PLoS ONE: Udvikling af en nuklear morfometrisk Signatur for prostatakræft Risiko i Negative Biopsies

Abstrakt

Baggrund

Vores mål var at udvikle og validere en multi-funktion nukleare score baseret på billedanalyse af direkte DNA farvning, og for at teste sin forbindelse med felt effekter og efterfølgende påvisning af prostatakræft (PCA) i benigne biopsier.

Metoder

Vævssnit fra 39 prostatektomi blev Feulgen-farvede og digitalt scannet (400 ×), giver kort DNA-indhold per pixel. PCa og godartede epitel kerner blev udvalgt tilfældigt til måling af 52 grundlæggende morfometriske funktioner. Logistik regressionsmodeller diskriminerer godartet fra PCA kerner, og godartet fra maligne nukleare populationer, blev bygget og cross-valideret af AUC analyse. Nukleare populationer blev tilfældigt indsamlet 1 mm eller 5 mm af kræft brændpunkter, og fra kræft-fri prostata, HGPIN og PCa Gleason klasse 3-5. Kerner blev også indsamlet fra negative biopsi patienter, som havde en efterfølgende diagnose af PCa og aldersmatchede kræft-fri kontrol (20 par).

Resultater

En multi-funktion nukleare score diskrimineret kræft fra godartede cellepopulationer med AUC af 0,91 og 0,79, henholdsvis i uddannelse og validering sæt patienter. I prostatektomi prøver begge nuklearrelaterede og befolkning-level modeller afslørede cancer-lignende funktioner i godartede kerner støder op til PCa, sammenlignet med kerner, der var mere fjern eller fra PCa-frie kirtler. I negative biopsier, funktioner en valideret model med 5 varians gav betydeligt højere score i sager, end kontroller (

P

= 0,026).

Konklusioner

En multifeature nukleare morfometrisk score, opnås ved automatiseret digital analyse blev valideret for diskrimination af godartet fra kræft kerner. Denne score viste felt effekter i godartede epitel kerner ved varierende afstand fra PCA læsioner, og var forbundet med efterfølgende PCa detektion i negative biopsier.

Impact

Denne nukleare score viser lovende som en risiko prædiktor blandt mænd med negative biopsier og som en mellemliggende biomarkør i fase II kemoforebyggelse forsøg. Resultaterne tyder også på, at subvisual forstyrrelser i nuklear struktur forud for udvikling af præ-neoplastiske læsioner

Henvisning:. Gann PH, Deaton R, Amatya A, Mohnani M, Rueter EE, Yang Y, et al. (2013) Udvikling af en nuklear morfometrisk Signatur for prostatakræft Risiko i Negative Biopsier. PLoS ONE 8 (7): e69457. doi: 10,1371 /journal.pone.0069457

Redaktør: Konradin Metze, University of Camp’nas, Brasilien

Modtaget: 12. december, 2012; Accepteret: 9. juni 2013; Udgivet: 26 Jul 2013

Copyright: © 2013 Gann et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Støttet af tilskud fra National Institutes of Health /National Cancer Institute RO1 CA155301 og RO1 CA90759. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

subtile ændringer i nukleare form, størrelse og konsistens forud for histologiske anerkendelse af prostatakræft (PCA) og dermed kan give en nyttig biomarkør indikerer et felt med høj risiko godartet væv. Faktisk nuklear udvidelsen, uregelmæssighed, hyperchromasia og fremtrædende nucleoli er blandt de kendetegnende anvendes af patologer at skelne høj kvalitet prostata intraepitelialneoplasi (HGPIN), den mest anerkendte præmaligne læsion til PCA. Mere end 25 år siden, efterforskere med baggrund i optisk videnskab og computing begyndte at bruge digital billedbehandling teknikker i et forsøg på at overskride de begrænsninger af det menneskelige øje og hjerne for anerkendelse og kvantificere visuelle mønstre i kerner under mikroskop [1]. Disse bestræbelser nået en milepæl, når digital billedbehandling blev indarbejdet i standarden for pleje til cytologisk vurdering i screening for livmoderhalskræft. Men på trods af talrige rapporter om succes ved hjælp af en række forskellige tilgange og slående forbedringer i både hardware og software, computer-assisteret nukleare morfometri stadig har rigeligt uudviklet potentiale for opdagelsen af ​​nyttige biomarkører i PCa forskning [2], [3]. Veltri et al. for nylig offentliggjort en glimrende gennemgang omfatter historie og udviklingen af ​​dette område [4].

