PLoS ONE: Definition af ligand specificitet Slettet i kolorektal cancer (DCC) receptor

Abstrakt

vækst og vejledning af mange axoner i udviklingslandene nervesystem kræver netrin-medieret aktivering af Slettet i kolorektal cancer (DCC) og andre stadig ukendte signalering stikord. Kommissurale axon vejledning defekter er mere alvorlige i

DCC

mutant mus end

netrin-1

mutant mus, hvilket tyder på yderligere DCC aktiverende signaler udover netrin-1 er involveret i ordentlig Axon vækst. Her rapporterer vi, at interaktion skærme på ekstracellulære protein microarrays repræsenterer over 1.000 proteiner entydigt identificeret Cerebellin 4 (CBLN4), et medlem af C1q-tumornekrosefaktor (TNF) familie, og netrin-1 som ekstracellulære DCC-bindende partnere. Immunfluorescens og radioligandbinding undersøgelser viser, at netrin-1 konkurrerer med CBLN4 binding ved en overlappende sted inden for de membran-proksimale fibronectindomæner (Fn) 4-6 DCC og binder med -5 gange højere affinitet. CBLN4 binder også til DCC homolog Neogenin-1 (NEO1), men med en lavere affinitet end DCC.

CBLN4

-null mus viste ikke en defekt i kommissurale axoner i udviklingslandene rygmarv, men gjorde vise en forbigående stigning i antallet af vandrer axoner i plexus brachialis, i overensstemmelse med en rolle i Axon vejledning. Samlet set data størkner CBLN4 som en bona fide DCC ligand og styrker sin konsekvenser i Axon vejledning

Henvisning:. Haddick PCG, Tom I, Luis E, Quiñones G, Wranik BJ, Ramani SR, et al. (2014) Definition af ligand specificitet Slettet i kolorektal cancer (DCC) receptor. PLoS ONE 9 (1): e84823. doi: 10,1371 /journal.pone.0084823

Redaktør: Brian Key, School of Biomedicinsk Institut, University of Queensland, Australien

Modtaget: Juli 9, 2013; Accepteret: 20. november 2013; Udgivet: 6 Januar 2014

Copyright: © 2014 Haddick et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Alle bevillinger for denne forskning blev leveret af Genentech, et medlem af Roche-koncernen. Den bidragyder havde roller i undersøgelsesdesign, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, og forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har læst tidsskriftets politik og har følgende konflikter: Alle forfatterne er eller har været ansat af Genentech /Roche og kan ejer aktier i selskabet. Alt midler til denne forskning blev leveret af Genentech /Roche. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Udvidelse af axoner mod deres endelige mål er en væsentlig forudsætning for en hensigtsmæssig udvikling af den nervesystem. Axoner støder vejledning tidskoder langs deres ruter vækst, herunder fire større kanoniske signalveje: DCC-Unc5-netrin-1, Slit-Rundkørsel (Robo), semaphorin-plexin-neuropilin, og Ephrin-Ef [1] – [3]. Men der er voksende forståelse, at yderligere molekyler bidrage til denne proces samt [4], [5]. For bedre at forstå axon vækst og vejledning, vil det være vigtigt at bestemme repertoire af proteiner, der binder og interagerer med disse centrale signalering komponenter.

Her har vi fokus på at identificere interagerende proteiner til DCC. DCC er et 175-190 kDa medlem af Ig-superfamilien består af et enkelt transmembrant domæne og et stort ekstracellulært domæne (ECD) indeholdende fire C2-lignende Ig-domæner og seks FNIII domæner [6] – [8]. DCC er for nylig blevet rapporteret til at binde den udskilte ligand Draxin i mediering af axonal udvækst hæmning [9]. Imidlertid er den bedste-karakteriseret ligand DCC er netrin-1, et udskilt protein bestående af en kugleformet domæne VI, et domæne V med tre EGF repeats, og et C-terminalt domæne med ukendt funktion [10]. Selvom den præcise lokalitet af netrin-1 binding til DCC ikke er kendt, er det femte FNIII gentagelse af DCC kræves [11], [12].

