blev ikke påvirket af vibrationer (fig. 3). Derfor ML-1 celler viste sig at være mere modstandsdygtig over for vibrationer end CGTH-W1 celler.

Differential genekspression induceret af Kortsigtet Hypergravity

Under en parabolflyvning , celler udsættes for vibrationer samt til hypergravity. I tidligere flyvning eksperimenter [14], [15], bemærkede vi, at store cellulære ændringer skete der i første parabel. Derfor her, vi udsat cellerne til en acceleration profil, der opstår under den første parabel. Selv under disse korte perioder (2 x 20 sekunder) af centrifugering, betydelige ændringer i transkription af generne af interesse forekom. I ML-1-celler, vi har registreret betydelig nedregulering af mRNA koncentrationer af

IL6

og

IL8

, hvorimod ikke blev observeret nogen signifikant ændring for

Tubb, MYO9, VIM, EZR; RDX; MSN, EGF, CTGF, PRKCA

og

PRKAA1

(fig. 4).

I CGTH W-1 celler, mRNA’erne af

CTGF, IL6 , IL8, ITGB1, VIM, TLN1, MYO9B

og

RDX

blev nedreguleret, mens koncentrationerne af de andre testede mRNA forblev un-påvirket (fig. 5). Igen, ML-1 celler forekom mere modstandsdygtige end CGTH W-1 celler, især med hensyn til cytoskeletale proteiner.

Differential mRNA ekspression som følge af gentagen udsættelse for Hypergravity

Selvom de store virkning af en parabolflyvning ses efter første parabel, vi udsat cellerne for hypergravity der opstår under i alt 31 parabler og undersøgte mRNA-niveauerne bagefter. Gentagen eksponering for hypergravity vendt virkningerne af den første parabel om

IL6

IL8

mRNA-niveauer i ML-1 celler. Nu,

IL6

IL8

udskrifter blev opreguleret sammen med

CTGF, EZR

RDX

mRNA (fig. 4).

i CGTH W-1 cellelinje, udtryk for

ITGB1, VIM, MYO9, RDX, IL6,

IL8

faldt efter P31, mens koncentrationerne af den andre syv typer af mRNA forblev upåvirket (fig. 5). Disse resultater viste, at hypergravity som optræder under 31 parabler hovedsagelig opregulerer transkription af vores target-gener i ML-1-celler, men nedregulerer dem i CGTH W-1-celler.

Ændringer i intracellulært protein koncentrationer induceret af Vibration eller Hypergravity, der opstår under 31 parabler

Offentliggjorte data om sammenhænge mellem intracellulære mRNA-niveauer og proteinkoncentrationer er uforenelige [22] – [24]. Derfor undersøgte vi proteinkoncentrationer på actin, tubulin, moesin og ezrin, foruden de mRNA koncentrationer. Anvendelse af et antistof, som binder til alle varianter af actin kæder (pan-actin), vi observeret, at pan-actin Proteinkoncentrationer blev reduceret i hver cellelinje efter hver type behandling sammenlignet med 1

g

kontrolceller ( fig. 6A, 7A). Proteinniveauer af alfa-tubulin kæder var forskellige i ML-1 og CTGH W-1-celler. I ML-1-celler, Proteinkoncentrationerne faldt efter vibration behandling og hypergravity eksponering, mens det modsatte blev observeret i CGTH W-1-celler (fig. 6c og 7c). I disse tilfælde en direkte sammenligning mellem protein og mRNA-koncentrationer ikke var mulig, fordi forskellige gener koder proteinerne tagget af antistofferne. Når vi anvendte et antistof rettet mod kun beta-actin kæder, der kodes af