I det foreliggende arbejde har vi fokus på kvantificering af nukleare DNA mønstre som biomarkør for den tidlige fase af præ-neoplastisk ændring i godartet prostatahyperplasi epitel, en scene er forbundet med felt effekter eller felt cancerization [5], [6]. Validering af en sådan biomarkør kan føre til både kliniske og forskningsmæssige anvendelser. Klinisk kan en morfometrisk profil anvendes til at forudsige tilstedeværelsen af ​​cancer andre steder i kirtel i negative biopsier, og således at informere beslutninger om overvågning og behovet for gentagne biopsi. PCa er den eneste fælles kræft, som typisk diagnosticeres ved tilfældig nålebiopsi, på grund af anvendelsen af ​​et serum test (PSA) som den ledende indikator for biopsi og fraværet af enhver billeddannende metode til at visualisere læsioner. Som et resultat, 70-75% af de oprindelige biopsier er negative og klinikere har nogen etableret grundlag for at skræddersy opfølgende behandling, som kunne omfatte overvågning af PSA og gentag biopsi. Forskningsmæssigt ansøgning, kunne en valideret nukleart morfometrisk profil tjene som et mellemliggende slutpunkt biomarkør for fase II-undersøgelser forebyggelse, hjælpe med at identificere de bedste potentielle metoder til test i langvarige og dyre fase III studier.

Vi samlet en tværfaglig gruppe, der omfattede patologer, epidemiologer, bioengineers, edb-specialister og statistikere til at udvikle en tilgang, som ville opfylde to grundlæggende krav: 1) brug af almindeligt tilgængelige platforme for erhvervelse image og algoritme udvikling, og 2) systematisk validering. I denne rapport beskriver vi udviklingen af ​​en kontinuerlig, multi-funktion nukleare score baseret på pixel-for-pixel mapping af Feulgen DNA farvning, der præcist diskriminerer kræft og normale cellepopulationer i prostata væv og definerer et felt effekt i højrisiko-godartede områder.

Metoder

Etik erklæring

projektet blev gennemgået og godkendt af Institutional Review Board ved University of Illinois i Chicago. Vævsprøver blev opnået under IRB-godkendt afkald på samtykke gælder for de-identificerede prøver af resterende væv ikke nødvendig til kliniske formål. Disse procedurer var i overensstemmelse med bestemmelserne om privatlivets fred i Health Insurance Mobilitet og Accountability Act (HIPAA) af 1996. Forfatterne er åbne for samarbejde, der involverer deling af de identificerede data, forudsat at alle de lokale IRB krav er opfyldt.

Vævsprøve udvælgelse til modelbygning og validering

Vi samles to kollektioner, fra separate hospitaler, af væv blokke fra radikal prostatektomi patienter med PSA. Det første sæt, som var læring sat for at udvikle modeller til at skelne kræft fra godartede kerner, omfattede 20 patienter, og det andet sæt, der anvendes til ekstern validering, omfattede 11 patienter. Blandt de 31 prostatektomi patienter, 11 havde kræft med Gleason sum klasse 6, 10 med Gleason 7 og 10 med Gleason kvaliteter 8-9. Alle væv blokke fra 8 patienter, som gennemgik cystoprostatectomy for blærekræft blev også adgang. Disse helt indlejrede prostata var blottet for PCa på seriel sektionering på 3 mm mellemrum og blev brugt til at give “overnaturlige” godartet prostata.

