PLoS ONE: Forskellige virkninger af BORIS /CTCFL på Stemness Gene Expression, Sphere Dannelse og Cell overlevelse i Epithelial cancerstamceller

Abstrakt

Kræft stamceller er kræftceller karakteriseret ved stamceller egenskaber og udgør en lille population af tumorceller, der driver tumor udvikling, progression, metastase og resistens. Til dato er de molekylære mekanismer, der genererer og regulerer cancer stamceller ikke veldefineret. BORIS (Brother af regulator af imprintede steder) eller CTCFL (CTCF-lignende) er en DNA-bindende protein, der er udtrykt i normale væv kun i kønsceller, og genaktiveres i tumorer. De seneste beviser har fremhævet sammenhængen af ​​

BORIS /CTCFL

udtryk med dårlig samlet overlevelse af forskellige kræftpatienter. Vi har tidligere vist en sammenslutning af BORIS-udtrykkende celler med stemness genekspression i embryoniske cancerceller. Her, studerede vi rolle BORIS i epiteliale tumorceller. Brug BORIS-molekylærbeacon der allerede var valideret, var vi i stand til at vise tilstedeværelsen af ​​

BORIS

mRNA i cancer stamceller beriget populationer (side befolkning og kugler) af livmoderhalskræft, tyktarmskræft og brystkræft tumorceller. BORIS dæmpende undersøgelser viste et fald på kugle dannelse kapacitet i bryst og tyktarm tumorceller. Vigtigere er det, BORIS-lyddæmpning førte til nedregulering af

hTERT

, stamceller (

NANOG

,

OCT4

,

SOX2

BMI1

) og kræft stamcellemarkører (

ABCG2

,

CD44

ALDH1

) gener. Omvendt BORIS-induktion førte til opregulering af de samme gener. Disse fænotyper blev observeret i hals-, colon- og invasive brysttumorceller. Imidlertid blev en helt anden adfærd observeret i de ikke-invasive brysttumorceller (MCF7). Faktisk købte disse celler en epitelial mesenkymale overgang fænotype efter BORIS lyddæmpning. Vores resultater viser, at BORIS er associeret med cancer stamcelle-berigede populationer af flere epitel tumorceller og de forskellige fænotyper afhænger af oprindelsen af ​​tumorceller

Henvisning:. Alberti L, Losi L, Leyvraz S, Benhattar J (2015) Forskellige virkninger af BORIS /CTCFL på Stemness Gene Expression, Sphere Dannelse og Cell overlevelse i Epithelial Cancer Stem Cells. PLoS ONE 10 (7): e0132977. doi: 10,1371 /journal.pone.0132977

Redaktør: Gabriele Saretzki, University of Newcastle, England

Modtaget: April 2, 2015; Accepteret: 19. juni 2015; Udgivet: 17 Jul 2015

Copyright: © 2015 Alberti et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Finansiel støtte blev givet af den schweiziske National Science Foundation (31003A-113.505) og Emma Muschamp Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. En af forfatterne (JB) er ansat af en molekylær patologi laboratorium (Biopath Lab). Biopath Lab ydet støtte i form af løn, men havde ikke nogen yderligere rolle i undersøgelsen design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. En af forfatterne (JB) er ansat af en molekylær patologi laboratorium (Biopath Lab). Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Enorme beviser støtter det synspunkt, at menneskets kræft kunne anses som en stamcelle sygdom [1- 3]. Den cancerstamceller (CSCS) teori antager, at cancere betragtes som komplekse væv, hvor aberrerende cellevækst drives af en lille population af celler, der er defineret som tumor-initierende celler. Disse celler er kendetegnet ved tre vigtigste egenskaber: ukontrolleret proliferation kapacitet, evne til selvfornyelse og evnen til at differentiere til en ikke-CSC afkom [3, 4]. Interessant, egenskaberne af disse maligne celler er nøje ligner de tre funktioner, der karakteriserer normale stamceller: potentialet til at proliferere udførligt, til selvfornyelse og evnen udvikle sig til flere slægter. Følgelig er tumorceller med disse egenskaber også kaldet cancer stamceller. De første observationer af tilstedeværelsen af ​​CSCS blev udført i human akut myeloid leukæmi [5] og følgelig udviklet i forskellige typer af humane faste tumorer, som bryst- [6], hjerne [7], colon [8, 9], pancreas [10 ] og æggestokkene [11] tumorer. Det er blevet vist, at mange cancerpatienter, især med faste tumorer, reagerer dårligt på konventionelle behandlinger, såsom kemoterapi og strålebehandling, og efter en indledende delvis remission, tumorer tilbagefald. Årsagerne til en sådan undladelse kunne forklares ved den lægemiddel- og radio- modstand CSCS. Desuden er det blevet påvist, at CSCS er hyppigere i meget aggressive og ildfaste tumorer [6-7]. Derfor bliver det meget vigtigt at identificere de CSC befolkninger og deres markører for at udvikle CSC-målrettede behandlinger til at overvinde modstanden i CSCS til de konventionelle anti-cancer medicin. Ved hjælp af eksperimentelle tilgange har CSCS mange tumortyper blevet karakteriseret fænotypisk og er blevet identificeret adskillige CSC markører [4, 12]. Men de fleste af de identificerede markører ikke er fuldt specifikke for CSCS fordi de også er udtrykt i normale celler, og derfor kræves brugen af ​​flere markører. Mange indsats kræftforskningen vil være nødvendigt at optimere målrette CSCS behandlingsformer. Der er flere metoder til at berige de CSCS befolkninger, som hovedsagelig anvendes til

