PLoS ONE: Beviser for to former for Synergistisk induktion af apoptose ved Mapatumumab og Oxaliplatin i kombination med Hypertermi i human tyktarmskræft Cells

Abstrakt

Tyktarmskræft er den tredje hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i verden – den vigtigste dødsårsag fra kolorektal cancer er levermetastaser, som kan behandles med isolerede hepatisk perfusion (IHP). Søge efter de mest klinisk relevante metoder til behandling af kolorektal metastatisk sygdom ved isolerede hepatisk perfusion (IHP), vi udviklet anvendelsen af ​​oxaliplatin samtidig med hypertermi og humaniseret dødsreceptor 4 (DR4) antistof mapatumumab (Kort), og undersøgte de molekylære mekanismer af denne multimodalitet behandling i humane coloncancer-cellelinjer CX-1 og HCT116 samt menneskelige tyktarmskræft stamceller Tu-12, Tu-21 og Tu-22. Vi viste her, i denne undersøgelse, at den synergistiske virkning af multimodale behandling apoptose var caspase afhængig og aktiveres død signalering via både den ydre apoptotiske vej og indre vej. Dødssignalering blev aktiveret ved c-Jun N-terminal kinase (JNK) signalering, der førte til Bd-XL phosphorylering i serin 62, begrænse den anti-apoptotiske aktivitet af Bd-XL, som bidrog til indre vej. Nedreguleringen af ​​cellulær FLICE inhiberende protein lang isoform (c-FLIP

L) i ydre vej blev opnået gennem ubiquitinering på lysinrest (K) 195 og inhibering af proteinsyntesen. Overekspression af c-flip

L mutant (K195R) og Bcl-xL mutant (S62A) fuldstændigt ophævede den synergistiske virkning. Det vellykkede resultat af denne undersøgelse understøtter anvendelsen af ​​multimodalitet strategi til patienter med kolorektale levermetastaser, som ikke responderer på standard kemostråleterapi der overvejende er rettet mod mitokondrie apoptosecyklus

Henvisning:. Song X, Kim SY, Lee YJ ( 2013) Bevis for to former for Synergistisk induktion af apoptose ved Mapatumumab og Oxaliplatin i kombination med Hypertermi i Human Colon Cancer Cells. PLoS ONE 8 (8): e73654. doi: 10,1371 /journal.pone.0073654

Redaktør: Raffaele A Calogero, University of Torino, Italien

Modtaget: 31. maj 2013; Accepteret: 30 juli 2013; Udgivet: 27 august, 2013 |

Copyright: © 2013 Song et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af følgende tilskud: NIC tilskud fond (CA140554). Dette projekt brugte UPCI Core Facility og blev delvist understøttet af award P30CA047904. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

colorektal cancer, som forårsager ca. 10% af kræftdødsfald i USA, er den tredje hyppigste årsag til kræft-relateret dødelighed i verden; død skyldes sædvanligvis ukontrolleret metastatisk sygdom. Desværre er det kun 10-15% af de oprindelige kolorektale levermetastaser betragtes resektabel [1,2]. De inoperable tilfælde af lever metastatisk sygdom kan behandles med isolerede hepatisk perfusion (IHP), der involverer en fremgangsmåde til fuldstændig vaskulær isolation af leveren for at tillade multimodalitet behandling af levertumorer [3-6].

Mapatumumab (Kort) er et fuldt humant IgG1 agonistisk monoklonalt antistof, som udelukkende retter sig mod og aktiverer død receptor 4 (DR4) med høj specificitet og affinitet [7-9]. Kort fortalt Mapa binder til celleoverfladen af ​​DR4 og udløser ydre apoptotiske vej, fortrinsvis gennem aktivering af pro-apoptotiske initiator caspase-8. Men viste fase II forsøg lille eller ingen klinisk aktivitet af single-agent Kort hos patienter med fremskreden refraktær kolorektal cancer eller ikke-småcellet lungecancer [10,11]. Flere mulige molekylære mekanismer er blevet foreslået, herunder mutation /defekter i dødsreceptorer, død-inducerende signalering kompleks, capsases, proapoptotiske proteiner eller overekspression af anti-apoptotiske molekyler [12-14]. Således er der et fortsat og stort behov for at udvikle relevante strategier for at øge Mapa s effektivitet.

