PLoS ONE: Regulatory T lymfocytter er forbundet med mindre aggressiv Histologiske funktioner i mikrosatelitter-Ustabile Colorectal Cancers

Abstrakt

Baggrund

tarmkræft (CRC’er) med mikrosatellit instabilitet (MSI) er forbundet med en god prognose og en høj tæthed af tumor-infiltrerende lymfocytter (TIL’er). Vi har forpligtet sig til at bestemme sammenhængen mellem TIL-tætheder og MSI CRC histologiske funktioner.

Patienter og metoder

Brug væv microarrays, T-celle delpopulation infiltration, herunder T-celler (CD3), cytotoksiske T-celler (CD8) og regulerende T-celler (foxp3) blev undersøgt i 86 MSI CRCs. Vi analyseret separat TIL’er af stromale og epiteliale rum i tumoren centrum, tumorale invasion margin og tilhørende normalt væv.

Resultater

For foxp3 + TIL tæthed i tumoren center stromale rum, fandt vi en stærk negativ korrelation med T4 stadie (p = 0,01), node invasion (p 0,001). og VELIPI (vaskulær emboli, lymfe invasion og perinervous invasion) kriterier (p = 0,002)

Konklusion

den stærke sammenhæng mellem regulatoriske T-celle tæthed og fraværet af VELIPI kriterier foreslår, at denne undergruppe af T-celler er fortrinsvis forbundet med mindre invasive tumorer

Henvisning:. Tougeron D, Maby P, Elie N, Fauquembergue É, Le Pessot F, Cornic M, et al. (2013) Regulatory T lymfocytter er forbundet med mindre aggressiv Histologiske funktioner i mikrosatelitter-Ustabile kolorektal kræft. PLoS ONE 8 (4): e61001. doi: 10,1371 /journal.pone.0061001

Redaktør: Hoguen Kim, Yonsei University College of Medicine, Republikken Korea

Modtaget: December 19, 2012; Accepteret: 5 mar 2013; Udgivet 15. april, 2013 |

Copyright: © 2013 Tougeron et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Økonomisk støtte blev modtaget fra Inserm – Haute-Normandie regionen (P. Maby løn), og Ligue Contre le Cancer de Seine-Maritime (reagenser). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

for nylig har immunrespons hos værten blevet vist at spille en vigtig rolle ved bestemmelse af resultatet af patienter med colorectal cancer (CRC). Sider

et al

har vist, at en høj tæthed af infiltrerende memory T-celler i tumoren er associeret med fravær af histologiske markører for igangværende invasion, også kaldet VELIPI (vaskulær emboli, lymfe invasion og perinervous invasion) kriterier og med bedre samlet overlevelse [1], [2]. Endvidere tumor-infiltrerende lymfocyt (TIL) densitet synes at have en bedre prognose værdi end TNM stadie [3], og nogle T celle subpopulationer har vist sig at være forbundet med en bedre CRC klinisk resultat, såsom cytotoksiske T-celler (CD8 +) , Th17 hjælper-T-celler og, mere kontroversielt, regulatoriske T-celler (foxp3 +) [3] -. [5]

Interessant tumorer, der udgør en mikrosatellit instabilitet (MSI) eller replikation error fænotype histopatologisk kendetegnet ved høj TIL densitet [6] – [8]. Disse tumorer har en samlet bedre prognose med mindre recidiv og bedre overlevelsesrate end den anden CRC modstykke, med mikrosatellit stabil fænotype [9], [10]. MSI fænotype, observeret hos ca. 12% af colorektale cancere, skyldes inaktivering af DNA mismatch repair (MMR) systemet