in vitro

analyser og screeningsmetoder. Én fremgangsmåde er baseret på udvælgelse af en celle subpopulation, der er i stand til udstrømning farvestoffer. Udstrømningen af ​​disse farvestoffer er en kapacitet på CSCS som udtrykke gener der koder for de ATP-bindende kassette (ABC) lægemiddeltransportere, såsom ABCG2 [13-15]. Den mest anvendte farvestof er Hoechst 33342, som er en DNA-bindende farvestof. Den valgte ved denne metode delpopulation kaldes side befolkning (SP). Aldehydet dehydrogenase (ALDH) aktivitet er en anden funktionel egenskab af stamceller, anvendes til isolering beriget CSCS population [16, 17]. En yderligere

in vitro

tilgang er baseret på ikke-klæbende serum-fri kultur [8, 18]. Ved hjælp af denne metode, kan cellerne fra forskellige typer af tumorer (herunder hjerne, bryst og tyktarm), som har kapacitet til selv-fornyelse og for at opretholde stilk-celle egenskaber, danne kugleformede kolonier navngivne kugler [19].

BORIS (Brother of Regulator of imprintede websteder) er et DNA-bindende protein, der deler med sin paralog CTCF, en 11 zink-finger-domæne, således også kaldet CTCFL (CTCF-lignende) [20]. BORIS-protein er involveret i epigenetisk omprogrammering og det hører til cancer testis antigen familie, som det er udtrykt i normal germinalceller og genaktiveret i tumorer. Nylige rapporter viser, at BORIS udtryk er forbundet med fremskreden i forskellige kræftformer, såsom ovarie-, prostata-, esophageal og hepatocellulære kræftformer [21-24]. I ovariecancer, kan BORIS udtryk også give dårlig prognose [21]. Vores tidligere undersøgelse har vist, sammenslutningen af ​​BORIS udtryk med stamcelle og CSC markørgener i embryonale carcinomaceller [25]. Tilsammen disse beviser bedt os for yderligere at undersøge tilstedeværelse og de molekylære funktioner BORIS i CSCS-berigede populationer i andre typer af tumorceller og specifikt i livmoderhalsen, kolon og bryst tumorceller. Da der endnu ikke er en valideret antistof mod BORIS, brugte vi BORIS-molekylære beacon (BORIS-MB), der tidligere blev testet og valideret til

in vivo

påvisning af

BORIS

mRNA [25 ]. BORIS-MB tilladt os at visualisere BORIS-positive celler i de analyserede epiteliale tumorceller. Interessant, fandt vi, at

BORIS

er stærkt udtrykt i CSC-berigede populationer isoleret fra SP og sfærer. Desuden funktionelle undersøgelser viste, at BORIS kunne spille en vigtig rolle i selv-fornyelse af tumorer og erhvervelse af epitelial mesenkymale overgang (EMT) signatur i bunden af ​​oprindelsen af ​​tumorcellerne.

