PLoS ONE: Kombineret Drug aktion af 2-phenylimidazo [2,1-b] benzothiazolderivater på kræftceller Ifølge deres oncogen Molekylær Signatures

Abstrakt

Udviklingen af ​​målrettede molekylære behandlinger har givet bemærkelsesværdige fremskridt i det behandling af humane cancere. Men i de fleste tumorer det selektive pres udløst af anticancermidler tilskynder cancerceller til at erhverve resistensmekanismer. Frembringelsen af ​​nye rationelt designet målrettet midler, der virker på onkogene sti (er) på flere niveauer er en lovende metode til molekylære behandlinger. 2-phenylimidazo [2,1

b

] benzothiazolderivater er blevet fremhævet for deres egenskaber målrette onkogen Met receptor (RTK) signalering. I denne undersøgelse vurderede vi virkningsmekanismen af ​​en af ​​de mest aktive imidazo [2,1

b

] benzothiazol-2-ylphenyl molekyldel-baserede midler, Triflorcas, på et panel af cancerceller med distinkt funktioner. Vi viser, at Triflorcas forringer in vitro og in vivo tumorigenese af cancerceller, der bærer Met mutationer. Desuden Triflorcas hæmmer overlevelse og forankringsuafhængig vækst af cancerceller karakteriseret ved “RTK swapping” ved at interferere med PDGFRβ phosphorylering. En behersket effekt af Triflorcas på metaboliske gener korrelerer med fraværet af væsentlige bivirkninger in vivo. Mekanistisk, ud over at målrette Met, Triflorcas ændrer phosphoryleringsniveauerne af PI3K-Akt pathway, mediere onkogen afhængighed til Met, udover Retinoblastoma og nucleophosmin /B23, hvilket resulterer i ændret cellecyklusprogression og mitotisk fiasko. Vores resultater viser, hvordan den usædvanlige binding plasticitet Met aktive sted dybt strukturelt forskellige inhibitorer kan udnyttes til at generere lægemidler stand til at målrette Met onkogen afhængighed på forskellige niveauer. Desuden sygdomsorienterede NCI Anticancer Drug Screen afslørede, at Triflorcas fremkalder en unik profil af vækstinhiberende-responser på cancercellelinjer, der angiver en hidtil ukendt mekanisme af lægemiddelvirkning. Anti-tumor aktivitet fremkaldt af 2-phenylimidazo [2,1

b

] benzothiazolderivater gennem kombineret hæmning af distinkte effektorer i kræftceller afslører dem til at være lovende anticancer midler til yderligere undersøgelse.

Henvisning: Furlan A, Roux B, Lamballe F, Conti F, Issaly N, Daian F, et al. (2012) Kombineret Drug aktion af 2-phenylimidazo [2,1

b

] benzothiazolderivater på kræftceller Ifølge deres Onkogene Molekylær signaturer. PLoS ONE 7 (10): e46738. doi: 10,1371 /journal.pone.0046738

Redaktør: Olivier Gires, Ludwig-Maximilians University, Tyskland

Modtaget: 25. maj 2012; Accepteret: September 4, 2012; Udgivet: Oktober 5, 2012 |

Copyright: © Furlan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af midler fra Inca (Institut National du cancer), ARC (Association pour la recherche contre le cancer), FRM (Fondation pour la recherche médicale), FDF (Fondation de France), Fondation Bettencourt-Schueller, Marie Curie stipendier for videnoverførsel (MTKD-CT-2004 til 509.804), Protisvalor, Valorpaca, og OSEO til FM. Denne forskning er blevet udviklet inden for CM0602 COST Action “Inhibitors af angiogenese: design, syntese og biologisk udnyttelse”. AF blev støttet af Inca og ARC; NI af Valorpaca, FC af den italienske sammenslutning af Cancer Research (ARC) og ved OSEO. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har modtaget støtte fra Protisvalor. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politik om datadeling og materialer.