Hypertermi, en behandling ofte med isolerede nedsat perfusion (IHP), maksimerer tumor skader samtidig med at den omgivende normale væv [5, 6,15]. Oxaliplatin, en almindeligt anvendt kemoterapeutisk middel til coloncancer, menes at udløse celledød primært ved at inducere platin-DNA-adduktet [3,16-18]. Vi har tidligere udviklet en multimodale behandling med oxaliplatin forbehandling i kombination med Kort og hypertermi at behandle human coloncancer [19]. Imidlertid IHP levere høje doser af kemoterapi eller biologisk behandling kræver regionalt et standard operativ teknik, kontinuerlig intraoperativ lækage overvågning, og en ekstern veno-veno bypass kredsløb [20]. Således oxaliplatin forbehandling er ikke opnåelig i proceduren for IHP i klinikker, og alle komponenter i multimodale procedure skal udføres samtidigt.

I denne undersøgelse undersøgte vi det terapeutiske potentiale af det klinisk relevante multimodalitet behandlingsskema oxaliplatin og hypertermi i kombination med Mapa på human tyktarmskræft cellelinjer og tyktarmskræft stamceller. Vi rapporterer her, at multimodale behandling kan bevidstgøre menneskelige kolon kræftceller til Mapa-induceret apoptose ved flere molekylære virkningsmekanismer via både iboende apoptosecyklus og ydre vej.

Materialer og metoder

cellekulturer Salg

Menneskelig colorectal carcinom CX-1-celler, som blev indhentet fra Dr. JM Jessup (National Institutes of Health) [21], blev dyrket i RPMI-1640-medium (Gibco BRL) indeholdende 10% føtalt bovint serum (HyClone). De humane kolorektal carcinom HCT116 cellelinier venligst leveret af Dr. B. Vogelstein (Johns Hopkins University) blev dyrket i McCoys 5A-medium (Gibco-BRL) indeholdende 10% føtalt bovint serum [22]. Menneskelige tyktarmskræft stamceller, Tu-22, TU-12 og Tu-21 [23], blev oprettet ved Dr. E. Lagasse (University of Pittsburgh) og dyrket i DMEM /F12 medium (Gibco BRL) indeholdende 0,5% føtalt bovint serum (HyClone) og 1% insulin, transferrin og selen (ITS, Fisher Scientific). Alle cellerne blev holdt i en 37 ° C befugtet inkubator med 5% CO

2.

Reagenser og antistoffer

Oxaliplatin, MG132, cycloheximid (CHX) og protease-inhibitor cocktail blev opnået fra Sigma Chemical Co. Mapatumumab (Kort) var fra Human Genome Sciences (Rockville, MD, USA). JNK-inhibitor (SP6001125) og G418 var fra Calbiochem. Anti-Flag, anti-caspase 8, anti-caspase 9, anti-caspase 3, anti-ubiquitin, anti-PARP, anti-phosphoryleret JNK /JNK og anti-Bd-XL-antistof var fra Cell Signaling. Anti-p-Bd-XL (S62) antistof var fra Chemicon /Millipore. Anti-FLIP-antistof (NF6) var fra Enzo Life Sciences. Anti-actin antistof var fra Santa Cruz.

Behandling

Celler blev udsat for hypertermi (42

° C) i tilstedeværelse /fravær af Mapa og oxaliplatin i 1 time, og derefter inkuberet ved 37

° C i 3 timer eller 23 timer. For hypertermi, blev celler forseglet med parafilm og anbringes i et cirkulerende vandbad (Thomas Scientific), som blev opretholdt inden for 0,02

° C fra den ønskede temperatur.

Transient transfektion og stabil transfektion

i transient transfektion blev celler transficeret med Lipofectamine 2000 (Invitrogen), og blev behandlet 48 timer efter transfektion. For stabil transfektion blev celler, der stabilt overudtrykker HA-Bd-XL vildtype (WT) eller mutanttyper fremstillet ved transfektion CX-1-celler med HA-Bd-XL-WT, HA-Bd-XL-S62A (Ser62Ala), og HA-Bd-xL-S62D (Ser62Asp) og holdt i 500 ug /ml G418. CX-1-Bd-XL S62A-celler blev transficeret med pLenti-Flag-FLIP

L og stabile kloner blev selekteret med blasticidin (10 ug /ml). Pools af 3 kloner blev anvendt i eksperimentet.

MTS [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H- tetrazolium, MTS] assays Salg

MTS undersøgelser blev udført under anvendelse af Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution celleproliferationsassay (Promega). CX-1-celler blev dyrket i vævs- kultur- overtrukket 96-brønds plader og behandles som beskrevet i resultaterne. Celler blev derefter behandlet med MTS /phenazinmethosulfat opløsningen i 1 time ved 37 ° C. Absorbans ved 490 nm blev bestemt under anvendelse af et enzymbundet immunosorbentassay pladelæser.