I

Drosophila

, mutanter af DCC homolog

frazzled

føre til mere alvorlige axon midterlinjen vejledning defekter end

netrinAB

mutanter og dette er delvist reddet af

commissureless

uafhængig af netrin og antyder en ekstra frazzled ligand [13 ]. Tilsvarende knock-out af enten

DCC

eller

netrin-1

i mus resulterer i en fejl i kommissurale axoner at krydse rygmarven midterlinjen, men sværhedsgraden af ​​kommissurale Axon defekter i udvikling rygmarven er større i

DCC

knock-out mus sammenlignet med

netrin-1

mutant mus [14], [15]. Selv om der ikke er en pattedyr homolog af

commissureless

, disse fund støtter forslaget om, at der er yderligere ligander regulerer DCC aktivitet i hvirveldyr.

Her rapporterer vi, ved hjælp af en uvildig storstilet protein- microarray skærm, at der ud over netrin-1, CBLN4 er en yderst specifik ligand for DCC. De fire medlemmer af CBLN familien, CBLN1-4, udskilles, glycosylerede proteiner, der indeholder en C-terminalt kugleformede C1q domæne karakteristisk for C1q-TNF superfamilien [16], og de udtrykkes i udviklingslandene og voksne hjerne [17] . CBLN1 og CBLN2 er de bedst forståede CBLN familiemedlemmer og har vist sig at stabilisere synapser ved at fungere som en trans-synaptisk link, binding med beta-Neurexins af granula neuroner og delta 2 glutamatreceptorer af Purkinjeceller i lillehjernen [18] – [21]. Men lidt er kendt af den funktionelle rolle CBLN4 og der er ingen obvert adfærdsmæssige fænotype i en

CBLN4

knock-out mus [22]. For nylig, en uafhængig undersøgelse identificerede også DCC som CBLN4 bindende protein ved hjælp af en mere begrænset kandidat-baseret skærm [22]. Vi har yderligere kendetegnet DCC-CBLN4 interaktion og identificeret en forbigående vandre-Axon fænotype i plexus brachialis i murine

CBLN4

knock-out.

Materialer og Metoder

Etik Statement

Genentech Institutional Animal Care og brug Udvalg godkendte alle dyreforsøg.

Kloning og Protein Expression

Ekspressionskonstruktioner blev genereret ved standard PCR metoder ved hjælp af en in-house klon indsamling eller cDNA erhvervet fra Origene som template og subklonet ind i pRK5 vektoren indeholdende passende N-terminal eller C-terminal epitop-tag. Mutanter for DCC domæne kortlægningsundersøgelser blev fremstillet under anvendelse af Quick-Change II XL steddirigeret mutagenese kit (Stratagene). Alle konstruktioner blev sekvensen bekræftet før anvendelse. N-terminal FLAG-mærket (MGGTAARLGAVILFVVIVGLHGVRGKDYKDDDDKLE), fuld længde og deletionskonstruktioner til human DCC er som følger: Flag-DCC fuld længde (H26-I1442); Flag-DCC Ig1-4 (H26-S425-BamH1-L1098-I1442); Flag-DCC FN1-6 (S 426-I1442), Flag-DCC FN4-6 (E722-I1442). Protein ekspressionskonstruktioner blev genereret for opløseligt (C-terminale domæne udgår) [7] human netrin-1 (G25-K453) med en N-terminal gD-tag (MGGTAARLGAVILFVVIVGLHGVRGKYALADASLKMADPNRFRGKDLPVLLE), human CBLN4 (M1-L201) med en C-terminal fc-tag og det ekstracellulære domæne af humant DCC (M1-N1097) med en C-terminal Fc-tag. Komplette aminosyresekvenser er vist i tabel S1.