11 der enten skyldes en somatisk epigenetiske ændringer, eller fra en kimcellelinje ændring (Lynch syndrom) [11 ]. MMR inaktivering påvirker nukleotid repeat replikation og kan føre til dannelse af neo-proteiner nedbrydes i neo-peptider præsenteret på HLA-molekyler. Derfor, jo bedre prognose for mikrosatellitmarkørerne ustabile kolorektal kræft kunne i det mindste delvist forklares ved tilstedeværelsen af ​​TIL’er som kunne være specifikke for visse tumor peptider som følge af mikrosatellit ustabilitet [12], [13]. MSI tumorer har højere CD8 + og foxp3 + TIL’er end MSS tumorer, men de få offentliggjorte undersøgelser om MSI CRC’er rapporterer modstridende resultater vedrørende disse TIL-prognose værdier [4], [8], [14] – [18]. Desuden i MSI CRC’er, kun CD8 + intraepithelial lymfocyt tæthed er fuldt undersøgt, eksklusive stromale lymfocytter og andre T-celle subpopulationer [14], [19].

Immun celletæthed kan have en prognostisk værdi, og derfor være klinisk relevant, især for ordination af adjuverende kemoterapi i MSI CRCs. Men til vores viden indtil nu ingen undersøgelse har undersøgt, i en stor serie af patienter, sammenhængen mellem de forskellige TIL-subpopulationer i det stromale og epiteliale rum, og prognose eller tumor histologiske træk, i MSI CRCs. I denne undersøgelse har vi analyseret totale T-celle, cytotoksisk T-celle og regulatoriske T-celle-tumor infiltration i MSI CRCs og forsøgt at etablere dette link for disse immuncellepopulationer.

Materialer og metoder Salg

patient Valg og mikrosatelitter ustabilitet Assessment

i vores institution har mikrosatellit ustabilitet blevet analyseret i alle CRC’er siden 2003. For hver patient blev genomisk DNA ekstraheret fra parret tumor og normale kolorektale væv. Mikrosatellit ustabilitet vurdering blev udført af en sammenlignende analyse af disse DNA-prøver ved hjælp af fem konsensus mononukleotid gentagelser (

BAT25

,

BAT26

,

NR21

,

NR22

og

NR24

) [20]. Mikrosatelitter ustabilitet (MSI) blev defineret ved tilstedeværelsen af ​​ustabilitet påvirker mindst to markører (svarende faktisk til kun MSI høje tumorer). Vores institutionens etiske udvalg (Comité de beskyttelse des personnes Nord-Ouest I) godkendt undersøgelsen og frafaldes behovet for informeret samtykke på grund af den tilbagevirkende kraft af undersøgelsen. I overensstemmelse med fransk lovgivning, havde skriftligt samtykke systematisk blevet opnået for DNA basefejlparringsreparationssystemet kønscellelinie mutation analyser, som blev udført til medicinske formål.

Patient og Tumor Kendetegn, og Klinisk Outcome

Patient og tumor baseline-karakteristika blev indsamlet. Desuden for hver tumor, histologiske markører for løbende invasion svarende til kriterierne VELIPI blev bestemt ved en patolog undersøgelse [1].

Alle patienter mindre end tres år og /eller med familiær historie Lynch-syndrom tumor spektrum blev rettet til oncogenetic høring. Hos disse patienter blev tilstedeværelsen af ​​en skadelig kimlinie DNA basefejlparringsreparationssystemet genmutation opsøgt.

Sygdom tilbagefald blev evalueret hver 3. måned de første to år og hvert halve år de næste tre år. Opfølgende data blev ajourført i december 2011.