Introduktion

receptor (RTK) signalering har været impliceret i tumor udvikling for sin evne til at indflydelse celle skæbne gennem ændringer i vigtige regulatoriske kredsløb [1] – [3]. Som det fremgår af kræft genomiske studier, RTK signalering er en core vej ofte ændres i human cancer [4], [5]. Vi har for nylig vist relevansen af ​​signalering noder sammenhængende RTK og p53 centrale veje og virkningen af ​​at målrette sådanne knuder under tumor evolution [6], [7]. Relevansen af ​​ændrede RTK i onkogenese har trukket enorme interesse for at identificere midler, der kan fastholdende deres aktivitet og funktion. Til dato er molekylære terapier for “RTK-afhængige” kræftceller hovedsageligt baseret på anvendelsen af ​​forbindelser, der selektivt målrette onkogene RTK [1]. Men succesen af ​​disse strategier har været begrænset, da hæmning af det “primære RTK-afhængighed” udløser en selektivt tryk på cancerceller til at erhverve modstand gennem “RTK swapping” [8], [9]. Disse begrænsninger pålægge identifikation, eller den kombinerede anvendelse af midler, der ikke kun er målrettet mod RTK signalering afhængighed, men også hæmme tilpasning forårsaget af redundans i RTK signalering netværk [10].

En måde at omgå “RTK swapping “kunne være identifikation af lægemidler, der interfererer med onkogen afhængighed ved at handle på flere niveauer i afhængighed sti. Et eksempel på dette koncept er leveret af Sorafenib, en lille kemisk middel kan inhibere flere RTK’er, herunder VEGFR, PDGFRβ, Kit, FGFR1, Ret, og det intracellulære Raf kinase [11]. Den bredspektrede aktivitet Sorafenib i flere kræftmodeller sandsynligvis på grund af den brede vifte af sine mål. Ikke desto mindre er Sorafenib aktivitet i nogle typer af tumormodeller tilskrives den samtidige inhibering af RTK-drevet angiogenese og RTK nedstrøms Raf /MAPK-vejen [11]. Den generation af agenter, der er rettet mod onkogen sti (er) på flere niveauer, er ikke et simpelt spørgsmål som særskilte mål kræver en nøjagtig stof struktur og kemiske modifikationer af narkotika kan enten påvirke selektivitet (f.eks ved at målrette flere RTK), effektivitet, eller toxcicity . I modsætning til andre RTK’er er hepatocytvækstfaktor (HGF) receptor Met kendetegnet ved usædvanligt strukturel plasticitet som dets aktive sted kan vedtage særskilte Inhibitorbinding tilstande [12]. Faktisk har en bred vifte af små-molekyler blevet opdaget som Mødte inhibitorer [13], [14]. Ikke desto mindre er indsatsen fortsat afdække nye anti-Met midler til målrettede behandlinger og tilknyttede resistensmekanismer [8], [15] – [17].

For at identificere kemiske stoffer, der kan hæmme onkogen Met signalering i kræftceller, vi tidligere anvendt en Met-fokuserede celle-baseret skærm. Vi havde begrundet, at en sådan strategi vil tilbyde muligheden for at identificere forbindelser, der kan: a) fremkalder hæmmende effekt direkte på Met; b) at målrette andre væsentlige komponenter i Met signalering kaskade; c) være veltolereret på grund af begrænsede toksiske effekter på biologisk aktive koncentrationer [18] – [20]. Vi rapporteret at nye aminosyreamider indeholdende imidazo [2,1