Feulgen farvning

Vævssnit af 4μ tykkelse blev placeret på silaniseret glas slides og blev farvet ved hjælp af blå Feulgen Farvning Kit (ScyTek Laboratories, Logan, UT). Denne plet bruger Feulgen reaktion direkte binde farvestoffet til aldehydgrupper i DNA, der er udsat ved behandling med saltsyre. Mængden af ​​farve udviklet, er direkte proportional med mængden af ​​DNA i det farvede kerne; pletten er blevet valideret for ploidi analyse. Serielle sektioner blev farvet med hematoxylin og eosin så vigtige histologiske rum let kunne identificeres på ensfarvede Feulgen dias. Tilstødende sektioner fra en enkelt prostatektomi prøve blev inkluderet i hver batch, og den gennemsnitlige nukleare farvningsintensitet blev overvåget at identificere for høj variation mellem batch. Nogle undersøgelser nukleare morfometri har brugt mere rutine hematoxylin og eosin (H 5 mm fra en cancer fokus. Store scannede områder blev opdelt i mindre underbillede filer (JPEG-komprimering, kvalitet faktor 80) ved hjælp af SnapShot Generator funktionen i Aperio Spectrum® image management software; disse underbillede filer blev eksporteret til Matlab® (MathWorks, Inc., Natick, MA) for batch behandling. De batch forarbejdet underbillede filer var 752 × 752 pixels i størrelse (pixel size = 0.25μ

2, cirka 400-600 pixels pr kerne), som var en håndterbar størrelse til forarbejdning. Ikke-komprimerede TIFF-billedfiler produceret ca. 900-1000 pixels per kerne; blev dog hukommelse pladskrav og gennemløb væsentligt forøget.

Tilpassede rutiner i Matlab blev anvendt til at identificere pixel indeholder DNA og at segmentere individuelle kerner bruger farve-baserede K-betyder klyngedannelse og vandskel algoritmer. For undersøgelserne rapporteres her, blev segmenterede kerner manuelt udvalgt til morfometrisk objektsamling ved hjælp af en grafisk brugerflade. Segmentering og nuklear selektion blev udført i flere trin. Først blev hver 752 × 752 pixel underbillede indlæst i Matlab. Dernæst blev hvert billede konverteret fra RGB til CIELAB (L * a * b *) farverum (International Commission on Illumination, https://cie.co.at), hvis tre akser repræsenterer lethed værdi (L *), position på rød-grøn spektrum (a *), og position på gul-blå spektrum (b *). Dette reducerer antallet af farver dimensioner fra tre i RGB til to, det nødvendige minimum for de to-farve hvid og blå Feulgen billeder. Dernæst blev en K-midler clustering algoritme baseret på euklidisk afstand anvendes til at klassificere hver pixel som blå (DNA) positiv eller hvid. De første indgange for K-betyder klyngedannelse kan påvirke output; således blev indledende L * a * b koordinater fastsættes ud fra kerner af god billedkvalitet som er udvalgt af en patolog. Marker-kontrollerede vandskel segmentering baseret på grå skala billeder blev implementeret i Matlab at definere individuelle nukleare grænser (https://www.mathworks.com/products/demos/image/watershed/ipexwatershed.html). Denne fremgangsmåde undgår over-segmentering ved at markere aggregater af intense pixels inden for kerner og baggrund pixel uden for kerner.