væv Microarrays og Immunhistokemi

Tissue microarrays (TMA) består af paraffinblokke hvor op til 1000 særskilte væv kerner er samlet i en række mode til muliggøre flere histologiske analyser efter immunfarvning. For hver tumor blev fire kerner med 0,6 mm diameter taget i tumoren centrum, ved invasionen margin, og fire ekstra tråde blev taget fra fjernt histologisk normale colon-mucosa (Tissue arrayer, Alphelys, Frankrig). Alle analyser blev udført på surgicaly resektion primære CRC før kemoterapibehandling. Område med Crohns lignende lymfoide svar blev udelukket fra TMA konstruktion og analyser. De otte TMA’er anvendt i denne undersøgelse indeholdt mere end 1000 kerner af mikrosatellit ustabile CRCs. Fire um tykke snit blev skåret fra TMA blokke og anvendes til immunhistokemi baseret på CD3 (T celle), CD8 (cytotoksisk T-celle) og foxp3 (regulatoriske T-celle) farvning. Formalin-fikserede væv blev afparaffiniseret og varme epitopgenfinding blev udført under anvendelse af en damper. Objektglas blev inkuberet med monoklonale muse-antistoffer, anti-CD3 (DAKO, Carpentria, CA) fortyndet 1/50 i 32 min, anti-CD8 (DAKO, Carpentria, CA) fortyndet 1/50 i 32 min, og anti-foxp3 (ABCAM , Cambridge, MA) fortyndet 1/50 i 32 min, ifølge producentens anvisninger. For hver sektion, en mus primært antistof og et sekundært anti-muse-antistof for åbenbaring blev anvendt. Det sekundære antistof var direkte koblet til HRPO enzym (peberrod-peroxidase, DAKO) og anvendes til 15 min. Farve blev afsløret ved hjælp af DAB kromogen (Diaminobenzine) og H2O2 (brintoverilte) ansøgning.

Kvantificering af lymfocytter

Hver slide blev scannet med Mirax Scan®. Den Chips’N Billige TMA Analysis program, ved hjælp Aphelion 3,2 (ADCIS, Hérouville St Clair, Frankrig), var blevet optimeret til at identificere hver chip på TMA virtuelle dias og at tillade os at afgrænse de acellulære områder, det stromale og epiteliale rum for hver kerne. Regionerne af interesse, dvs. stroma og epithel, blev manuelt afgrænset inden for de ikke-maligne (4 kerner), tumor center (4 kerner), og invasion margin (4 kerner) websteder for hver patient. Efter subtraktion af de acellulære områder blev forholdene mellem immunofarvede områder og totale vævsområde områder beregnes automatisk (figur 1).

Eksempler på tumor center chips med CD3 (A), CD8 (B) og foxp3 (C ) farvning. Venstre paneler er eksempler på høje TIL-densiteter og højre panel er eksempler på lavt TIL-densiteter. Den stroma er rød cirkel, epithelet i blå og sorte områder er udelukket. De markerede områder, der er taget hensyn til ved beregning af lymfocyt infiltrat tætheden er cirklede i gult. Alle data blev erhvervet med Chip s N Billig TMA analyseprogram.

TIL kvantificeringer blev givet med de procentsatser for de samlede overflader mærket af antistofferne. Visuel analyse af prøver fra 10 patienter fik os til at anslå, at én procent af tumor- infiltrerende lymfocyt farvning svarede til omkring 350 TIL’er /

2 mm. I tumorer med mucinous differentiering blev TIL-tætheder beregnet uden for mucinøse områder.

Statistisk analyse

T-test blev anvendt til test association mellem tumor egenskaber og TIL tæthed. Sygdomsfri overlevelse (DFS) blev estimeret startende fra operationen dato, indtil den dokumenterede tilbagefald eller sidste opfølgende date. Overlevelse kurve blev etableret under anvendelse af Kaplan-Meier-metoden. Alle statistiske analyser blev udført med en to-side signifikans på 0,05, ved hjælp af Statview software (Statview til Windows, SAS Institut Inc., version 5.0).

Resultater

Patient og Tumor Kendetegn

i alt 106 CRC’er med mikrosatellit instabilitet (to patienter udviklede 2 synkrone tumorer), der havde gennemgået kirurgi i perioden fra januar 2003 til december 2009 blev oprindeligt inkluderet. Nogle patienter blev efterfølgende udelukket fra analysen på grund af fravær af tumor prøve eller kliniske data. Firs-seks patienter var stadig medtaget i den endelige undersøgelse (tabel 1). Mean patientens alder var 68,6 ± 17,5 år. Enogtredive patienter blev testet for MMR-gen germlinie mutationer. Atten af ​​patienterne (24,4%) præsenteret en Lynch syndrom, som defineret ved tilstedeværelsen af ​​en skadelig kimcellelinje MMR mutation (16 patienter) eller en præsentation opfylder Amsterdam kriterier hos patienter uden kimcellelinje MMR mutation (2 patienter).