Annexin V binding

Celler blev opvarmet i fravær eller nærvær af Mapa og høstet ved trypsinisering, vasket med serum- frit medium og suspenderet i bindingspuffer (Annexin V-FITC Staining Kit, PharMingen). Denne cellesuspension blev farvet med muse-anti-humant Annexin V antistof og PI og straks analyseret ved flowcytometri.

Kvantitativ revers transkription-polymerasekædereaktion (RT-PCR) analyse

Totalt RNA blev ekstraheret og oprenset fra dyrkede celler under anvendelse af RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) ifølge producentens instruktioner. RNA blev kvantificeret ved at bestemme absorbans ved 260 nm. To ug totalt RNA fra hver prøve blev revers transkriberet til cDNA under anvendelse af High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies, Inc.) i et volumen på 20 pi. Kvantitativ PCR (qPCR) blev udført under anvendelse Applied Biosystems fortegnelserne TaqMan assays (20X Primer probemixen) svarende til CASP8 og FADD-lignende apoptose regulator (CFLAR; assay ID Hs00153439_m1), og glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH; assay ID Hs02758991_g1 ). Alle reaktioner blev udført med 2 x TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) på et Applied Biosystems StepOne Plus Real-Time PCR System ifølge standardprotokoller.

Immunopræcipitation

Kort fortalt blev celler lyseret i CHAPS lysepuffer med proteasehæmmer cocktail (Calbiochem). 0,5-1 mg lysat blev inkuberet med 1,5 ug anti-Flag /ubiquitin antistof eller kanin IgG (Santa Cruz) ved 4

° C natten over, efterfulgt af tilsætning af protein A-agarose-perler (Santa Cruz) og rotation ved stuetemperatur i 2 timer efterfulgt af immunoblotanalyse.

immunblotanalyse

Celler blev lyseret med Laemmli lysepuffer og kogt i 10 min. Proteinindhold blev målt med BCA Protein Assay Reagent (Pierce, Rockford, IL, USA), adskilt ved SDS-PAGE og overført elektroforetisk til nitrocellulose membran. Nitrocellulosemembranen blev blokeret med 5% fedtfri tørmælk i PBS-Tween-20 (0,1% v /v) i 1 time og inkuberet med primært antistof ved stuetemperatur i 2 timer. Peberrodsperoxidasekonjugeret anti-kanin eller anti-mus IgG blev anvendt som det sekundære antistof. Immunoreaktivt protein blev visualiseret ved kemiluminescens-protokollen (ECL, Amersham, Arlington Heights, IL, USA). De tætheder af båndene blev analyseret ved hjælp af Gel-pro ansøgning fra Media Cybernetics. Nogle af de Western blots i de samme paneler ikke er fremstillet af de samme blots og blev strippet og testet igen med anti-actin antistof at normalisere for forskelle i protein belastning for at sikre lige protein belastning.

[

35S ] methionin inkorporering analyse

Celler blev behandlet med medium indeholdende 4 uCi af [

35S] -L-methionin og udsat for hypertermi (42

° C) i nærvær /fravær af oxaliplatin (10 ug /ml) i 1 time og derefter inkuberet ved 37

° C i 3 timer. Celler blev solubiliseret med 1 ml 0,25 N NaOH og fuldstændigt lyseret ved pipettering forsigtigt. [

35S] methionin inkorporering blev analyseret ved Wallac 1409 væskescintillationstæller (PerkinElmer, MA, USA). [

35S] -L-methionin inkorporeringsniveauer blev beregnet ved at normalisere [

35S] -L-methionin tællinger per minut, korrigeret for ikke-specifik baggrund, at det totale protein niveauer.

sted- mutagenese

Lys 106 til Arg (K106R) og K195R mutationer af plasmidet pCR3.V64-Met-Flag-flip

L, som var en gave fra Dr. Jurg Tschopp (University of Lausanne), blev indført i c-flip

L-genet under anvendelse af fuldstændigt komplementære mutagene primere (QuickChange site-directed mutagenese kit fra Agilent Technologies). De følgende mutageniserende oligonukleotider blev anvendt: sense 5′-GAGATTGGTGAGGATTTGGATAGATCTG-ATGTGTCCTCATTAAT-3 ‘og antisense 5′-ATTAATGAGGACACATCAGATCTAT-CCAAATCCTCACCAATCTC-3′ for K106R mutant, fornemmer 5’-CAAGCAGCAATCCA-AAAGAGTCTCAGGGATCCTTCAAAT-3 ‘og antisense 5’-ATTTGAAGGATCCCTGAG-ACTCTTTTGGATTGCTGCTTG -3 ‘for K195R mutant. Mutanter blev bekræftet ved sekvensanalyse.