En uddannet tekniker blev præsenteret med en række underbilleder med segmenterede kerner på en PC-skærm og mus-klikket på hver brønd-segmenteret kerne efter at have kontrolleret sin epitelial placering, og dermed sende sine morfometriske data til et Excel-regneark. De fleste segmentering fejl skyldtes høj eller for lav segmentering af rørende eller overlappende kerner; blandt de udvalgte kerner fandt vi ingen sammenhæng mellem nukleare funktioner og nærhed til andre kerner, og dermed mener vi denne procedure var forholdsvis saglig. En digital tæller informeret teknikeren når alt 200 epiteliale kerner, fra en bred vifte af underbilleder, var blevet udvalgt fra hver hel sektion område af interesse eller biopsi. I alt 52 grundlæggende variable (se tabel S1) blev opsamlet for hver kerne reflekterende størrelse, form og DNA tekstur egenskaber; mere detaljerede beskrivelser af mange af disse funktioner er tilgængelige i litteraturen [7]. Særlige funktioner, der erobrede nukleare områder med enten kondenseret eller sparsom DNA ( “klatter” og “huller” i Feulgen billedet) blev udviklet på baggrund af at identificere sammenhængende pixels med betydelige afvigelser fra den gennemsnitlige optiske densitet (se tabel S2). Andre typer af funktioner, herunder fraktale funktioner, er let beregnes, men vi brugte ikke dem i denne analyse. Mange funktioner er stærkt korreleret med hinanden, og vi fandt, at i almindelighed udvide bibliotek af funktioner øget behandlingstid mens ikke væsentligt forbedre vores resultater. For at justere for eventuelle forskelle i farvning tværs partier og for at opnå fælles måleenheder tværs funktioner, vi z-transformerede enkelte funktioner værdi ved at fratrække middelværdien og dividere med standardafvigelsen for denne funktion blandt alle kerner i partiet.

Statistisk analyse

analysen er centreret om at udvikle to typer af modeller: en til at diskriminere individuelle kræft kerner fra godartede kerner, og den anden for at diskriminere populationer af kræft kerner fra godartede befolkninger. Disse modeller gav multivariable scores vi mærket som MFS

n (multifeature score, nuklear) og MFS

s (multifeature score, befolkning) – svarende til NUCLEAR og befolkning niveau scoringer hhv. Ved hjælp af data på cirka 8.000 kerner opnået fra kommenteret PCa og godartede områder i indlæring sæt af 20 RP prøver, vi konstrueret logistiske regressionsmodeller til at skelne kræft kerner (alle Gleason kvaliteter) fra godartede kerner på mindst 5 mm fra en cancer fokus. Vi sammenlignede flere tilgange for at skabe diskriminerende multivariable modeller, herunder lineær diskriminant analyse, logistisk regression, Support Vector Machines og neurale netværk og fundet, efter aftale med tidligere offentliggjorte arbejde, at logistisk regression var så god eller bedre end andre tilgange [8]. Variabler blev udvalgt til at indgå i de logistiske modeller baseret på baglæns elimination med en optagelse kriterium

P

0,05. Som forventet blev nogle variabler højt korreleret, men ingen modeller undladt at konvergere på grund af multikollinearitet. C statistik blev beregnet som arealet under kurven (AUC) for at diskriminere kræft fra godartede kerner. En logistisk model med 27 tilbageholdte funktioner forudsat en høj AUC (0,93) i en uafhængig test prøve af benigne og kræft kerner opnået fra de 11 sager i den eksterne RP validering sæt. Vi brugte to stikprøver Kolmogorov-Smirnov statistik at sammenligne fordelingen for MFS

n scores mellem nukleare befolkninger stikprøven fra forskellige histologiske rum i 20 RP sæt, plus godartede områder fra de 8 prostatektomi sager med nogen signifikant PCa (dvs., “overnaturlige” kerner).

Vi brugte to tilgange til at konstruere modeller for MFS

s. I den første tilgang, som vi kaldte en to-trins MFS

s, vi beregnet den MFS

n for hver kerne og derefter beregnes op til den fjerde orden øjeblik (middelværdi, standardafvigelse, skævhed og kurtosis) i MFS

n fordeling for populationen af ​​kerner fra hver vævsprøve (godartet eller ondartet). Disse fire sammenfattende variabler blev derefter brugt som prædiktorer i logistiske regressionsmodeller til at diskriminere den godartede vs. maligne befolkninger og monteret sandsynlighed fra den logistiske model med et givet sæt af kovariater blev udpeget som MFS