Materialer og metoder

Celler og kugler forberedelse

de humane cellelinier (HeLa, livmoderhalskræft adenocarcinom, HT29, colon adenocarcinom, NCCIT, embryonale carcinom) blev købt fra American Type Culture Collection (ATCC) og den menneskelige bryst cellelinjer (MCF7 og MDA-MB-231) blev leveret af Dr. Stéphanie Renaud (Biotechnology Institute, University of Lausanne). Cellerne blev dyrket ved 37 ° C med 5% CO

2 enten i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM; Gibco, Invitrogen) for HeLa og HT29-celler, eller i RPMI-1640-medium (Gibco, Invitrogen) for NCCIT, MCF7 og MDA-MB-231-celler, suppleret med 10% varme inaktiveret føtalt bovint serum. (FBS; Invitrogen) og 1% af penicillin-streptomycin (Gibco, Invitrogen)

i sfære kultur, celler (HT29, MCF7 og MDA-MB-231) blev først fritliggende med 0,25% trypsin-opløsning (Invitrogen) og vasket to gange i PBS (Invitrogen). Derefter blev celler filtreret to gange under anvendelse af en celle-si på 40 um maskestørrelse (Falcon) og dyrket i serum-frit medium indeholdende DMEM /F-12 medium (Invitrogen) suppleret med B27 (Invitrogen), 5 ug /ml heparin (Sigma ), 20 ng /ml EGF (epidermal vækstfaktor, BD Biosciences), 20 ng /ml FGF (fibroblastvækstfaktor, BD Biosciences) og 5 ug /ml insulin (Sigma). Celler blev udpladet i ultralav tillæg 6-brønds plader (Corning) ved densiteten af ​​1.000 celler /ml i 10-15 dage. Sfærer blev talt og opsamlet til RNA-ekstraktion. En alikvot af sfærer blev podet i normalt medium med serum for at tillade differentiering.

Fluorescens analyse under anvendelse BORIS-MB

Celler blev fremstillet som tidligere beskrevet [25]. Kort fortalt celler i suspension (1 x 10

6 celler /ml) blev inkuberet ved 37 ° C i 1,5 time i serumfrit DMEM-medium med Cy3-BORIS MB (200 nM) og Hoechst 33342 (5 ug /ml) i nærværelse af en Lipofectamine RNAiMAX siRNA transfektionsreagens (Invitrogen). Cellerne blev vasket, resuspenderet i PBS-5 mM EDTA og cytocentrifugated på objektglas ved anvendelse af en cytospin-centrifuge og derefter undersøgt under et fluorescerende (Axioplan2 Imaging, Zeiss) eller et konfokalt (LSM 710 Quasar, Zeiss) mikroskop.

For ABCG2 fluorescens farvning blev celler fremstillet som beskrevet over. Efter cytospin blev celler fikseret med iskold acetone i 8 minutter og farvet ved 4 ° C natten over med kanin-anti-humant ABCG2 antistof (Sigma), der anvendes ved fortyndet 1:20 i PBS. Objektglas blev vasket med PBS og inkuberet i 1 time ved stuetemperatur med æsel-anti-kanin sekundært antistof mærket med Alexa Fluor 488 (Sigma) anvendt ved 1: 500 fortynding i PBS. Objektglassene blev derefter undersøgt under fluorescensmikroskop.

FACS-analyse og sortering af SP

HeLa-celler (1 x 10

6 celler /ml) blev inkuberet i serumfrit medium ved 37 ° C i 1,5 time med Hoechst 33342 (Invitrogen) i en endelig koncentration på 12,5 pg /ml enten alene eller i kombination med 50 pM verapamil (Sigma) som en kontrol. Cellesuspensionerne blev periodisk blandes under inkubationen. Efter inkubation blev cellerne vasket med PBS og resuspenderet i PBS-5 mM EDTA. Før analysen blev cellerne inkuberet med propidiumiodid (2 ug /ml) og filtreret under anvendelse af en celle-si på 40 um maskestørrelse (Falcon). SP blev udført ved hjælp LSRII (Becton Dickinson) og sortering af SP og NSP (ikke-SP) ved hjælp af FACS Aria (Becton Dickinson) ved anlægget af EPFL (Ecole Polytechnique Fédérale Lausanne). Hoechst 33342 farvestof var ophidset ved 355 nm og dens fluorescens blev analyseret ved hjælp af dual-bølgelængde på emission, 445 nm for Hoechst blå og 650 nm for Hoechst rød.

Ektopisk BORIS udtryk

Hela celler transficeret med pCMV-BORIS plasmidet under anvendelse af lipofectamin 2000 transfektionsreagens (Invitrogen) som tidligere beskrevet [25].