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført ved anvendelse af Graphpad InStat 3 software (GraphPad Software). Data, der viser sammenligninger mellem to grupper blev vurderet ved anvendelse af Students t-test. Sammenligninger mellem mere end to grupper blev udført ved anvendelse af ANOVA med den passende post hoc test. Statistisk signifikans er markeret med stjerner (*, p 0,05 og **, p 0,01).

Resultater

multimodalitet behandling af oxaliplatin /Mapa /hypertermi aktiverer både indre og ydre veje i human colon cancerceller

I denne undersøgelse har vi forsøgt at udvikle klinisk relevant multimodale behandling for tyktarms- metastatisk sygdom, som kan behandles med IHP. De anvendte cellelinier omfatter: menneskelig kolorektal metastatisk carcinom HCT116 og CX-1-celler, og menneskelige tyktarmskræft stamceller, Tu-12, Tu-21 og Tu-22, som blev oprettet ved Dr. E. Lagasse (University of Pittsburgh) fra leveren af ​​patienter med metastaserende tyktarmskræft og dyrket inden passagerne 10-30 [23]. Cancer stamceller (CSC) er i stand til at forny sig selv, er tumorigene, og er i stand til at producere de heterogene afstamninger af cancerceller, der omfatter tumoren. CSC skal ikke kun være tilknyttet tumor initiering og vækst, men sandsynligvis vil være ansvarlig for metastaser samt [24,25]. For at undersøge effekten af ​​multimodale behandling af oxaliplatin /Mapa /hypertermi-induceret cytotoksicitet blev cellelevedygtigheden bestemt ved MTS assay. Som vist i figur 1A og 1B, blev synergistisk effekt observeret i oxaliplatin /Mapa /hypertermi sammenlignet med nogen anden enkelt behandling eller bi-behandling i begge cellelinier (P 0,01). Figur 1C viser klart, at synergistisk induktion af apoptotisk død forekommet under behandling med oxaliplatin /Mapa /hypertermi. Lignende resultater blev opnået i humane coloncancer stamceller Tu-12, Tu-21 og Tu-22 (figur 1F). Disse synergistiske virkninger skyldtes en stigning i aktiveringen af ​​caspaser (Figur 1D). Figur 1D viser, at 100 ng /ml Kort resulterede i en lille mængde af caspase 8 og 3-aktivering, og således PARP-spaltning (kendetegnende træk ved apoptose). Interessant, hypertermi fremmet aktiveringen af ​​caspase 8, mens oxaliplatin fremmes caspase 9-aktivering. Desuden blev den synergistiske virkning af multimodale behandling blokeret af Z-IETD-FMK (caspase 8 inhibitor), Z-LEHD-FMK (caspase 9-inhibitor), og Z-DEVD-FMK (caspase 3 inhibitor) i begge cellelinier ( Figur 1E), hvilket indikerer, at begge veje spillede en vigtig rolle i den synergistiske virkning af den multimodale behandling.

(A, B) CX-1 og HCT116 celler blev udsat for normotermiske eller hypertermiske (42 ° C) betingelser i 1 time i nærvær /fravær af Mapa og oxaliplatin og derefter inkuberet i 23 timer ved 37 ° C i nærvær /fravær af Mapa og oxaliplatin. Cellelevedygtighed blev analyseret ved MTS-assay. Fejlbjælkerne viser SD fra tredobbelte eksperimenter. Asterisk ** betegner en statistisk signifikant forskel (P 0,01). (C) CX-1-celler blev udsat for hypertermi (42 ° C) i 1 time i nærvær /fravær af Mapa og oxaliplatin og derefter inkuberet i 3 timer ved 37 ° C i nærvær /fravær af Mapa og oxaliplatin. Efter behandling blev cellerne farvet med fluoresceinisothiocyanat (FITC) -Annexin V og propidiumiodid (PI). Apoptose blev detekteret ved flowcytometrisk assay. (D) efter behandling, spaltning af caspase 8, caspase 9, caspase 3 eller PARP blev påvist ved immunoblotting. Actin blev brugt til at bekræfte lige mængde af proteiner er lagt i hver bane. (E) CX-1 og HCT116-celler blev behandlet med eller uden 20 pM Z-IETD-FMK (caspase 8 inhibitor), Z-LEHD-FMK (caspase 9-inhibitor), og Z-DEVD-FMK (caspase 3 inhibitor) til μmin efterfulgt af oxaliplatin /Mapa /hypertermi og spaltningen af ​​PARP blev påvist ved immunoblotting. (F) Menneskelig Tyktarmskræft stamceller, Tu-12, Tu-21 og Tu-22, blev udsat for normotermisk eller hypertermisk (42 ° C) betingelser i 1 time ved tilstedeværelse /fravær af Mapa og oxaliplatin ved den angivne koncentration og derefter inkuberet i 23 timer ved 37 ° C i nærvær /fravær af Mapa og oxaliplatin. PARP blev påvist ved immunoblotting. Actin blev anvendt som lastning kontrol.