Proteiner blev udtrykt i kinesisk hamster ovarie (CHO) celler og oprenset som tidligere beskrevet [23]. Kort fortalt blev proteinerne oprenset fra transient transfektion medier ved batch adsorption på anti-Flag- eller anti-gD agaroseharpiks efterfulgt af pakning af harpiksen i kolonner til standard kromatografi. Fc-mærkede proteiner blev oprenset ved påfyldning på en protein A-Sepharose (Amersham Biosciences) søjle. Efter vask med phosphatbufret saltvand (PBS) til basislinien, blev proteiner elueret med 0,1 M eddikesyre pH 3 og neutraliseret øjeblikkeligt med 1,5 M Tris pH 8,6. En sekundær-gelfiltreringssøjle blev kørt som et sidste polering trin. Protein renhed blev vurderet ved SDS-PAGE farvet med Coomassie Blue og var . 90% ren

Protein Microarrays

Protein microarrays blev konstrueret på epoxysilan overtrukket objektglas (Schott) som tidligere beskrevet [ ,,,0],24]. To udskilt protein biblioteker blev anvendt. Bibliotek 1 omfattede 1.334 oprensede prøver, der repræsenterer 686 udskilte eller ekstracellulære domæner af enkelt-transmembrane proteiner [25]. Det andet udskilt protein bibliotek, Library 2, bestod af 624 prøver, der repræsenterer 562 gener (92 gener var til stede i begge biblioteker) (tabel S2). Nærmere oplysninger om screeningsmetoder er tidligere blevet beskrevet [24]. Kort fortalt blev multivalente protein-A-mikroperler (Miltenyi Biotech) fremstillet ud fra en 01:01 blanding af DCC-Fc og Cy5-mærket-hIgG og inkuberet med microarray dias anvendelse af en automatiseret aHyb hybridisering station (Miltenyi Biotech). Objektglas blev vasket med PBS-T (PBS + 0,1% Tween 20), tørret og derefter scannet for Cy5 fluorescens under anvendelse af et GenePix 4000B scanner (Molecular Devices). Objektglas blev analyseret under anvendelse GenePix Pro 6.0 software (Molecular Devices). Rapporterede signalintensiteter blev normaliseret ved den gennemsnitlige fluorescerende signal på tværs af alle prøver på diaset.

Bindende Eksperimenter

COS-7 celler (ATCC) blev transficeret med cDNA’er, som koder DCC eller, som en kontrol, Nogo-receptor (NGR) under anvendelse PolyFect (Qiagen) ifølge producentens anbefalinger. Efter inkubation ved 37 ° C i 48 timer blev celler vasket to gange i bindingsbuffer (1% varmeinaktiveret normalt gedeserum (Hings), 0,05% natriumazid, 2 ug /ml heparin i PBS) og inkuberet med 20 nM Alkaline Phasphatase (AP), CBLN4-AP, eller Nogo 66-AP fra konditioneret medium i 90 minutter i bindingsbuffer ved stuetemperatur. Cellerne blev derefter vasket tre gange i bindingspuffer, fikseret i 7 minutter i 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS, vasket tre gange i HEPES bufferopløsning (HBS -20 mM HEPES, pH 7,0, 150 mM NaCl), varmeinaktiveret for 30 min ved 65 ° C, og vasket tre gange i alkalisk phosphatase-buffer (AP puffer -100 mM Tris, pH 9,5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl

2). AP signal blev fremkaldt med nitro-blå tetrazolium-chlorid (NBT) /5-brom-4-chlor-3′-indolyphosphate p-toluidin-salt (BCIP) stamopløsning (Roche) fortyndet 50 gange i AP puffer i mørke i mindst 1 time, indtil AP afhængige dannelse af blå NBT /BCIP bundfald blev visualiseret.