s. Vi udledt en et-trins MFS

s ved at beregne gennemsnit, spredning, skævhed og kurtosis for hver nukleare træk fra hver vævsprøve, hvilket giver i alt 208 mulige prædiktorer (fire gange 52 grundlæggende funktioner). Vi brugte derefter enten baglæns eliminering eller bedste-delmængde logistisk regression i uddannelsen befolkning på 28 patienter til at vælge et reduceret sæt af prædiktorer for kræsne kræft fra godartede nukleare befolkninger. I bedste delmængde tilgang blev de 50 bedste kombinationer af prædiktor sæt med op til fem variabler rangeret baseret på chi square kriteriet sandsynligheden ratio. For hver af disse kombinationer vi beregnet leave-one-out krydsvalidering AUC i uddannelsen sæt prøver, og modellen med den højeste AUC blev valgt som den endelige model. De endelige regression vægte for hver indikator blev beregnet som den gennemsnitlige koefficient fra alle 28 forsøg i træningssættet. De endelige modeller er valgt i udviklingsprocessen blev derefter testet i den uafhængige validering sæt, der omfattede 11 radikal prostatektomi prøver. Konfidensgrænser for AUC (95% niveau) blev beregnet ved anvendelse af en ikke-parametrisk metode, der udnytter egenskaberne af Mann-Whitney statistik [9]. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af SAS-PC, Version 9.1 (SAS, Inc., Cary, NC)

Ekstern undersøgelse validering pilot:. Case-control sammenligning af godartede biopsier

Som en ekstern validering test sammenlignede vi populationer af godartede kerner taget fra negative prostata biopsier, hvor patienten viste sig at have PCa mindst to år senere (cases, n = 20) og benigne kerner fra negative biopsier af patienter, som forblev kræft-fri (kontroller , n = 20). Cases og kontroller blev matchet på alder og dato for indeks biopsi; alle fag var patienter på Jesse Brown Veterans Administration Medical Center i Chicago. Kvalificerede kontroller havde mindst to negative biopsier efter indekset biopsi, ingen PSA 10 ng /ml, og ingen historie af anti-hormonterapi, herunder 5α-reduktase-inhibitorer. Vi Feulgen-farves negative indeks biopsi væv og opnåede nukleare morfometriske funktioner som beskrevet ovenfor. Vi beregnes derefter monteret MFS

p scores for hvert fag ved hjælp af både den baglæns eliminering og bedst subset modeller tidligere stammer fra diskrimination af godartede og kræft celle populationer i prostatektomi prøver. For begge modeller, vi beregnet AUC og 95% konfidensgrænser for at diskriminere sager fra kontroller, og udførte en parret t-test for matchede data.

Resultater

Figur 1 illustrerer processen for at opnå pixel-for-pixel kort for hver kerne baseret på den optiske densitet afledt af DNA-indhold. Hele slide scannede billeder af Feulgen-farvede kerner er opdelt i underbilleder (figur 1a) hver indeholdende ca. 5.6K pixels. Den tilhørende binære billede, skabt af K-means gruppering, er vist i figur 1b. Figur 1c viser den samme underbillede efter vandskel segmentering og angiver, hvor godt segmenterede epiteliale kerner kan vælges til måling enten manuelt eller automatisk. Figur 1d viser 3-dimensionelle afbildninger af pixel kort til kerner fra benigne og kræft områder, henholdsvis.