b

] benzothiazol-2-ylphenyl delen target Met direkte og inhibere oncogen Met funktion, uden at fremkalde væsentlige bivirkninger in vitro [19]. I denne undersøgelse vi udforsket anticanceraktivitet af en af ​​de mest aktive midler vi har identificeret, Triflorcas (TFC), på et panel af cancerceller med forskellige karakteristika og undersøgt dens mekanisme af lægemiddelvirkning af en række komplementære fremgangsmåder. Vi viser, at Triflorcas henvender kræftceller enten bærer Mødte mutationer eller karakteriseret ved RTK swapping. Vi viser, at Triflorcas tåles godt in vivo og ikke signifikant ændrer ekspressionen af ​​adskillige celletoksicitet og stressgener. Biokemiske og phospho-screening array-undersøgelser viste, at Triflorcas overvejende ændrer phosphoryleringsniveauerne af PI3K /Akt pathway, som sikrer onkogen afhængighed til Met, samt retinoblastom (Rb), og nucleophosmin /B23. Disse ændringer funktionelt korrelere med ændringer i cellecyklusprogression underliggende mitotisk fiasko. Selvom Triflorcas anticancer aktivitet korrelerer med dens hæmmende effekt på Met, dens stof action mekanismer kan ikke blot begrænset til Met målrette sig selv. Den unikke evne Triflorcas at modulere flere veje dereguleret i tumorceller med afvigende Met signalering yderligere styrker udsigten til at udnytte den fleksible bindende tilstand kapacitet Met aktive site for at identificere nye midler med hæmmende egenskaber i retning af signalering mål, der er nødvendige for at udføre onkogene program. Endelig vurdering af den inhiberende-respons-profil på cancerceller gennem skærmen anticancerlægemiddel National Cancer Institute antyder, at Triflorcas er kendetegnet ved en hidtil ukendt mekanisme af lægemiddelvirkning. Bioinformatik undersøgelser viser mulige molekylære signaturer, der korrelerer med kræft følsomhed over for imidazo [2,1

b

] benzothiazol-2-ylphenyl-delen-baserede agenter.

Resultater

Triflorcas hæmmer Overlevelse og Anchorage-uafhængig vækst af humane cancerceller Carrying muterede Met

Vi først undersøgte effekten af ​​Triflorcas på to humane ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) celler der bærer Mødte mutationer: H2122 og H1437 celler, huser punktmutationer ved aminosyreresten N375S og R988C, henholdsvis [21]. Triflorcas forringet overlevelse og forankringsuafhængig vækst af H2122 og H1437, (figur 1A og B). Ingen af ​​Met-inhibitorer, der anvendes som referenceforbindelser, såsom SU11274, crizotinib, og PHA665752 forstyrrede overlevelse og in vitro tumorigenese af disse celler (figur 1A og B). I modsætning hertil alle testede inhibitorer nedsat overlevelse og forankringsuafhængig vækst af human gastrisk carcinoma GTL-16, kendetegnet ved Met-amplifikation (figur 1A og B), som tidligere rapporteret [19], [21]. Disse data antyder, at Triflorcas udøver en markant inhiberende virkning på kræftceller med Met mutationer, som ikke er følsomme over for andre Met-inhibitorer, ud over celler, der bærer Met amplifikation.

(A) Overlevelse af H2122 og GTL-16 celler blev reduceret med Triflorcas ved angivne koncentration (pM; n = 3). I modsætning hertil SU11274 (SU), crizotinib (crizo), og PHA665752 (PHA) forringet overlevelse GTL-16, men ikke af H2212-celler. Celler blev serum-udsultet i 24 timer og derefter inkuberet med forbindelserne i 48 timer. (B) Triflorcas blokeret forankringsuafhængig vækst af H1437 og GTL-16-celler på en dosisafhængig måde (n = 3). SU11274, crizotinib, og PHA665752 forringet in vitro tumorgenese af GTL-16, men ikke af H1437 celler. Værdierne er udtrykt som middelværdi ± S.E.M. ** P 0,01; *** P 0,001; Studenterrelaterede

t

test.