overfladeplasmonresonans

overfladeplasmonresonans (SPR) eksperimenter blev udført på et Biacore 3000 (GE Healthcare) ved 25 ° C under anvendelse af en CM5 sensorchip i 0,01 M HEPES, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,005% Surfactant P20 (HBS-P) løbebuffer ved en strømningshastighed på 30 pl /min. Fuld-længde N-terminalt HA-mærkede CBLN1 og CBLN2 blev indkøbt fra R 15,082 respons enheder) og negativ kontrol Robo3-Fc (højre; 9,833 respons enheder) med CBLN1, CBLN2, CBLN3 og CBLN4 injiceres som analytter på 10 ug /ml. Robust binding blev detekteret til CBLN4 (sort trace), mens der ikke bindende signal blev opdaget for de andre Cerebellin familiemedlemmer (grå spor). B) En radio-lignad assay blev anvendt til bestemmelse af affiniteten af ​​CBLN4-Fc (venstre) og gD-netrin-1 (højre) til DCC transient transficeret ind HEK293T celler.

125I-mærket ligand lodes binde transficerede celler i nærvær af stigende mængder af umærket ligand. Beregnet

K

D

værdier er angivet på graferne og er repræsentative for 3 uafhængige forsøg.

Identifikation CBLN4 Binding Partners

For at afgøre, om der var andre CBLN4 receptorer foruden DCC, blev et protein-microarray skærm udført i omvendt hvor CBLN4-Fc blev anvendt som madding, var imidlertid ingen klare hits fundet (data ikke vist). Mærkeligt, DCC selv blev ikke identificeret som et hit. Tidligere undersøgelser indikerer, at proteiner er i vid udstrækning aktive på mikroarrayet substrat [24], selv om der er mulighed for, at DCC er følsom over for denne type immobilisering. Dernæst fjorten neuronale proteiner, der vides at koordinere neuron axonal sti finde magen til DCC-funktion, blev screenet under anvendelse af en celle-bindingsassay. Binding af CBLN4-Fc blev evalueret over COS-7-celler transficeret med kloner svarende til umærkede fuld længde kandidatgener. Det skal bemærkes, at et negativt resultat ikke nødvendigvis udelukker kandidat interaktion da protein udtryk var ubekræftet. Kvantificering af fluorescensintensiteten for CBLN4-Fc-farvning til disse transficerede kloner identificerede DCC og to andre potentielle ligander, netrin-1 og NEO1 (figur 4A). Signalet observeret for netrin-1 binding, dog forblev konstant uanset ændringer i CBLN4 koncentration og også med sekundær detektionsantistof alene (data ikke vist), tegn på en falsk positiv på skærmen. NEO1 interessant, er en DCC paralog og fungerer også som en netrin -1 receptor [29]. Både DCC og NEO1 har lignende domænestrukturer og dele 54% identitet over ECD region. Til kvalitativ evaluering bindingsstyrker til netrin-1 og NEO1, DCC-udtrykkende COS-7-celler blev individuelt evalueret med en titrering række faldende CBLN4-Fc. Samspillet mellem CBLN4 og NEO1 kunne påvises ved CBLN4-Fc koncentrationer på 25 ug /ml (280 nM) eller højere. I modsætning hertil CBLN4-Fc-binding til DCC-udtrykkende celler viste robust signaler med koncentrationer så lave som 0,78 ug /ml (8,7 nM) (figur 4B). Disse data antyder, at binding af NEO1 til CBLN4 betegner en meget lavere affinitet interaktion sammenlignet med DCC bindende CBLN4. Til yderligere karakterisering af CBLN4-NEO1 interaktion, blev NEO1 forbigående udtrykker HEK293T cellerne analyseret for binding til CBLN4-Fc-protein ved flowcytometri og radio-ligand-bindingsassay under anvendelse af

125I-mærket CBLN4. Desværre fik CBLN4 ikke interagerer med NEO1 udtrykkende celler med en af ​​disse metoder, sandsynlige grund af et meget lav affinitet (data ikke vist).