Figur 2 viser de relative frekvens histogrammer for en nuklear-niveau multifeature score (MFS

n) opnået fra kerner i forskellige histologiske rum fra 20 RP og 8 cystoprostatectomy prøver; hvert rum er repræsenteret af mindst flere hundrede kerner. Den logistiske model, der anvendes til at generere MFS

n scoringer omfattede 27 nukleare funktioner og var baseret på forskelsbehandling af tilfældige PCA kerner og godartede kerner fjernt fra kræft (Normal Langt) i de 20 RP sager. MFS

n, som er anti-logget logit fra den logistiske model, svarer til sandsynligheden for, at en kerne med et givet sæt af karakteristika værdier er en cancer kerne, og således går fra 0 til 1.0. Frekvensfordelingen af ​​MFS

n skift til venstre som en forløber fra Gleason 5 til Gleason 3 til HGPIN og fortsætter med at flytte mod venstre for kerner, der er placeret tæt på eller langt fra en cancer fokus, eller er fremstillet af kræft-fri prostata (overnaturlige). De frekvensfordelinger for Normal Far kerner ( 5 mm fra en PCa fokus) er signifikant forskellige fra både de andre godartede typer kerner (Kolmogorov-Smirnov D statistik

P

0,0001)

.

Monteret multifeature scoringer blev genereret for hver kerne fra en logistisk regressionsmodel sammenligne alle kræft kerner til normale-langt kerner ( 5 mm fra en cancer fokus) fra 20 prostatektomi prøver, med 27 kovarianteffekter funktioner udvalgt af baglæns elimination. Scores blev beregnet for populationer af kerner opnået fra specifikke histologiske rum i 20 RP og 8 cystoprostatectomy prøver. De frekvensfordelinger for normal-langt kerner er væsentligt forskellige fra hinanden godartet type (Kolmogorov-Smirnov D statistik 0,0001).

Typiske frekvens distributioner af MFS

n for populationer af benigne og PCA kerner fra den samme patient er vist i sidestilling i figur 3. værdierne for kræft kerner er generelt forskudt mod højre, men det er også klart, at variansen i score er større for kræft sammenlignet med benigne kerner. Befolkning niveau logistiske modeller giver os mulighed for at udnytte denne varians karakteristisk i at diskriminere kræft fra godartede grupper af kerner. Figur 4 viser boxplots for MFS

s fra to-trins modeller med kun to kovariater: middelværdien og standardafvigelsen af ​​MFS

n for enhver given population af kerner. Data i boxplots kommer fra de 20 RP fag plus 8 med cystoprostatectomy; de gennemsnitlige MFS

p scorer for de 11 RP emner i valideringen sættet er repræsenteret af stjerner. Resultaterne indikerer, at Normal omkring nukleare populationer er mellemliggende mellem Normal Far og kræft, at Supernormale populationer har lavere score end normale Far, og at HGPIN nukleare populationer ligner cancer populationer. De gennemsnitlige MFS

p scorer for kerner opnået fra en ekstern validering sæt prostatektomi personer med PCa bekræfte samme forskel nærheden vs. Far kerner og ligheden mellem HGPIN og PCA kerner.

MFS

n scorer forskydes opad for kræft kerner som forventet; dog varians for MFS

n er også større blandt kræft kerner, hvilket afspejler pleomorphism.

Den gennemsnitlige MFS

s scoringer for nukleare befolkninger fra de 11 validering RP’er er vist af stjerner. MFS

p scoringer blev opnået fra en logistisk regressionsmodel med kun to kovariater: betyder MFS

n og s.d. MFS

n. MFS

n scoringer blev genereret fra en 27-kovariat logistisk model med funktioner udvalgt af baglæns elimination.

Tabel 1 viser AUC for uddannelse og validering sæt diskrimination af kræft celle fra godartede cellepopulationer i prostatektomi prøver vha to forskellige modeller til beregning MFS

s. Model A, som bruges af en traditionel fremgangsmåde baglæns elimination til at vælge de fem bedste kovariater, havde en cross-validering AUC = 0,87 i træningssættet og AUC = 0,83 i den uafhængige validering sæt. Model B, afledt ved at sammenligne alle mulige delmængder med fem eller færre kovariater baseret på leave-one-out cross-validering, havde AUC = 0,91 og 0,79 i uddannelse og validering sæt hhv. De valgte funktioner og deres standardiserede koefficienter for den endelige baglæns eliminering og bedste delmængde MFS

p modeller (model A og B, henholdsvis) er vist i supplerende tabel S3.