Triflorcas forstyrrer Met Phosphorylering, med Met Localization, og med PI3K-Akt Pathway Activation

Vi har tidligere vist, at Triflorcas forstyrrer med Met phosphorylering i levende celler og med Met-aktivering in vitro [19]. Vi har derfor undersøgt virkningerne af Triflorcas på Met i H1437 celler ved at følge Met fosforylering på to tyrosinrester placeret i sit kinase domæne, Tyr

1234 og Tyr

1235. Immuncytokemisk analyse afslørede Met phosphorylering overvejende på plasmamembranen når H1437 celler blev udsat for HGF-stimulering (figur 2A). Især fandt vi, at Triflorcas fører til ændringer i phosphoryleret Met: a) nedregulering af dets phosphoryleringsniveauerne og b) en fremherskende lokalisering i intracellulære rum (figur 2A). Behandling med chlorpromazin, et kationisk amfipatisk lægemiddel, der inhiberer clathrin endocytose, restaureret phospho-Met lokalisering på cellemembranen, hvilket viser, at Triflorcas forbedrer Met internalisering (figur 2A) Reduceret Met phosphorylering blev også observeret i proteinlysater fra H1437-celler ledsaget af reducerede Met proteinniveauer (Figur 2B). Densitometrisk analyse viste, at Met nedregulering gennem endocytose forårsager faldet i Met phosphorylering (data ikke vist). Konsekvent, fandt vi reduceret phosphorylering af Gab1, som er en umiddelbar signalering mål for Met (figur 2B).

(A) Met phosphorylering blev analyseret ved immuno-cytokemi på H1437 celler ubehandlet, behandlet med HGF, med Triflorcas (TFC; 10 uM i 24 timer) eller med Triflorcas (10 uM i 24 timer) plus chlorpromazin (Chlor, 10 ug /ml i 2 timer), efterfulgt af HGF-stimulering (20 ng /ml for 30 minutter). Triflorcas reducerede niveauerne af Met phosphorylering fremkaldt af HGF. Bemærk også, at HGF-induceret phospho-Met er lokaliseret på plasmamembran kontrolceller, det synes internaliseret i celler udsat for Triflorcas. Endocytose inhibering med chlorpromazin lægemiddel restaureret phospho-Met lokalisering på cellemembranen. Pile angiver klynge af phosphoryleret Met på plasmamembranen (40X forstørrelse). (B) HGF-induceret (20 ng /ml) phosphoryleringsniveauerne af Met, Gab1, Akt, og p70

S6K blev reduceret i H1437 celler udsat for Triflorcas. I modsætning hertil blev der ikke observeret nogen ændringer på ERK’er phosphoryleringsniveauerne. Lignende ekspressionsniveauer af total Gab1, Akt, og p70

S6K blev også fundet, hvilket indikerer, at Triflorcas forstyrret deres fosforylering snarere end med deres ekspressionsniveauerne. Western blot analyser blev udført på de samlede proteinlysater. (C) phosphorylering niveauer af Akt, p70

S6K, og S6 ribosomal protein, men ikke ERK’er, blev reduceret i GTL-16 celler udsat for Triflorcas. Actin eller tubulin proteinniveauer blev anvendt som indlæsning kontrol i alle eksperimenter (lavere paneler i B og C). (D og E) Anchorage-uafhængig vækst af H1437 (D) og GTL-16 (E) celler blev svækket i tilstedeværelse af Triflorcas (TFC), LY294002 (PI3K-inhibitor), eller A443654 (Akt-hæmmer). Værdierne er udtrykt som middelværdi ± S.E.M. ** P 0,01; *** P 0,001; Studenterrelaterede

t

test.