A) kvantificering af CBLN4-Fc-binding til COS-7-celler transficeret med de angivne Axon vejledning proteiner. Data repræsenterer tre uafhængige gentagne plader, der hver indeholder tre fordybninger og fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsen af ​​middelværdien. B) Flag-DCC og Flag-NEO1 blev udtrykt transient ved overfladen af ​​COS-7 celle som påvist ved anti-Flag-farvning (øverste panel). Den nederste panel viser en titrering række CBLN4-Fc binding til DCC eller NEO1. Tredobbelt uafhængige forsøg blev udført og fejl repræsenterer standardafvigelsen på middelværdien.

CBLN4 bindes til FN4-6 Region DCC

DCC er et enkelt transmembrant protein indeholdende fire Ig gentagelser og seks FNIII gentagelser i ECD. At vurdere, hvilke domæner i DCC er nødvendige for CBLN4 binding blev deletionskonstruktioner DCC genereret og transficeret ind i COS-7-celler til bindingsanalyse. Fire DCC konstruktioner blev testet, udgør enten hele ECD (DCC.FL), den Ig1-4 gentager (DCC.Ig), den FN1-6 gentager (DCC.FN1-6), eller kun den C-terminale FN4-6 gentagelser (DCC.FN4-6). Den Ig1-4 gentager (DCC.Ig) viste ingen binding til CBLN4-Fc, hvilket tyder på, at den primære binding er afhængig af FN-domæner (figur 5A-B). I overensstemmelse med denne fortolkning, udtryk for kun FN gentager (DCC.FN1-6) eller kun de sidste tre FN-domæner (DCC.FN4-6) bevaret stærke CBLN4-Fc binding. Disse resultater viser, at DCC-FN4-6 er tilstrækkeligt til at mægle binding til CBLN4.

A) en skematisk gengivelse af DCC er vist med Ig domæner i sort og FN domæner i grønt. Repræsentative fluorescerende billeder er vist for CBLN4-Fc-binding til COS-7-celler, der udtrykker fuld længde DCC, DCC Ig1-4, DCC FN1-6, DCC FN4-6, og negativ kontrol APP. Påvisning af CBLN4-Fc-binding var gennem anti-humant Alexa Fluor-488 (grøn). Påvisning af celleoverfladeekspression af alle FLAG-mærket DCC deletionsmutanter blev bekræftet med en Alex Fluor-647 mærket anti-muse IgG (rød). B) kvantificering af CBLN4-Fc binding til DCC domæne deletionskonstruktioner. Tredobbelt uafhængige forsøg blev udført og fejl repræsenterer standardafvigelsen på middelværdien.

netrin-1 konkurrerer med CBLN4 Binding

Tidligere offentliggjorte rapporter implicerer FN4-6 regionen DCC i netrin-1 binding [11], [12]. Vores observation, at CBLN4 binding mappet til samme region på DCC førte os til at undersøge, om netrin-1 og CBLN4 konkurrerer om DCC binding eller hvis alle tre proteiner kan danne et ternært kompleks. Brug af co-immunopræcipitationsundersøgelser er det blevet nylig rapporteret, at CBLN4 binding til DCC kan udkonkurreret af netrin-1 [22]. For at bekræfte disse resultater, vi udnyttet en følsom radio-ligand tilgang. Dataene viser, at

125I-mærket CBLN4-Fc (300 pM) bundet specifikt til DCC udtrykkende HEK293T celler, og at binding blev blokeret af præinkubation af cellerne med netrin-1 (1 uM) i forhold til ingen behandling-kontrol ( Figur 6A). Ufuldstændig blokering af

125I-mærket netrin-1 (52 pM) med CBLN4-Fc (2 uM) blev observeret i den omvendte eksperiment og sandsynligvis kan tilskrives -5-fold forskel i affiniteten af ​​CBLN4 og Netrin- 1 for DCC. En titrering med stigende koncentrationer af netrin-1 viste tydelig forskydning af en fast koncentration af

125I CBLN4-Fc til DCC udtrykkende HEK293T celler (figur 6B). Vore data viser, at CBLN4 og netrin-1 bindingssteder til virksomheden samme FN region i DCC og sterisk overlapning.