Vi derefter sammenlignet populationer af kerner fra matchede par af negative biopsier, hvor sagen emnet efterfølgende havde en diagnose af PCa og kontrollen forblev kræft-fri. Nuclear befolkninger fra hvert emne blev tildelt monteret MFS

p scores baseret på model A og model B; således disse modeller blev udviklet ved hjælp helt uafhængige prøvesæt fra prostatektomi snarere end biopsier. AUC og parret T testresultater er vist i tabel 2. Begge modeller viste signifikante forskelle mellem cases og kontroller, med sager, der har en mere kræft-lignende nukleare morfometrisk signatur.

Diskussion

i denne undersøgelse har vi udviklet og valideret en nuklear score morfometrisk, baseret på direkte DNA-farvning, som nøjagtigt diskrimineret godartet fra kræft kerner i prostatavæv. Denne score karakteriserer en felt-effekt i histologisk benigne epitel- kerner i varierende afstande fra en cancer fokus, og er forbundet med efterfølgende detektion af PCa i et uafhængigt sæt af negative biopsier. Det er væsentligt at bemærke, at de enkelte nukleare billeder blev opnået med hele slide imaging på 400 ×. Således var vi i stand til effektivt at fange et stort antal epiteliale kerner fra hver vævsprøve ved en forstørrelse, der tillader betydelige detalje med hensyn nuklear størrelse, form og DNA tekstur. Given pixel-niveau kort, der viser den rumlige fordeling af DNA i hver kerne, er det muligt at generere en næsten ubegrænset bibliotek af morfometriske funktioner. I tilgangen præsenteres her, er denne agnostiker bibliotek minerede at bestemme reducerede sæt af funktioner for modeller, der adskiller godartede fra maligne celler. Baseret på den antagelse, at der er et kontinuum i udviklingen af ​​nuklear form og tekstur under carcinogenese, de resulterende multivariable scorer tilvejebringe en kontinuerlig indeks for “cancer-ness” af hver kerne, og dermed den kollektive “cancer-ness” for enhver population af kerner. I almindelighed er de cancer-relaterede funktioner observeret af digital analyse er simpelthen subvisual forlængelser af nukleare ændringer, er godt anerkendte for det menneskelige øje under mikroskopet: kræft kerner noget større og har en mere sammenklumpet eller uregelmæssig fordeling af kromatin. Desuden er alle de funktioner der indgår i det mest præcise model vi fandt var relateret til graden af ​​varians blandt kerner, dermed støtte længe holdt synspunkter blandt patologer om betydningen af ​​nuklear pleomorphism i kræft diagnose.

Vores undersøgelsen bygger på en lang række tidligere forsøg, der har ansøgt digitalt nukleare morfometri på spørgsmål, der involverer risici og prognose i brystkræft [10], livmoderhalsen [2], oropharynx /lunge [11], kolon [12], hud [13] og prostata . I prostata, er nuklear morfometri blevet vist at detektere abnormiteter i godartet væv støder op til cancer og HGPIN [14], [15]. Vores data viste mere tegn på en cancer fænotype i kerner inden for 1 mm fra en neoplastisk læsion, sammenlignet med dem på mindst 5 mm afstand; dog tidligere data tyder på, at disse abnormiteter kan strække sig op til 10 mm fra kanten af ​​en læsion [16]. Mairinger og medarbejdere fysisk udvundet godartede kerner fra paraffin-indstøbt væv og ved hjælp af Feulgen-farvede cytospinpræparater, rapporterede, at en kombination af tre kromatin tekstur funktioner præcist kunne skelne sager med PCa fra dem med kun BPH [15]. Især to af disse top tre diskriminerende træk afspejlede inter-kerne variation snarere end middelværdier. Bortset fra, at der findes et felt effekt i godartet væv, har flere undersøgelser brugt nukleart morfometri af tumor og tumor-tilstødende kerner til at diskriminere undergrupper af PCA patienter i henhold til sandsynligheden for progression mens aktiv overvågning, PSA recidiv, metastaser eller PCa-specifikke død [17], [18], [19], [20], [21]. Igen, varians funktioner afspejler ustabilitet spille en fremtrædende rolle i disse modeller, som de gør i vores resultater.