Et flertal af tumorerne var TNM trin II eller III (74,4%) og i højre colon (63,9%) (tabel 1). Omkring halvdelen af ​​tumorerne havde VELIPI kriterier (45,3%) og 12,7% var mucinøse tumorer, defineret som tumorer med mucinøs differentiering, der repræsenterer mindst 50% af den samlede tumor volumen; 25,3% af alle tumorerne havde nogle mucinøs differentiering udgjorde mindre end 50% af det samlede tumorvolumen (mindre end 20% for næsten halvdelen af ​​disse tumorer, og mellem 20 og 40% for de andre). Kun 16 (18,6%) patienter tilbagefald efter en median opfølgning på 25,0 ± 5,7 måneder. Derefter blev median DFS ikke nået. Tre års var DFS 78,7%. Median samlet overlevelse (OS) var 72,1 ± 11,3 måneder og tre år OS var 60,2%.

Tumor-infiltrerende lymfocytter

CD3 +, CD8 +, og foxp3 + T-celler blev overvejende lokaliseret i stromale rum (figur 2). En signifikant højere totale T-celle densitet blev observeret i tumor sammenlignet med normale colon væv (p 0,05, data ikke vist). Som allerede rapporteret

13 i tumoren og normalt væv, CD3 +, CD8 + og foxp3 + TIL-densiteter var højere i stroma end i epitel (p 0,01 for alle markører) (figur 2). Derudover var der en stærk positiv korrelation mellem CD3 +, CD8 + og foxp3 + TIL densiteter observeret i både tumor center og invasionen foran, uanset rummet (p 0,01, data ikke vist). Moroever, der var højere CD8 + TIL-densitites i den invasive foran end i tumor center (p 0,05), hvilket ikke var tilfældet for CD3 + og foxp3 + TIL-tætheder. Der var ingen forskel mellem TIL-densitites hos patienter med eller uden Lynch-syndrom.

Baren diagrammer repræsenterer de procentdele af overflader præget af CD3, CD8 og foxp3 immunfarvning i det stromale (Strø) og epitel (ep) rum, i tumoren centrum (TC) og invasionen foran (IF) væv. Standardafvigelser er oplyst af søjlerne. CD3 + TIL-tætheder var henholdsvis 2,2 ± 2,5% i tumor center epitel rum, 6,4 ± 5,1% i tumor center stromale rum, 2,3 ± 2,5% i invasion foran epitel rum, 7,2 ± 6,1% i invasion foran stromale rum. CD8 + TIL-densiteter var henholdsvis 1,52 ± 2,0% i tumor center epitel rum, 2,9 ± 2,7% i tumor center stromale rum, 1,8 ± 2,4% i invasion foran epitel rum, 3,3 ± 3,0% i invasion foran stromale rum. Foxp3 + TIL-densiteter var henholdsvis 0,13 ± 0,12% i tumor center epitel rum, 0,59 ± 0,53% i tumor center stromale rum, 0,14 ± 0,14% i invasion foran epitel rum, 0,63 ± 0,58% i invasion foran stromale rum.