ACTB

gen, vi registreret nogen ændring i ML-1-celler efter vibration behandling og øgede koncentrationer efter udsættelse for hypergravity. I CTGH W-1-celler, opregulering af dette protein blev bemærket efter vibration og en nedregulering efter hypergravity eksponering (fig. 6B og 7B). Således protein og mRNA ændringer stemte godt i CGTH W-1-celler efter udsættelse for vibrationer (fig. 3, 7B), men ikke efter gentagen hypergravity (fig. 5, 7B). Der var også en korrelation i ML-1-celler mellem protein og mRNA ændringer som reaktion på vibration (fig. 2), men ikke til hypergravity eksponering (fig. 4) [14]. Desuden blev Western blot-analyser udført for moesin og ezrin. I ML-1 celler, blev kun ezrin påvirket af vibrationer, mens moesin og ezrin blev ramt af hypergravity (fig. 6D og 6E). I CGTH W-1-celler, blev begge typer proteiner nedreguleret af vibrationer, men kun moesin proteinekspression faldt under hypergravity (fig. 7D og 7E). I disse tilfælde, protein og mRNA-koncentrationer svarede kun i tre af de otte analyser (fig. 3-7).

Diskussion

For at undersøge mulige indflydelse vibrationer eller hypergravity på skjoldbruskkirtlen kræftceller, valgte vi proteiner, der er involveret i at opretholde eller modulerende cellestrukturer. Grunden til at vælge dem skyldtes de tidligere iagttagelser, at disse proteiner reagerer mest følsomt, når cellerne udsættes for vægtløshed [8], [10], [12]. Derudover har vi til formål at finde en direkte protein /gen målet for mekaniske kræfter, som igen udløste ændringer i andre proteiner [25].

De proteiner, hvis gener undersøgte vi har forskellige cellulære funktioner. Actin, myosin, tubulin, og vimentin er de vigtigste komponenter i cytoskelettet, der støtter og styrker cellens struktur [26]. Ezrin og moesin tilhører ERM familien, som også omfatter radixin. Disse proteiner kan interagere med både plasma membranproteiner og filamentøse actin [27], og regulere organisering og dynamik actincytoskelettet generelt [28]. Knyttet til actinfilamenter via talin, integrin penetrerer cellemembranen og interagerer med den ekstracellulære matrix omkring cellerne. Dette link er påkrævet for at transmittere signaler fra cellen miljø til det indre [29]. Epitelvækstfaktor (EGF), bindevæv vækstfaktor (CTGF) og interleukinerne 6 og 8 produceres af skjoldbruskkirtlen celler og handle på deres cytoskeleton på en autokrin måde [30].

I den foreliggende undersøgelse, sammenligning af protein og relaterede mRNA koncentrationer afslørede dårlig korrelation med hensyn til beta-actin, ezrin og moesin. Dette kan forklares ved den nylige opdagelse, at cellulær overflod af proteiner overvejende styres på niveauet for translation [31]. Alligevel kan genekspression data giver vigtige oplysninger om celle struktur variationer induceret af forskellige stimuli.

Protein kinase C alpha tilhører protein kinase C familie og er en regulator af cytoskelettet [32], [33]. På proteinniveauet, aktiveres af kinasen mTORC2 [34]. PKC-alpha-genekspression kan ændres ved kemikalier, vækstfaktorer og hormoner [35]. I vores system, de fysiske kræfter, der påføres cellerne påvirkede ikke dette enzym. I mange systemer, PKC-alpha aktiverer genekspression af IL-6 [36], [37], som er en multifunktionel cytokin udtrykt af humane thyrocytter [38], [39]. Vi observerede,

IL6

ekspression blev modificeret, medens PKC-alpha-genekspression forblev upåvirket. Konkluderede vi derfor, at de observerede ændringer i

IL6

mRNA-niveauer opstod uafhængigt af PKC alpha. Det er kendt fra litteraturen, at forskellige reguleringsmekanismer er ansvarlige for

IL6

genekspression [40]. I FRTL-5 skjoldbruskkirtlen celler,

IL6

mRNA-ekspression forstærkes af mekanismer, der involverer cAMP /PKA-vejen [41]. Endvidere mekanisk belastning eller strækning forøger IL-6-produktion i humane lunge epitelceller og glatte muskelceller via NFKB [42], [43]. Så vidt vi ved, det var ukendt indtil nu, hvorvidt biomekanisk stress induceret IL-6-produktion i skjoldbruskkirtlen celler. Vi tidligere konstatere, at

IL6

genekspression blev forbedret i FTC-133 skjoldbruskkirtlen cancerceller, som forblev tilhænger i 24 timer på RPM [12]. I endotelceller, blev observeret IL-6 følsomhed over for simuleret vægtløshed.