De biologiske mekanismer, der er ansvarlige for ændringer i nuklear struktur, der fremkommer, inden fremkomsten af ​​histologisk genkendelige neoplasi er ikke godt forstået . Imidlertid kunne flere processer være impliceret. Først overgangen fra løs euchromatin til mere kompakt heterochromatin er en vigtig mekanisme til modulering af genekspression, der er styret til en vis grad ved kovalent modifikation af histon haler. Mønstre af global histon modifikation ved acetylering eller methylering, kan identificeres i PCa og har været forbundet med tumor aggressivitet [22], [23]. Mahmoud, et al observeret nedsat global acetylering på histon 3 lysin 9 (H3K9ac) i PIN-kode og PCa forhold til BPH væv, og yderligere observerede ligheder i H3K9ac udtryk mellem PIN og normale celler placeret i nærheden af ​​en PIN-læsion [24]. Der er også påvist, at p300, en transskriptionel co-aktivator af androgen receptor, kan ændre den nukleare struktur i prostata celler gennem sin aktivitet som histonacetyltransferase eller gennem dens virkninger på ekspression af nukleare matrix proteiner såsom lamin A og C [25] . Isharwal et al. rapporterede en sammenhæng mellem specifikke nukleare morfometriske funktioner og p300 udtryk [26]. Uregelmæssigheder i den nukleare kuvert, herunder infolding og afgange fra en sfærisk form, er et længe observeret karakteristisk for PCA celler, men årsagerne til denne uregelmæssighed og dennes funktionelle betydning er stort set ukendt [27]. Nyere vidnesbyrd indikerer, at ekspression af MYC onkogen spiller en vigtig rolle i modulering nucleolar størrelse, form og antal i de tidlige faser af prostata carcinogenese [28]. Rolle tumormikromiljøet og parakrin signalering skal også overvejes, da en lokaliseret sår reaktion kan forårsage ændret genekspression i godartet stroma støder op til PCA læsioner [29]. Disse virkninger på det stromale område kunne fremkalde subtile morfologiske ændringer i godartet epiteler, herunder ændringer i forbindelse med epitelial-til-mesenchymale transformation [30].

Denne undersøgelse tilføjer til felt ved systematisk identifikation prostata cancerassocierede kerneforandringer i godartet epitel med en gængs digital mikroskopi platform. Dens styrke omfatter validering med uafhængige sæt af radikal prostatektomi og cystoprostatectomy prøver, samt en case-kontrol-analyse sammenligner negative biopsier fra patienter, der enten har eller ikke efterfølgende oplever en PCa diagnose. I betragtning af det store antal potentielle prædiktorer for et-trins MFS

s og det relativt lille antal forsøgspersoner (28) i vores træning sæt, er det fuldt ud muligt, at andre kombinationer af funktioner kunne have udført så godt eller bedre end dem i vores endelige model. Derfor er det vigtigt at bemærke, at vi anvendte en effektiv leave-one-out krydsvalidering tilgang (svarende til bootstrap gensampling) til at vælge modeller, og at vores mål ikke nødvendigvis var at finde det absolut bedste model, men at validere vores valgte modeller i uafhængige sæt af billeder. De endelige modeller, der blev afledt af prostatektomi prøver, ikke kun produceret risiko score, der var forbundet med kræft i uafhængige prostatektomi prøver, men også demonstreret en forening med kræftrisiko i biopsiprøver. Vor teknik bevidst udelukket basale epitel kerner, og fik lov til saglig udvælgelse af et stort antal luminale cellekerner fra hver prøve.