associering mellem tIL tætheder og klinisk-patologisk variabler

Vi kiggede for en sammenhæng mellem tIL-tætheder i de forskellige rum og en række forskellige klinisk-patologiske variabler ( 60 år versus ≤ 60 år, dårligt versus godt /moderat differentierede tumorer, rektal /venstre colon versus højre colon tumor lokalisering, væg invasion (T4 versus T1-3), node invasion (N + versus n0), histologiske markører for igangværende invasion (VELIPI kriterier), trin i-II versus III IV). CD3 + TIL tæthed i tumoren center epitel rum var forbundet med dårlig differentiering (p = 0,01, data ikke vist). For CD3 + TIL densitet i de andre rum og CD8 + TIL tæthed i alle rum, der var ingen korrelation med kliniske data. Tværtimod blev foxp3 + TIL tæthed i tumoren center stromale rum stærkt negativt associeret med T4 fase (p = 0,01), node invasion (p 0,001), VELIPI kriterier (p = 0,002) og stadier III-IV (p 0,001 ) (tabel 2). Der var ingen sammenhæng mellem foxp3 + TIL tæthed i ethvert andet rum og kliniske data.

Diskussion

I denne undersøgelse, vi oprindeligt forpligtede sig til at evaluere de prognostiske værdier af forskellig TIL (CD3 +, CD8 + , foxp3 +) tætheder i tarmkræft med mikrosatellit ustabilitet. I univariat analyse, node invasion (p = 0,002) og VELIPI kriterier (p = 0,004) var prædiktive for DFS, men ikke CD3 +, CD8 + og foxp3 + TIL-densiteter (data ikke vist). Selvom vores store serier af patienter (n = 106) var pålidelige til at studere forskellige histologiske træk af CRC’er med mikrosatellit ustabilitet, var det ikke tilstrækkeligt at foretage en robust statistisk analyse om overlevelse. Faktisk fordi denne type kræft har en god prognose, kun nogle få patienter (n = 16) havde fået tilbagefald og ingen sammenhæng mellem nogen TIL befolkningstæthed og DFS kunne observeres. Ikke desto mindre fandt vi en stærk negativ korrelation mellem foxp3 + TIL tæthed i tumoren center stromale rum og mere aggressive tumor funktioner: væg invasion, node invasion og VELIPI kriterier, hvilket tyder på, at de regulatoriske T-celler i tumoren kan være forbundet med begrænset kræftcelle formering potentiale

Flere undersøgelser har vist, at CD8 + T-celler, som forekommer at udgøre hovedparten af ​​den intra-epithelial infiltrat, er forbundet med bedre overlevelse i CRCs [21] -. [24]. Endvidere blev den samlede CD8 + TIL infiltrat vist at være mere tæt i MSI CRCs end i MSS CRCs sandsynligvis på grund af ekspressionen af ​​MSI tumorceller af læserammeskiftemutation-afledte immunogene neoantigener [13] – [17]. Disse undersøgelser antyder, at overlevelsesfordel i MSI CRCs måtte være, i det mindste delvist, tilskrives øget CD8 + intra-tumor T-celle respons, målrettet mod disse neoantigener. Men vores undersøgelse ikke etablere sammenhæng mellem CD8 + infiltrere tæthed og bedre prognose i MSI CRCs. Det ville være interessant at vurdere funktionaliteten af ​​CD8 + TIL’er da nogle kliniske observationer tyder en forringet funktion af CD8 + TIL’er i MSI CRCs [25], [26].

Et andet vigtigt TIL subpopulation er sammensat af CD4 + T celler. Desværre, indtil nu, har vi ikke været i stand til at analysere CD4 + T-celle population, selv om effektive CD8 + cytotoksiske responser kræve hjælp af CD4 + T-celler. Faktisk blandt de forskellige anti-CD4-antistoffer vi forsøgte ud, ikke en eneste tilladt for farvning af god kvalitet, der ville kunne anvendes i forbindelse med TMA og kompatibel med vores billedanalysesoftware. CD4 + -T-celler vises forøget i tumorer i sammenligning med normale væv [27] og et lavt CD4 + infiltrat kan være forbundet med bedre overlevelse [28], [29], som fortsat kontroversiel [5]. Denne observation kan forklares med det faktum, at CD4 + T-celler udgør en heterogen population indeholdende både aktiverede hjælper-T-celler fra forskellige aktiviteter, og regulatoriske T-celler.