Den biologiske effekt af Triflorcas på celler der bærer Mødte mutationer og Met forstærkning (figur 1) [19] førte os til at vurdere fosforylering status RTK nedstrøms effektorer. Blandt pathways kræves i cancerceller med onkogent Met, er det blevet vist, at kun en delmængde af Met-aktiverede veje opretholder afhængighed af kræftceller på Met. Især Ras /ERK’er og PI3K /Akt er to veje, der overvejende sikrer afhængighed af onkogen Met [22]. Vi undersøgte derfor, om Triflorcas begrænser aktivering af disse to veje ved at følge phosphoryleringen niveau af ERK’er og Akt i H1437-celler. Der blev ikke observeret signifikante ændringer på HGF-induceret ERK fosforylering da H1437 celler blev udsat for Triflorcas (figur 2B). I modsætning hertil blev Akt phosphorylering signifikant reduceret efter Triflorcas behandling (figur 2B). Reduceret phospho-Akt blev parallel med et fald i phosphorylering niveauer af dets nedstrøms signal p70

S6K (figur 2B). Konsekvent, reducerede phosphoryleringsbegivenheder niveauer af Akt og dens downstream signaler p70

S6K og S6 ribosomale protein, men ikke ERK’er, også blev observeret i GTL-16-celler (Figur 2C). Vi bekræftede den funktionelle relevans af intakt PI3K /Akt signalering for forankringsuafhængig vækst af H1437 og GTL-16-celler ved farmakologisk at blokere dets aktivering med LY294002 (PI3K-inhibitor) eller A-443.654 (Akt inhibitor) (figur 2D, E, S1A, og 1B). Faldet af Akt phosphorylering efter Triflorcas behandling blev også observeret i de ErbB1-afhængige human brystcancer BT474 celler, hvor ErbB1 phosphoryleringsniveauerne var uændrede (figur S1c) [19]. Tilsammen indikerer disse resultater, at reduktionen af ​​PI3K /Akt pathway aktivering ved Triflorcas er ikke blot en følge af hæmningen af ​​opstrøms RTK aktivitet. Vi fandt også, at Akt aktivitet ikke er nødvendig for overlevelsen af ​​BT474-celler (Figur S1D). Disse resultater giver indsigt i BT474 celle resistens mod Triflorcas behandling ved at vise, at deres afhængighed af onkogen ErbB1 sikres af vejen (s) end PI3K /Akt. Sammen disse resultater viser, at anti-tumor aktivitet fremkaldt af Triflorcas sker gennem kombinerede resultater på forskellige effektorer involveret i RTK-drevet onkogen afhængighed.

Triflorcas svækker in vivo Tumor Vækst af humane cancerceller Carrying Met Mutation, Uden forårsager store bivirkninger

Vi har for nylig rapporteret, at Triflorcas tåles godt af primære neuroner og hepatocytter [19]. For at evaluere yderligere den potentielle terapeutiske anvendelse af denne forbindelse vurderede vi, om det også er veltolereret efter in vivo indgivelse. Triflorcas var intraperitonealt injiceret i mus i en dosis på 30 mg.kg

-1 hver dag. Som kropsvægt er en generisk indikator til dyrepsykologi påvirket, for eksempel ved metabolisme, animalsk aktivitet og spiseadfærd, blev vægten af ​​Triflorcas-behandlede mus fulgt over tid. Ingen signifikante forskelle blev fundet versus kontrol og hele behandlingen (

P

0,05, figur 3A). Vi målte også vægten af ​​hjerte, milt, nyre og lever af mus behandlet i 21 dage og blev ikke fundet forskelle mellem de to grupper (

P

0,05, figur 3B).

(A) Udviklingen i kropsvægten hos mus, behandlet intraperitonealt med enten bil eller Triflorcas (TFC; 30 mg.kg

-1 hver dag) viste ingen signifikante forskelle. Legemsvægt er udtrykt som vægt udvikling over de 21 dages behandling periode. (B) Vægten af ​​hjerte, milt, nyre og lever blev evalueret i mus dagligt injiceret med Triflorcas (30 mg.kg

-1) eller vehikel i 21 dage. Der blev ikke påvist signifikante forskelle. Værdierne er udtrykt som middelværdi ± S.E.M.