Dosis reaktioner af oxaliplatin og hypertermi på Mapa-induceret apoptose

Vi observerede, at de doser af Mapa og oxaliplatin forøget, caspase 8/9 /3-aktivering og PARP-spaltning blev forbedret, hvilket indikerer, at den synergistiske virkning af multimodale behandling apoptose var dosisafhængig (figur 2A). Desuden er vores resultater antyder, at både de interne og eksterne apoptotiske veje var involveret i den synergistiske virkning af den multimodale behandling. Lignende data blev opnået i HCT116-celler (figur 2B).

(A) CX-1 og (B) HCT116 celler blev udsat for hypertermi (42 ° C) i 1 time i nærvær /fravær af Mapa og oxaliplatin og inkuberet i 3 timer ved 37 ° C i nærvær /fravær af Mapa og oxaliplatin. Efter behandling blev spaltningen af ​​caspase 8, caspase 9, caspase 3 eller PARP detekteres ved immunblotting. Actin blev brugt til at bekræfte lige mængde af proteiner er lagt i hver bane. (C) CX-1-celler blev udsat for hypertermi (42 ° C) i 1 time i nærvær /fravær af 100 ng /ml Kort og 10 ug /ml oxaliplatin og derefter inkuberet i 3 timer ved 37 ° C i nærvær /fravær af Mapa og oxaliplatin. Efter behandling blev cellerne immunoblottet med anti-phospho-JNK /JNK, anti-phospho-Bd-XL /Bcl-xL og anti-FLIP-antistoffer. (D) CX-1-celler blev udsat for hypertermi (42 ° C) i 1 time i nærvær /fravær af Mapa (100 ng /ml-1000 ng /ml) og oxaliplatin (10 ug /ml-100 ug /ml) og inkuberet i 3 timer ved 37 ° C i nærvær /fravær af Mapa og oxaliplatin. Efter behandling blev phospho-JNK /JNK, phospho-Bd-XL /Bcl-XL og flip

L detekteres ved immunblotting. Actin blev brugt til at bekræfte lige mængde af proteiner er lagt i hver bane. (E) HCT116 celler blev udsat for hypertermi (42 ° C) i 1 time i nærvær /fravær af Mapa (10 ng /ml-100 ng /ml) og oxaliplatin (10 ug /ml-100 ug /ml) og derefter inkuberet i 3 timer ved 37 ° C i nærvær /fravær af Mapa og oxaliplatin. Efter behandling blev phospho-JNK /JNK, phospho-Bd-XL /Bcl-XL og flip

L detekteres ved immunblotting. Actin blev brugt til at bekræfte lige mængde af proteiner er lagt i hver bane.

Multimodalitet behandling-induceret JNK-aktivering, Bd-XL phosphorylering og reduktion i c-flip

L-niveau

for yderligere at forstå de mekanismer, hvordan de indre og eksterne forløb var involveret i multimodale behandlings-induceret apoptose, undersøgte vi Bd-xL og c-flip. Figur 2C viser, at der ikke var nogen ændring i mængden af ​​Bd-XL-protein, men phosphorylering af Bd-XL steget dramatisk, ledsaget af JNK-phosphorylering. Desuden er niveauet af c-flip

L faldet betydeligt i løbet af multimodale behandling i CX-1-celler. Figur 2D viser, at JNK blev aktiveret og Bd-XL blev phosphoryleret i serin 62 på en dosis-afhængig måde i CX-1-celler. Interessant niveauet af c-flip

L faldt dramatisk da oxaliplatin blev kombineret med hypertermi. Lignende data blev opnået i HCT116 celler (Figur 2E).