BORIS knockdown af inducerbar shRNA lentiviral systemet

Stables cellelinier med inducerbare udtrykkende shRNAs målretning human

BORIS

mRNA blev fremstillet som tidligere beskrevet [25]. HeLa, HT29, MCF7 og MDA-MB-231 tumor cellelinier blev anvendt i disse eksperimenter.

BORIS cDNA-ekspression ved inducerbar lentiviral systemet

Stabile cellelinier med inducerbar udtrykker human

BORIS

cDNA blev dannet ved anvendelse af doxycyclin-inducerbare lentiviral systemet [26]. BORIS cDNA fra pCMV-BORIS plasmid blev klonet ind pINDUCER20 af Gateway Cloning System (Invitrogen). Lentivirusvektoren pINDUCER20 indeholder antibiotikummet selektionsmarkør G418 (Geneticin), som gør det muligt kun at udvælge de transducerede celler. Denne vektor indeholder også en kassette med en doxycyclin promotor, der styrer transkriptionen af ​​det klonede cDNA. Til fremstilling af lentivirus, fulgte vi vores procedure som tidligere beskrevet [25]. Den virale suspension kombineret med 8 ug /ml polybren (Sigma) blev anvendt til at inficere målceller (HeLa-, HT29, MCF7 og MDA-MB-231). Fireogtyve timer efter infektion blev mediet erstattet med medium suppleret med 500 ug /ml G418 (Roche). Efter 2 uger af antibiotisk selektion blev 2 ug /ml doxycyclin (Sigma) tilsat til mediet for at tillade induktion af

BORIS

cDNA-ekspression og doxycyclin-holdigt medium blev fornyet hver 3. dag.

Kvantitativ RT-PCR-analyse

QRT-PCR-analyser blev udført som tidligere beskrevet [25]. Den ΔΔCt fremgangsmåde blev anvendt til bestemmelse af de relative ekspressionsniveauer, som var normaliseret til

GAPDH

niveau. Som allerede beskrevet [25], for alle de amplificerede målgener PCR effektivitet forlænges fra 94 til 101%, med korrelationskoefficienten (r2) i området fra 0,96 til 1.0. De Ct-værdier for GAPDH målte lignende niveauer (Ct = 10.07 ± 0.25) for alle de analyserede celler.

Sekvenserne af primer anvendes derudover er vist i S1 tabel.

CD44 + /CD24 – analyse af flowcytometri

CD44 + /CD24- udtryk blev analyseret i celler manipuleret til stabilt udstille knockdown

BORIS

mRNA eller udtrykke

BORIS

cDNA. Celler blev trypsinbehandlet og 10

6 celler blev resuspenderet i 100 pi PBS-1% FBS. Monoklonale muse-anti-humant CD44-APC-H7-antistof (BD Pharmingen) og et monoklonalt muse-anti-humant CD24-Alexa Fluor 647-antistof (BD Pharmingen) tilsat ved fortyndinger på 1:20 og 1: 5 henholdsvis som foreslået af fabrikant, og inkuberet i 40 minutter ved 4 ° C. DAPI blev tilsat i en koncentration på 1 ug /ml i den sidste 10 minutters inkubation. Efter vask med PBS-1% FBS, flowcytometrianalyse blev udført ved anvendelse Gallios flowcytometer (Beckman Coulter). Mindst 5 x 10

4 hændelser blev talt for alle prøver. Analysen af ​​en procentdel af CD44 + /CD24- celler blev estimeret efter udelukke døde celler (DAPI positive celler) og gating på eGFP og TRFP positive celler. Resultaterne blev analyseret ved anvendelse FlowJo software. Der blev udført tre uafhængige forsøg.

Kolonidannelseseffektivitet assay

Celler blev trypsinbehandlet og resuspenderet i medium. Tre hundrede celler blev podet i 6 brønd /plader i triplikater. Celler blev dyrket i frisk doxycyclin-holdigt medium. Efter 2 uger blev cellerne fikseret med 1 ml 4% formaldehyd i 10 minutter ved stuetemperatur og farvet med 1 ml 0,1% krystalviolet i 10 min. Efter vask med PBS blev hver brønd fotograferet og kolonierne (bestemt som 50 celler /koloni). Blev talt under anvendelse ImageJ program

Migration assay

Cell migration blev bestemt under anvendelse cellekultur indsatse (BD Falcon) med 8 um porestørrelse. Kort fortalt blev cellerne høstet og resuspenderet i serum-frit medium, 5 x 10