P

0,05. (C og D) Triflorcas behandling (i.p. 30 og 60 mg.kg

-1 hver anden dag) reducerede tumorvolumen (C) og vægt (D) i nøgne mus injiceret subkutant med H1437 celler. Crizotinib (50 mg.kg

-1 dagligt) ikke forringer tumorvækst. Værdier er rapporteret som boxplots og udtrykt som middelværdi ± s.e.m. *

P

0,05; Studenterrelaterede

t

test.

Vi har tidligere vist, at Triflorcas fremkalder tumorvækst inhibering af GTL-16-celler in vivo (figur S2) [19]. Vi afgøres derfor, om antitumor virkning Triflorcas observeret in vitro på H1437 celler også kan dokumenteres vivo ved hjælp xenotransplanterede nøgne mus. H1437-celler (5 x 10

6) var subkutant injiceret i nøgne mus. Efter dannelse af tumorer, blev musene behandlet med Triflorcas, crizotinib eller vehikel alene, og tumorvækst blev undersøgt under og efter behandling. Især fandt vi en reduktion i tumor volumen 58,7% og 59%, når Triflorcas blev administreret i en dosis på 30 mg.kg

-1 eller 60 mg.kg

-1 hver anden dag, henholdsvis (kontrol: 82,4 mm

3 ± 78,2; 30 mg.kg

-1 Triflorcas injektion: 34,0 ± 24,5;

P

= 0,04; 60 mg.kg

-1 Triflorcas injektion: 33,8 ± 24,2;

P

= 0,04, figur 3C). En reduktion af tumor vægt blev også observeret i Triflorcas-behandlede mus (kontrol: 147,1 mg ± 92,5; 30 mg.kg

-1 Triflorcas injektion: 79,1 ± 58,1,

P

= 0,03; 60 mg. kg

-1 Triflorcas injektion: 62,0 ± 38,9,

P

= 0,01, figur 3D). I modsætning hertil blev der ingen reduktion i tumorvækst findes i mus behandlet med crizotinib ved doser på 50 mg.kg

-1 hver dag (tumor volumen: 118,6 mm

3 ± 69,4; tumorstørrelse: 205,0 mg ± 84,8; Figur 3C og D), i overensstemmelse med tidligere undersøgelser [21]. Tilsammen disse resultater viser, at in vivo Triflorcas fremkalder tumorvækst hæmning af kræftceller med onkogen Met. Desuden fraværet af bivirkninger viser, at Triflorcas er veltolereret, når injiceret i mus ved doser, der kræves for at fremkalde sin anti-tumor effekt.

Mindre ændringer i genekspression Profil af stress og Toksicitet Pathways af Triflorcas korrelere med Lack af giftige virkninger in vivo

Som Triflorcas er veltolereret både in vitro [19], og in vivo (figur 3A og B), vi næste fulgte genekspression niveauer af en menneskelig RT-PCR-array med fokus på toksicitet og stress pathways. Ekspressionsprofilen af ​​84 gener relateret til celle stress og toksicitet blev analyseret i GTL-16-celler udsat for Triflorcas, SU11274, eller vehikel. SU11274 ændret ekspression af 39 gener i mindst 2-fold (ved forøgelse eller formindskelse dem;

P

0,05). Disse gener tilhører den apoptose /nekrose (n = 10), inflammation (n = 7), oxidativt /metabolisk stress (n = 7), varmechok (n = 6), proliferation /carcinogenese (n = 5), og vækst arrest /senescens pathways (n = 4; fig 4A og tabel S1). I modsætning hertil Triflorcas førte til en statistisk signifikant ændring i ekspression af kun 14 gener (

P

0,05). Blandt dem, 13 gener overlappede dem ændret af SU11274, og tilhørte apoptose /nekrose (n = 3), oxidativt /metabolisk stress (n = 3), og vækststandsning /senescens (n ​​= 3; Figur 4A og tabel S1) . Ingen signifikant fald af genekspression ud over 50% i forhold til kontrolceller kunne observeres. Gener, der viser over en 2-fold stigning i ekspressionsniveauerne inkluderet