kinetik multimodalitet behandling i CX-1 og HCT116 celler

Vi observerede, at effekten af ​​den multimodale behandling steg som tiden skred frem i CX-1 (figur 3A) og HCT116-celler (figur 3B). JNK-aktivering nåede maksimum på 4 timer efter den indledende behandling og efterhånden faldt i multimodalitet behandling. Data fra immunoblot og billeddannelse gel analyser viser, at Bcl-xL phosphorylering nået toppen omkring 12 timer efter behandlingen indikerer, at JNK-aktivering var en tidlig begivenhed og kan regulere Bcl-XL phosphorylering. I CX-1 celler niveauet af c-flip

L faldt dramatisk på 4 timer efter behandlingen af ​​oxaliplatin kombineret med hypertermi, mens der i HT116 celler, det nåede minimum 24 timer efter behandlingen.

CX -1 (A) og HCT116 (B) celler blev udsat for hypertermisk (42 ° C) betingelser i 1 time i nærvær /fravær af Mapa og oxaliplatin og inkuberet ved 37 ° C i nærvær /fravær af Mapa og oxaliplatin til 3 h, 7 h, 11 h og 23 h. Efter behandling spaltningen af ​​caspase 8/9/3 og PARP, phospho-JNK /JNK, phospho-Bd-XL /Bcl-XL og flip

L blev påvist ved immunblotting. Actin blev brugt til at bekræfte lige mængde af proteiner.

Kravet om JNK aktivering og Bd-XL fosforylering i multimodale behandling-induceret apoptose

JNK inhibitor SP6001125 delvist reduceret oxaliplatin /kort /hypertermi-induceret PARP-spaltning i CX-1-celler, hvilket indikerer, at JNK-vejen var afgørende for multimodalitet behandlings-induceret apoptose (figur 4A). Mærkbart, SP6001125 stærkt reducerede niveauet af Bd-XL fosforylering i CX-1 celler, som giver stærke beviser for, at multimodalitet behandling-induceret Bd-XL fosforylering kræver JNK aktivering. Zhao et al. rapporterede, at JNK-aktivering medierer c-FLIP nedregulering [26]. Denne mulighed blev undersøgt i figur 4A. Vi observerede, at ingen genoprettelse af c-FLIPL forekommet under behandling med SP6001125. Denne observation var i overensstemmelse med andre forskeres rapporter [27,28].

(A) Celler blev forbehandlet med JNK inhibitor 25 uM SP6001125 efterfulgt af oxaliplatin /Mapa /hypertermi og immunoblottedes med anti-PARP, anti-phospho -Bcl-xL og anti-Bcl-xL-antistof. (B) transfektanter med kontrol plasmid (pcDNA), vildtype Bcl-xL (Bd-XL-WT), Ser62 /Ala phospho-defekt Bd-XL mutant (Bd-XL-S62A) eller Ser62 /Asp phospho-mimic Bd-xL mutant (Bd-xL-S62D) blev behandlet med oxaliplatin /Mapa /hypertermi og immunblottet med anti-PARP eller anti-Bd-xL-antistof. Actin blev brugt til at bekræfte lige mængde af proteiner er lagt i hver bane.

For at vurdere effekten af ​​Bd-XL fosforylering på Ser62 på sin anti-apoptotisk aktivitet, vi etableret CX-1-afledt celle linjer stabilt overudtrykker vildtype Bcl-xL (Bd-xL-WT), Ser62Ala phospho-defekt Bd-xL mutant (Bd-xL-S62A), Ser62Asp phospho-mimic Bd-xL mutant (Bd-xL-S62D), eller den tilsvarende tom vektor (pcDNA). Som forventet overekspression af Bcl-XL-WT forhindrede oxaliplatin /Mapa /hypertermi-induceret PARP-spaltning. Interessant overekspression af Bcl-XL-S62D forbedret PARP-spaltning, mens den for Bd-XL-S62A inhiberede PARP-spaltning (figur 4B). Disse data tyder på, at niveauet af Bd-XL og dets phosphorylering på S62 spiller en vigtig rolle i multimodale apoptose.

Reduktion i c-FLIP

L plan efter hypertermi og oxaliplatin i CX-1 celler Salg

c-FLIP er den største inhibitor af ydre apoptotiske vej gennem hæmning af caspase-8-aktivering, og vi observeret, at niveauet af c-flip

L blev reduceret efter hypertermi ved 42 ° C i 1 time i CX-1-celler som vist i figur 5A. Men c-FLIP

L blev restaureret til det normale niveau efter 3 timers inkubation ved 37 ° C, hvilket var i overensstemmelse med vores tidligere papir [24]. Oxaliplatin (10 pg /ml, 4H) alene ikke reducere niveauet af c-flip

L. Interessant niveauet af c-flip

L blev holdt på et reduceret niveau, når hypertermi kombineret med oxaliplatin.