4-celler blev udpladet i toppen af ​​inserter placeret i 24-brønds plader. Nederst brønd inserterne blev tilsat 500 pi medium suppleret med 10% FBS. Efter 48 timers inkubation blev ikke-migrerende celler fjernes med en vatpind og de migrerende celler (på den nedre overflade af indsatsen) blev fikseret med 1 ml 4% formaldehyd og farves derefter med 1 ml 0,1% krystalviolet i 10 min. Efter vasket 3 gange med PBS blev de migrerende celler talt under ti tilfældige høj effekt mikroskopiske felter pr insert og det gennemsnitlige antal migrerende celler blev beregnet for hver gruppe af celler.

celleproliferation og kemo-følsomhed analyser

Cell spredning analyse efter BORIS lyddæmpning og BORIS induktion blev vurderet af MTT assay som tidligere beskrevet [25].

In vitro

vækst effekt af 5-fluorouracil (5- FU) blev bestemt ved MTT-assayet. Kort beskrevet hver gruppe af celler, efter BORIS nedregulering, blev podet i tre eksemplarer med en densitet på 1 x 10

4 celler /brønd i plader med 96 brønde i doxycyclin-holdigt medium. Dagen efter blev 5-FU (Sigma) tilsat ved forskellige koncentrationer: 0,5, 5, 50 og 500 ug /ml. Celler blev inkuberet i 2 dage og derefter cellelevedygtighed blev målt ved MTT-assayet. Vækstinhibering eller overlevende fraktion blev udtrykt i procent af de ubehandlede kontroller, der blev målt på en gang, ved anvendelse af ligningen: (absorbans af behandlede prøve /absorbansen af ​​ubehandlede prøve) x 100.

Statistisk analyse

Statistisk signifikans blev vurderet ved anvendelse to-halet student t-test analyse. P-værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

BORIS

mRNA udtrykkes i side population celler

For at undersøge tilstedeværelsen af ​​

BORIS

mRNA i CSC-berigede populationer af epitelceller tumorceller, vi bruges som modeller for humane HeLa (cervical), HT29 (colon), MCF7 (non-invasiv bryst) og MDA-MB-231 (invasiv bryst) tumorcellelinier. Ekspression analyse viste et lavere niveau af

BORIS

mRNA i HeLa og HT29 sammenlignet med embryonale tumorceller (NCCIT), mens i MCF7 og MDA-MBA-231-celler

BORIS

mRNA var næsten upåviselig ( fig 1A). Derfor kan HeLa, HT29, MCF7 og MDA-MBA-231 tumorceller klassificeres som BORIS-low udtrykkende tumorceller.

(A)

BORIS

ekspression i humane tumorcellelinier. Total RNA fra NCCIT (embryonale), HeLa (cervical), HT29 (colon), MCF7 (non-invasiv bryst) og MDA-MB-231 (invasiv bryst) tumorceller blev ekstraheret og

BORIS

ekspression blev analyseret ved QRT-PCR. Resultaterne blev normaliseret til

GAPDH

og relateret til NCCIT celler. Fejlsøjler repræsenterer middelværdien ± SD (n = 3). (B)

BORIS

udtryk som påvist ved hjælp af BORIS-MB. Repræsentative billeder af HeLa, HT29, MCF7 og MB-MDA 231-celler, 40X forstørrelse. Celler blev inkuberet med Cy3-BORIS MB (200 nM) og Hoechst 33342 (5 ug /ml) ved 37 ° C i 1,5 time i serumfrit medium og derefter undersøgt under fluorescerende mikroskopi. Hvide pile angiver Hoechst negative celler som også

BORIS

mRNA positive som påvist ved BORIS-MB.

Hoechst side befolkning (SP) analyse er en gennemprøvet teknik til at berige stilk og tidligt progenitorceller i forskellige cellelinier [13-15]. Fluorescensimagografi analyse blev udført ved anvendelse af Hoechst 33342 i kombination med

BORIS

mRNA påvisning under anvendelse BORIS-Molecular Beacon (BORIS-MB), som tidligere beskrevet [25]. Fluorescensimagografi analyserne viste, at Boris positive celler er kun en delmængde af celler i alle analyserede epiteliale tumorcellelinier (Fig 1B), i overensstemmelse med resultaterne opnået i embryonale tumorceller [25]. Den estimerede frekvens Boris positive celler er ca. 0,1% i HeLa, 0,5% i HT29 og mindre end 0,05% i MCF7 og MDA-MBA-231-celler; i modsætning det var omkring 5% i NCCIT [25]. Interessant nok viste fluorescens imaging analyser, at størstedelen af ​​BORIS-positive celler var også Hoechst negative (hvide pile i fig 1B og S1 Fig). Derfor

BORIS

udtryk kunne være forbundet med Hoechst negativ fænotype af SP celler i livmoderhalsen, tyktarm og bryst tumorceller. Men en lille procentdel (mindre end 10%) Boris positive celler var Hoechst positive.