TNF

(3,83 gange;

P

= 0,0008),

gdf15

(3,18 gange;

P

= 0,0007),

EGR1

(2,68 gange;

P

= 0,003), og

serpine1

(2,42 gange;

P

= 0,005). Interessant Triflorcas førte til en robust og fremherskende opregulering af cytochrom oxidase

CYP1A1

gen (611-fold;

P

= 0,0001, Figur 4A). Angivelse af

CYP1A1

genet blev også forøget med SU11274, men på væsentlige lavere niveauer (22-fold;

P

= 0,02, figur 4A). CYP1A1 er et medlem af CYP1 familien af ​​cytochrom P450 impliceret i cancer celle respons på terapeutiske midler. Western blot-analyse bekræftede opreguleringen af ​​CYP1A1 protein ved Triflorcas, som blev svækket af dets inhibitor acacetin (figur 4B) [23]. CYP1A1 opregulering af Triflorcas var uafhængig af dets virkning på Met som fandt også i celler, som i de menneskelige brystkræft BT474 celler (figur 4C), som er afhængige af ErbB1 signalering. Tilsammen udgør disse undersøgelser understreger en selektiv metabolisme aktivitetsprofil fremkaldt af Triflorcas knyttet til opregulering af en lille delmængde af stress- og toksicitet gener. Således er minimalt antal gener, der berøres af Triflorcas indikerer, at denne forbindelse fremkalder mere selektive virkning på stress og toksicitet gener sammenlignet med andre Met anticancermidler, såsom SU11274.

(A) Ekspressionsprofilen af ​​84 gener relateret til celle stress og toksicitet blev analyseret i GTL-16-celler. Cellerne blev behandlet med enten Triflorcas (sorte søjler, 3 um) eller SU11274 (grå søjler; 1 uM) i 24 timer, og genekspression blev sammenlignet med den for ubehandlede celler. Gener blev grupperet i klynger, der svarer til oxidativ /metabolisk stress, varmechok, proliferation /carcinogenese, vækststandsning /senescens, inflammation og apoptosis /nekrose signalering. Kun statistisk signifikante ændringer i genekspression er angivet (

P

0,05). Triflorcas ændret ekspression af kun 14 gener sammenlignet med ændringen af ​​39 gener induceret ved SU11274 behandling. Især er ekspressionen af ​​

CYP1A1

blev forøget 611 gange i nærværelse af Triflorcas. (B) Western blot-analyse, der viser den opregulering af CYP1A1 proteinniveauer i celler udsat for Triflorcas (3 eller 10 uM). Acacetin (ACA, 10 uM) behandling forhindrede CYP1A1 opregulering af Triflorcas (TFC). (C) CYP1A1 opregulering af Triflorcas også forekom i ErbB1-afhængige cancer BT474 celler. Gefitinib (GEF, 10 uM) og SU11274 (SU, 2 uM) blev anvendt som kontroller

Triflorcas Mekanismer Drug Action og dens virkninger på cellecyklusprogression Førende til Mitotisk Manglende

virkningerne af Triflorcas på PI3K-Akt pathway påvist ved biokemiske undersøgelser (figur 2B og C) antyder, at Triflorcas anticancer egenskaber kan være forbundet med aktiviteten på forskellige signalsystemer mål i tillæg til Met. En screening tilgang bredt anvendt til at identificere mål af en given kemisk middel er den KINOME