(A) Celler blev eksponeret for 37 ° C eller 42 ° C i 1 time i nærvær /fravær af 10 pg /ml oxaliplatin og derefter høstet straks eller 3 timer efter inkubation ved 37 ° C. c-FLIP

L blev undersøgt ved Western blot analyse. (B) Celler blev eksponeret for 37 ° C eller 42 ° C i 1 time i nærvær /fravær af 10 pg /ml oxaliplatin og derefter inkuberet i 3 timer ved 37 ° C. Kvantitativ revers transkription-polymerasekædereaktion (QRT-PCR) blev udført for at måle relativ c-FLIP mRNA-niveau. Søjlediagrammet repræsenterer middelværdier (+ SD) fra tredobbelte eksperimenter. (C) Celler blev eksponeret for 37 ° C eller 42 ° C i 1 time i nærvær /fravær af 10 pg /ml oxaliplatin og derefter inkuberet i 3 timer ved 37 ° C. Proteinsyntese blev målt ved [

35S] Methionin inkorporering. (D) Celler blev behandlet med 30 ug /ml CHX, eller udsættes for hypertermi i nærvær eller fravær af CHX. Niveauerne af c-FLIP

L og ladningskontrol actin blev målt ved Western blot-analyse. (E) Celler blev eksponeret for hypertermi i 30 eller 60 minutter i nærvær /fravær af MG132. Lysatprøver blev immunfældet med anti-ubiquitin antistof og protein G-Sepharose. Den ubiquitineret FLIP blev påvist ved Western blot med anti-FLIP antistof. (F) Celler blev transficeret transient med 4 ug plasmid indeholdende mock, K106R (106 lysinrest blev erstattet med arginin), K195R, eller vildtype (WT) c-FLIP

L. Efter 48 timers inkubation blev celler eksponeret for hypertermi ved 42 ° C i 1 time. Niveauet af c-flip

L blev påvist ved anti-FLIP antistof. Actin blev anvendt som en intern kontrol. (G) Cellerne blev kortvarigt transficeret med Flag-mærkede c-flip

L WT eller K195R plasmid; 48 timer senere blev celler udsat for hypertermi ved 42 ° C i 1 time. Niveauerne af ubiquitineret c-FLIP

L blev detekteret ved IP med anti-Flag-antistof efterfulgt af Western blot under anvendelse af anti-ubiquitin antistof. Tilstedeværelsen af ​​transficerede c-FLIP

L i lysaterne blev verificeret ved Western blot. Actin blev vist som en intern standard. (H) Celler blev transficeret transient med c-FLIP

L WT, K106R, eller K195R plasmid; 48 timer senere blev celler opvarmedes ved 42 ° C i 1 time i nærvær /fravær af Mapa (100 ng /ml) og oxaliplatin (10 ug /ml) og derefter inkuberet ved 37

° C i 3 timer. Lysater indeholdende lige store mængder af protein blev immunoblottet med anti-PARP og anti-FLIP antistof. Actin blev vist som en intern standard. (I) Celler blev transficeret transient med c-FLIP

L WT, K106R, eller K195R plasmid; 48 timer senere blev celler opvarmedes ved 42 ° C i 1 time i fravær eller nærvær af Mapa (100 ng /ml) og oxaliplatin (10 ug /ml), og derefter inkuberet i 24 timer ved 37 ° C. Cellelevedygtighed blev analyseret ved MTS-assay. Fejlbjælkerne viser SD fra tredobbelte eksperimenter. Asterisk * betegner en statistisk signifikant forskel (P 0,05).

Kvantitativ RT-PCR viste, at ingen signifikant inhibering af c-FLIP-ekspression på mRNA-niveauet var tydelig efter hypertermi, oxaliplatin, eller kombination (figur 5B). Vi observerede i figur 5C, at 25% af proteinsyntese blev inhiberet i hypertermi, hvorimod der var 46% proteinsynteseinhibering i oxaliplatin kombineret med hypertermi. Figur 5D viser at reduktion af c-flip

L niveau ved 42 ° C i 1 time opvarmning alene var mere end det med 30 ug cyclohexmide som inhiberer proteinsyntesen med 99% [28]. Disse resultater antyder, at inhibering af proteinsyntesen alene er ikke en væsentlig faktor for nedregulering af FLIP

L af hypertermi. Bemærkelsesværdigt, c-FLIP

L blev genfundet i løbet af 3 timer af normotermisk tilstand, hvilket indikerer, at c-flip

L blev gensyntetiseres. Imidlertid blev opsvinget forsinket ved behandling med hypertermi og oxaliplatin, som proteinsyntese var signifikant inhiberet.