ABCG2 beskrives som den største efflukspumpen ansvarlig for Hoechst negative fænotype i SP celler [27]. Derfor en mulig co-ekspression af

BORIS

med kemoresistens transportør protein ABCG2, blev først undersøgt. HeLa-celler blev anvendt i dette eksperiment. Som det kan ses i figur 2A, BORIS positive celler er både negative for Hoechst (hvide pile) og positive for ABCG2 protein. For at bekræfte tilstedeværelsen af ​​

BORIS

mRNA i CSC-beriget population af HeLa-celler, SP-celler og også de ikke-SP (NSP) -celler blev sorteret ved FACS. Procentdelen af ​​SP-celler var fra 0,5% til 1,5% af de totale celler (Fig 2B), i overensstemmelse med tidligere rapporter [15, 27]. SP-fraktionen blev fuldstændigt reduceres ved tilsætning verapamil, en inhibitor af ABC-transportører, hvilket indikerer, at populationen var bona fide SP-celler. Den QRT-PCR-analyse viste, at

BORIS

mRNA-niveau af SP-celler var signifikant højere (12 fold, s 0,05) sammenlignet med NSP og parentale HeLa-celler (fig 2C). Også

ABCG2

mRNA niveau var højere (ca. 1,5 gange) i SP sorteres celler i forhold til NSP og forældrenes celler (Fig 2D). For yderligere at kontrollere tilstedeværelsen af ​​

BORIS

i SP CSC-beriget population, blev frekvensen af ​​SP analyseret i pCMVBORIS-transficerede HeLa-celler (Fig 2E). Som forventet blev overekspression BORIS celler betydeligt mere beriget med SP-celler (2 gange, p = 0,01) sammenlignet med HeLa parentale celler. Alle disse resultater viste, at isoleringen af ​​BORIS-positive celler kan føre til en berigelse af CSC befolkning i HeLa-tumorceller.

(A) Immunofluorescensanalyse af ABCG2 i HeLa-celler. Cellerne blev inkuberet med BORIS-MB og Hoechst 33342 ved 37 ° C i 1,5 timer i serum-frit medium. Efter cytocentrifugation objektglassene blev fikseret med kold acetone og derefter inkuberet med kanin polyklonalt ABCG2 antistof. Den BORIS positive /ABCG2 positive /Hoechst negative celler er angivet med hvide pile. 10X forstørrelse. (B) repræsentant punktdiagram over flowcytometrianalyse af SP. HeLa-celler blev inkuberet med Hoechst 33342 (12,5 ug /ml) enten alene eller i kombination med verapamil (50 uM). Analysen blev udført ved anvendelse LSRII og sortering ved hjælp af FACS Aria. Portene angiver de sorterede SP og NSP celler. (C)

BORIS

mRNA og (D)

ABCG2

mRNA ekspression i SP og NSP isoleret fra HeLa-celler. Totalt RNA blev ekstraheret og analyseret ved QRT-PCR. Grafer angiver mRNA niveauerne af

BORIS

ABCG2

gener normaliseret til

GAPDH

og relaterede til de parentale HeLa-celler. Data er repræsenteret som middelværdi ± SD fra 3 uafhængige eksperimenter. Asterisk angiver p 0,05. (E) SP analyse i BORIS overudtrykte celler. HeLa-celler blev transient transficeret med en BORIS ekspressionsvektor (HeLa pCMVBORIS). Efter 2 dage, 1 x 10

6 celler blev inkuberet med Hoechst 33342 (12,5 ug /ml) enten alene (top) eller i kombination (nederst) med 50 pM verapamil. Analysen blev udført ved hjælp LSRII flowcytometri og en repræsentant eksperiment af 3 uafhængige eksperimenter er vist.