IL6

genaktivering var højere i vedhængende og rør-dannende celler efter 5 dage på RPM end i 1

g

kontrol celler. I løbet af de følgende to dage,

IL6

mRNA koncentrationen faldt i adhærente celler, men steg i rør-dannende celler [44]. Disse ændringer korrelerede godt med de i IL-6 protein niveauer, som større mængder af IL-6-proteiner blev udskilt i kultursupernatanten, når endotelcellerne blev inkuberet på RPM i 24 timer sammenlignet med kontrolceller. Denne effekt blev afskaffet i tilstedeværelse af bFGF [45].

Fra et videnskabeligt synspunkt, men det er endnu mere interessant, at mRNA koncentrationer af vækstfaktorer varierede mere følsomt under indflydelse af de mekaniske kræfter genereres ved hypergravity og vibrationer end mRNA-niveauerne af proteiner, der bygger eller modulerer cytoskelettet direkte.

IL6

niveauer ændres under hver behandling. Udover

EZR

i ML-1-celler og

Tubb

i CGTH-W1 celler, forekom alle de transkriptionelle ændringer i samme retning som ændring af

IL6

gen. Desuden blev ændringer i IL-6-protein beløb i kultursupernatanter observeret tidligere, da endotelceller blev dyrket under ændrede gravity betingelser på en RPM [45]. Konkluderer vi derfor, at IL-6 spiller en vigtig rolle, når mekaniske kræfter virke på humane skjoldbruskkirtel celler

in vitro

. Hvis denne konklusion er korrekt, ville den forklare, hvorfor så mange genændringer observeres efter cellerne er blevet udsat for vægtløshed [46], mens hele organismer påvirkes moderat i sammenlignelige perioder af eksponering. Hos mennesker

IL6

genekspression nedreguleres af hormoner såsom østrogen og testosteron [40]. Hormoner styrer

IL6

udtryk er fraværende, når isolerede celler dyrkes

in vitro

.

I fremtiden vil det være vigtigt at tage disse effekter i betragtning, når der udføres forsøg i virkelige vægtløshed. Især disse opsætninger med længere eller flere faser af hypergravity og vibrationer, såsom parabolflyvninger, vil blive mere påvirket af dem. For længere missioner i rummet om bord på ISS hypergravity bør ikke være en faktor, men en vis grad af vibrationer stammer fra de forskellige maskiner samt fra astronauterne selv (for eksempel under træning) vil også altid være til stede, og skal overvejes . Ved hjælp af forskellige celler, har vores gruppe for nylig forsøgt at analysere virkningen af ​​hypergravity og vibrationer på den samlede effekt af ændret genekspression under parabolflyvninger [47], og de første resultater synes at antyde, at mens hypergravity og vibrationer fremkalde modsatte effekter fra dem af vægtløshed i cellerne, vægtløshed er den overordnede stærkere stimulus. Men flere eksperimenter har skal gennemføres for at forfine disse resultater og de har også suppleres med langtidsstudier. Disse data vil være af stor betydning for vores fremtidige rumflyvning eksperiment (skjoldbruskkirtel kræftceller i Space) på ISS i november i år.

Tilsammen observerede vi en påvirkning af vibrationer og hypergravity på genekspression af skjoldbruskkirtlen cancerceller. Bemærkelsesværdigt, de to typer celler reagerede forskelligt. ML-1-celler forekom mere modstandsdygtig mod vibrationer end CGTH-W1-celler. Derfor kontrol eksperimenter på passende centrifuger og vibrationer enheder er nødvendigt at fortolke data fra vægtløshed eksperimenter.

Tak

Vi vil gerne takke fru Heidi Schou Knudsen for hendes fremragende teknisk bistand.