Figur 5E viser, at ubiquitinering af endogent c-FLIP

L forøget ved hypertermiske behandlinger. Desuden proteasominhibitor MG132 blokeret nedbrydningen af ​​c-flip

L, der bekræfter eksistensen af ​​proteasomalaktivitet-medieret nedbrydning af proteinet efter hypertermi.

Den online software UbPred, der forudsiger protein ubiquitinering sites, viste, at lysin 106 og 195 havde den højeste score. Vi erstattet 106 og 195 lysin med arginin og testet stabiliteten af ​​fuld-længde c-FLIP

L bærer resulterende punktmutation. Som vist i figur 5F, i transfektion gruppe, c-FLIP

L K106R var let nedbrudt når den udsættes for hypertermi mens K195R var refraktære over for nedbrydning af hypertermi. Figur 5G bekræfter, at c-FLIP

L vildtype (WT) blev effektivt ubiquitinerede men ikke K195R mutant, som blev fundet næsten uden ubiquitinering. Vi observerede, at c-FLIP

L K195R udtrykkende celler var de mest resistente over for multimodale behandlings-induceret apoptotisk celledød (figur 5H og 5I). Disse resultater antyder, at forbigående hypertermi-medieret nedbrydning af c-flip

L involveret ubiquitinering af K195, og K195R mutant tildelt modstand mod multimodale behandlings-induceret apoptotisk død.

Ophævelsen af ​​den synergistiske virkning ved overekspression af c-flip

L K195R og Bd-xL-S62A i CX-1 og HCT116 celler

Endelig sammenlignede vi effekten af ​​multimodale behandling i CX-1 og HCT116 celler overudtrykt med c-FLIP

L WT, Bd-xL-S62A, Bd-xL-S62A + c-flip

L WT (figur 6A og 6B) og c-flip

L K195R, Bd-xL-S62A, Bcl- xL-S62A + c-FLIP

L K195R (figur 6C og 6D). Vi observerede, c-FLIP

L WT /K195R eller Bcl-XL-S62A delvist blokeret effekten af ​​multimodale behandling. Notatet blev multimodalitet behandling-induceret apoptose næsten helt blokeret af overekspression af både c-flip

LWT /K195R og Bd-XL-S62A (figur 6A og 6C), hvilket indikerer c-flip

L og Bcl- xL var uafhængige faktorer, der bidrager til den synergistiske effekt af multimodalitet behandling. Lignende resultater blev opnået i celleviabilitetstest (figur 6B og 6D). Vores resultater antyder, at (a) reduktion af c-FLIP

L niveau, og (b) Bd-XL phosphorylering på Ser62 begge er ansvarlige for den synergistiske induktion af apoptose af det klinisk relevante multimodalitet behandling.

( A) CX-1-celler stabilt overudtrykt med pcDNA, c-FLIP

L WT, Bd-xL-S62A og c-FLIP

L WT + Bd-xL-S62A, og tre stabile kloner blev samlet, og cellerne blev opvarmet ved 42 ° C i 1 time i nærvær /fravær af Mapa (10 ng /ml) og oxaliplatin (10 ug /ml) og derefter inkuberet ved 37

° C i 3 timer. Spaltningen af ​​PARP, og niveauet af c-flip

L og Bcl-xL blev påvist ved Western blot analyse. (B) Cellelevedygtighed blev analyseret ved MTS-assay 24 timer efter behandling. Fejlbjælkerne viser SD fra tredobbelte eksperimenter. Asterisk ** betegner en statistisk signifikant forskel (P 0,01). (C) HCT116 celler blev forbigående transficeret med samme mængde plasmid indeholdende mock, c-FLIP

L K195R, Bd-XL-S62A og c-flip

L K195R + Bd-XL-S62A. Efter 48 timers inkubation blev cellerne opvarmet ved 42 ° C i 1 time i nærvær /fravær af Mapa (10 ng /ml) og oxaliplatin (10 ug /ml) og derefter inkuberet ved 37

° C i 3 timer.