Colon-kugler og Mammo-sfærer udtrykker høje niveauer af

BORIS

mRNA

Den vækst af celler i suspension, med en serum-frit medium (sfære kultur), er en fælles tilgang til CSC-berigelse [7-8]. Da dette hotel blev rapporteret at være begrænset til stamceller /stamceller [19],

BORIS

udtryk blev også undersøgt i danner-sfærer af kolon (HT29) og bryst (MCF7) tumorceller. En alikvot af sfærer blev udsået i serumholdigt medium for at tillade differentiering. Interessant

BORIS

ekspressionsanalyse afslørede en signifikant højere niveau af

BORIS

mRNA i kolon sfærer (37.2 ± 7.3 fold, n = 4) samt i Mammo sfærer (30,9 ± 6,4 fold, n = 4), sammenlignet med parentale celler og differentierede sfærer (Fig 3). Disse resultater antydede, at

BORIS

udtrykkes i CSC-berigede sfærer af kolon og brysttumorceller.

Celler blev podet ved lav densitet (1000 celler /ml) i kugle dyrkningsmedium i lav Fastgørelsespladerne. Efter 10-15 dage sfærer blev opsamlet til RNA-ekstraktion og en alikvot af kugler blev podet i normalt medium med serum for at tillade differentiering (differentierede sfærer).

BORIS

udtryk blev analyseret ved QRT PCR i (A) kolon-kugler (HT29 kugler) og differentierede-kugler (HT29 DIFF kugler) og i (B) Mammo-kugler (MCF7 kugler) og differentierede-kugler ( MCF7 DIFF kugler). Data, blev normaliseret til

GAPDH

og relateret til forældrenes celler (celler). Et repræsentativt eksperiment af 4 uafhængige eksperimenter er vist. Stjerner angiver statistisk signifikant forskel (p 0,05) mellem kugler og parentale celler. (C) Repræsentative billeder af kolon-kugler og Mammo-kugler vises, 4X forstørrelse. Sort skala søjler indikerer 250 um.

Genekspression og CSC fænotype i BORIS Knockdown celler

At udforske en mulig rolle BORIS i CSCS, valgte vi en knockdown strategi ved hjælp lentiviral systemet med inducerbart udtrykker shRNAs målrettet menneske

BORIS

mRNA. Den BORIS sh-3 blev BORIS sh-4 og scrambled-shRNA (CTR sh) lentivira tidligere genererede og valideret [25]. Disse lentivira blev brugt til at inficere HeLa, HT29, MCF7 og MBA-MD-231 tumorceller.

Det er blevet påvist, at BORIS aktiverer

hTERT

udtryk [28] og påvirker ekspressionen af ​​stemness gener i embryonale tumorceller [25]. I denne undersøgelse blev disse korrelationer udforsket i epiteliale tumorceller. Efter 2 uger af BORIS knockdown, udtryk analyser af

hTERT

,

CTCF

, de mest almindelige CSC markører (

ABCG2

,

CD44

,

ALDH1

) og stamcelle (

NANOG

,

OCT4

,

SOX2

,

BMI1

) gener blev udført. Fig 4A viser for alle analyserede gener, middelværdien af ​​folden ændring af BORIS sh-3 og BORIS sh-4-celler sammenlignet med CTR sh celler af hver manipuleret tumorcellelinie.

hTERT

udtryk var signifikant nedreguleret i alle analyserede tumorceller ved undtagelse af MCF7, hvor en betydelig opregulering (13 gange) blev observeret.

CTCF

ekspression blev faldet i alle celler, selv om faldet ikke var signifikant (fra 40% til 20% sammenlignet med kontrol). Især fraværet af BORIS trigged et fald i

ABCG2

ekspression (93% for MCF7, 25% for MDA-MB-231, 80% for HT29 og 60% for HeLa).

CD44

blev nedreguleret i alle undtagen en cellelinje, MCF7, hvor en 2,5 gange stigning blev observeret.

ALDH1

,

NANOG

,

OCT4

,

SOX2

BMI1

var generelt nedreguleret i alle tumorceller efter BORIS lyddæmpning. Alle sammen, disse resultater antydede, at BORIS væsentlig grad kan påvirke reguleringen af ​​

hTERT

/telomerase, stamceller og CSC markørgener i epitel tumorceller.