er for nylig blevet vist stor interesse i foxp3 + -T-celler, som har regulerende funktioner på immunresponset. Denne lymfocytpopulation er kendetegnet ved sekretion af immunosuppressive cytokiner (TGF-ß og IL-10) og ekspression af molekyler, såsom CTLA-4 (cytotoksisk T-lymfocyt antigen 4), der inhiberer aktivering og proliferation af CD4 + og CD8 + effektor T-celler [30 ]. En høj tæthed af regulatoriske T-celler har vist sig ofte i lymfeknuderne og tumorer af CRC patienter samt i deres blod, sammenlignet med raske individer [31] – [33]. I første omgang, nogle undersøgelser fundet en sammenhæng mellem høj foxp3 + TIL tæthed og dårlig prognose i CRC [4], [34]. Nylige undersøgelser har imidlertid overraskende fundet, at dette infiltrat kan være forbundet med en god prognose [33], [35] – [37]. Til dato kun Michel

et al

har grundigt vurderet tilstedeværelsen af ​​disse celler i MSI CRC’er [38]. De observerede en højere foxp3 + infiltrere i MSI CRC’er end i MSS CRCs. Imidlertid blev linket med prognosen er ikke undersøgt. I vores undersøgelse i MSI CRC’er, foxp3 + TIL tæthed var klart forbundet med mindre invasive tumor egenskaber, især med fraværet af VELIPI kriterier, og derfor kunne blive indirekte forbundet med en bedre prognose. Dette resultat var uventet og kan endog forekomme paradoksalt, eftersom regulatoriske T-celler inhiberer immunreaktion. Faktisk kunne disse regulatoriske T-celler afspejler en mekanisme udviklet af tumoren selv at begrænse anti-tumorrespons, og måske mere effektiv denne anti-tumor respons, de mere talrige disse regulatoriske T-celler er. Denne hypotese støttes stærkt af sammenhængen, vi fandt mellem CD3, CD8 og foxp3 + TIL-tætheder. En anden forklaring coul være, at regulatoriske T-celler reducere inflammation, som kan bidrage til tumorvækst og dets metastatiske potentiale, som rapporteret af Mantovani

et al

[39]. Heterogenitet i kolorektal cancer infiltrerende regulatoriske T-celler, som for nylig beskrevet af Blatner

et al

[40], kan også forklare nogle uventede kliniske resultater i patienter med tarmkræft. Dog kunne etableres ingen statistisk signifikant sammenhæng mellem foxp3 + TIL tæthed og DFS, måske igen på grund af mangel på statistisk styrke på grund af det lille antal tumor tilbagefald.

En styrke i vores undersøgelse i forhold til andre undersøgelser var at vi tog hensyn til den præcise tIL lokaliseringer. De forskellige TIL-subpopulationer syntes at være hovedsagelig co-lokaliseret i tumoren stroma. Som i MSS CRCs, dukkede CD8 + -T-celler til at udgøre hovedparten af ​​den intra-epitheliale T-lymfocyt infiltrere i MSI CRCs. Foxp3 + T-celle tæthed syntes at være lav i forhold til CD3 + og CD8 + T-celler, der fremhæver det faktum, at andre CD4 + T-celler er til stede, som kunne spille en vigtig rolle i MSI CRC’er.

I vores undersøgelse forudsigende faktorer af tilbagefald var node invasion og VELIPI kriterier, som allerede rapporteret i MSS CRC’er [41]. Associering mellem tumor-infiltrerende regulatoriske T-celle-tæthed og fraværet af VELIPI kriterier er afgjort det mest vigtigt resultat i denne undersøgelse. Alle disse resultater skal bekræftes og mere præcist defineret, forhåbentlig i en større polycentrisk kohorte af MSI CRC patienter, herunder flere patienter med recidiv.

Tak

Forfatterne vil gerne takke Jeffrey Arsham , en amerikansk oversætter, for at have gennemgået og revideret den oprindelige engelsksprogede tekst. Forfatterne vil gerne takke Julie Tinat for data vedrørende germlinie MMR test.