A) kvantificering af mængden af ​​

125I-radiomærket CBLN4-Fc eller gD-Netrin- 1 bundet til DCC udtrykkende HEK293T celler eller ikke-transficerede kontrolceller, præinkuberet med umærket gD-netrin-1 eller CBLN4-Fc hhv. Data fra fire uafhængige forsøg er vist. Hver bjælke repræsenterer 3 tekniske replikater udtrykt som middelværdi ± SD. One-tailed Students

t

test blev anvendt: *,

P

0,05; **,

P

0,01; ***,

P

0,001. B) forskydning plot, repræsentant fra tredobbelte uafhængige eksperimenter, er vist for gD-netrin-1 konkurrerer med binding af

125I-radioaktivt mærket CBLN4-Fc til DCC udtrykker HEK293T celler.

Karakterisering af CBLN4 Funktion under fosterudviklingen

det er tidligere blevet vist, at DCC og netrin-1 er nødvendige for den rette vejledning og vækst af axoner under fosterudviklingen [7], [15]. For at undersøge det bidrag CBLN4 kan have i DCC-netrin-1 signalering blev de neuronale fremskrivninger af

CBLN4

knock-out mus undersøgt. Generation af

CBLN4

knock-out mus inkluderet et knæk i en LacZ ekspressionskassette, der tillader β-galactosidase farvning af

CBLN4

+/-

mus til at visualisere lokalisering af CBLN4 udtryk. Den β-galactosidaseekspression mønster i

CBLN4

+/-

mus er selvstændig, herunder ekspression i de dorsale lemmeknopper på E11.5 og motoren kolonne af rygmarven ved E13.5 (figur 7A ). En af de store roller for DCC og netrin-1 er at sikre en korrekt midterlinjen passage af kommissurale axoner i udviklingslandene rygmarven. For at undersøge, om CBLN4 spiller en rolle i midterlinjen vejledning blev pre-krydser kommissurale axoner visualiseret ved TAG-1 immunfarvning i tværsnit af E11.5 mus (Figur 7B

)

. Ud fra følgende betragtninger kommissurale axoner kan ses nå og krydser bundpladen i vildtypemus, meget få, om nogen, kommissurale axoner nå og krydser bundpladen i

netrin-1

– /-

mus. TAG-1 immunfarvning af kommissurale axoner af

CBLN4

– /-

mus viser, at de når frem og krydser axoner ligner vildtype og der er ingen mærkbar forskel i immunfarvning mellem

netrin-1

– /-

;

CBLN4

+ /+

netrin-1

– /-

;

CBLN4

– /-

mus eller

netrin-1

+/-

;

CBLN4

+ /+

netrin-1

+/-

;

CBLN4

– /-.

Mus

A) Lac-Z reporter udtryk for CBLN4 i E11.5

CBLN4

+/-

mus (top paneler), der viser markant udtryk i lemmerne, herunder dorsale lemmer udtryk. Lac-Z reporter farvning af CBLN4 i E13.5

CBLN4

+/-

mus (nederste paneler), der viser udtryk i rygmarven motor kolonne. B) kommissurale axoner af E11.5 rygmarven visualiseret med TAG-1 immunfarvning i kombinationer af

CBLN4

og

netrin-1

genotyper. C) Repræsentative billeder og kvantificering af vandre axoner (hvide pile) i plexus brachialis af E11.5

CBLN4

– /-

mus. Tukey kontraster; **,

P

0,01; ***,

P

0,001; n er venstre og højre forben indlejret i mus; n = 4

CBLN4

+ /+

; n = 5

CBLN4

+/-

; n = 6

CBLN4

– /-

Udtrykket af CBLN4 i udviklingen lemmeknopper førte os til at vurdere bane motor neuron axoner på dette tidspunkt.. Disse axoner ekspres DCC [7] og navigere fra motoren kolonne i rygmarven til deres endelige mål innerverer musklerne i benet [30] og er kendt for at reagere på netrin-1 [31], [32].