(A) MCF7, MDA-MB- 231, HT29 og HeLa-celler blev manipuleret til at stabilt udviser bankede ned

BORIS

mRNA. BORIS sh-3, sh-4 og CTR sh (kontrol shRNA indeholdende scrambled sekvens) lentivira blev anvendt til at inficere disse celler. Hver transducerede celler blev dyrket med doxycyclin at inducere BORIS shRNA ekspression. Medium indeholdende doxycyclin blev erstattet hver 3. dag. Efter 2 uger blev RNA isoleret fra BORIS sh-3, sh-4 og CTR sh af hver transduceret cellelinje. mRNA-niveauer af de angivne gener blev analyseret ved QRT-PCR. Grafer repræsenterer for hvert gen midler til fold induktion af både BORIS shRNA (BORIS sh-3 og sh-4) i forbindelse med den for kontrollen af ​​eventuelle celler. Standard fejl blev beregnet overvejer fejl formering af både BORIS shRNA analyser. Grafer viser et repræsentativt eksperiment. (B) repræsentant flowcytometri dot plots af CD44 og CD24 ekspression i MCF7, MDA-MB-231, HT29 og HeLa-celler manipuleret til stabilt udviser bankede-down

BORIS

mRNA. CD44 og CD24 ekspressionsmønstre for de to BORIS shRNA (BORIS sh-3 og sh-4) og kontrol (CTR sh) er vist. Anti-CD24-antistof mærket med AlexaFluor 647 og anti-CD44-antistof mærket med APC-H7 blev anvendt. Procentdelen af ​​CD44 + /CD24- population blev estimeret efter gating på eGFP og TRFP-positive celler (transduceres og DOX-induceret shRNA henholdsvis) og de endelige porte er baseret på isotypekontrol svarer til hver cellelinie. blev udført Alle eksperimenter uafhængigt tre gange og en repræsentativt forsøg er vist for hver gruppe af celler.

CD44 + /CD24- subpopulation har vist sig at være beriget med tumor-initierende funktioner, især i brystcancerceller [6, 29]. I denne undersøgelse blev CSC underpopulation analyseret ved flowcytometri i BORIS-knockdown tumorceller. En anderledes opførsel af MCF7 sammenlignet med de andre celler blev observeret (Fig 4B). Analyserne viste en bemærkelsesværdig overtagelse af CD44 + /CD24- fænotype i BORIS-knockdown MCF7-afledte celler, fra ingen CD44 + /CD24- celler i kontrollen til omkring 70% i de BORIS-knockdown celler. En ikke-signifikant fald i CD44 + /CD24- subpopulation blev observeret i BORIS-shRNA MDA-MB-231-afledte celler. I de ikke-bryst tumorceller, HT29 og HeLa, blev ingen ændring udtryksform observeret med begge celler viser en typisk CD44 + /CD24- epitelial fænotype.

Knockdown af BORIS påvirker celleproliferation i MCF7 bryst celler

Cell overlevelse blev vurderet efter BORIS knockdown. Celleproliferation og evnen til at danne kolonier blev målt hver uge i en måned. Den kolonidannelse (eller klonogene) assay overvåger evnen af ​​en cancer celler til at producere en levedygtig koloni efter behandling [30] og blev anvendt til at analysere

in vitro

kapacitet af tumorceller til at danne kolonier efter BORIS knockdown. Resultaterne viste ingen signifikant forskel på celleproliferation i alle undtagen en tumorcellelinie. Den pågældende undtagelse MCF7-celler, hvor en betydelig stigning (3-4 fold, s 0,0001) af celleproliferation sammenlignet med styre cellerne blev observeret (Fig 5A). Kolonidannelse assays bekræftede celleproliferationen resultater (figur 5B). Efter en måned BORIS-knockdown, antallet af kolonier var ikke signifikant forskellig for HeLa, HT29 og MDA-MB-231, sammenlignet med kontrolgruppen. I modsætning hertil antallet af kolonier var signifikant højere i MCF7. Disse resultater viste, at der på undtagelse af MCF7 brystkræftceller, BORIS tavshed i epitel tumorceller ikke havde en betydelig indvirkning på celle overlevelse.

(A) celleproliferation, over 1 måneds dox-induceret BORIS – og CTR- shRNA celler, blev analyseret hver uge af MTT-analysen. Resultater af to specifikke BORIS-shRNA (BORIS sh-3 og sh-4) er vist som en procentdel sammenlignet med celleproliferation af kontrolceller (krypteret shRNA, CTR sh). Fejlsøjler repræsenterer middelværdien ± SD (n = 3). Stjerner angiver statistisk signifikant forskel (p 0,05) mellem BORIS sh og CTR sh. (B) Repræsentative billeder af kolonidannelse assay efter 1 måned af BORIS knockdown. Tre hundrede celler blev podet i hver brønd i 6-brønds plader med medium indeholdende doxycyclin, blev hver celle gruppe fremstillet i tre eksemplarer.