scan

, som gør det muligt at vurdere aktiviteten af ​​forbindelser over for et panel af kinaser gennem bindingsanalyser [24]. Triflorcas blev screenet mod 98 kinaser ved en enkelt koncentration på 10 pM efter aftale med standard protokoller. Men den lave opløselighed af Triflorcas i pufferbetingelser anvendes til denne type af skærm er begrænset, muligheden for at identificere målrettede kinaser. Vi fandt ikke desto mindre, at Triflorcas reducerer med mere end 30% den bindende konstant på kun 5 mere end 98 kinaser analyseret: Abl-1 (enten vildtype eller E255K og T315I mutant former), IKK-beta, JAK2, MKNK1, og ZAP70 (figur 5 og tabel S2). Selvom mønstret af kinaser der interagerer med Triflorcas synes meget fokuseret, skal disse resultater tages hensyn til, at en del af mål blev muligvis ikke detekteret på grund af den lave opløselighed af Triflorcas i pufferbetingelser, der anvendes til denne skærm. . For eksempel blev Met ikke identificeret trods af, at Triflorcas hæmmende aktivitet tidligere blev etableret ved hjælp af Kinexus forbindelsen profilering tjeneste [19]

Forbindelse blev screenet mod en KINOME

scan Hotel (http: //www.kinomescan.com) panel af 98 kinaser. (A) Tabellen viser de kinaser for hvilke Triflorcas reduceret mere end 30% bindingen konstant. Den ligandbindende for hver kinase (% af kontrol betingelse) er indikeret. (B) TREEspot billede af de 98 kinaser screenet med positionen af ​​Triflorcas mål: Abl vildtype, Abl E255K og Abl T315I mutantformer, IKK-beta, JAK2, MKNK1, og ZAP70. Den komplette datasæt er vist i tabel S2. TK: tyrosinkinase; TKL: tyrosinkinase lignende; STE: STE kinase; CK1: celle kinase1; AGC: PKA, PKC, PKG kinaser; CaMK: calcium calmodulin-kinase; CMGC:. CDK, MAP, GSK, CDK-lignende kinase

Derfor, for at yderligere at undersøge mekanismen for narkotika handling Triflorcas, vi anvendte en celle-baseret assay, som giver mulighed for evaluering af agentens effekter på flere onkogene signalveje i dyrkningsbetingelser kompatible med Triflorcas opløselighed og biologisk aktivitet. Phosphoryleringsniveauerne af adskillige signalmolekyler blev derfor undersøgt ved hjælp af Kinexus phosphorylerede protein screen array. Især vi sammenlignet phosphoryleringsniveauerne af 44 signalsystemer phospho-epitoper i GTL-16 celler behandlet eller ikke med Triflorcas (figur 6, S3, og Tabel S3). Overensstemmelse med vores biokemiske undersøgelser fandt vi, at phosphoryleringstilstanden af ​​flere komponenter inden PI3K /Akt pathway blev ændret i celler udsat for Triflorcas. Især blev reduceret phosphoryleringsniveauerne observeret for Akt1, mTOR /FRAP, p70

S6Kb1, og S6 ribosomal protein (figur 6A og B; røde cirkler). Interessant nok fandt vi, at Triflorcas væsentlig grad ændrer phosphoryleringsstatussen af ​​to yderligere proteiner: phosphoryleringen af ​​Rb på forskellige Ser /Thr-rester blev reduceret (figur 6A og B; blå cirkler); phosphorylering af nucleophosmin /B23, et nucleolar protein sig at være signifikant rigelige i tumorer [25], blev forøget (figur 6A og B, grønne cirkler). Western blot-analyse bekræftede ændringer i phosphoryleringstilstanden af ​​Rb og nucleophosmin /B23-proteiner efter Triflorcas behandling (figur 6C).

(A) phosphorylering status flere cellecyklusproteiner blev analyseret ved anvendelse af phospho-arrayet KPSS 10,1 (Kinexus Bioinformatik). GTL-16 celler blev behandlet med vehikel (kontrol) eller Triflorcas (TFC, 3 uM) i 72 timer (venstre og højre paneler, henholdsvis). Røde cirkler fremhæve bestanddele af Akt /mTOR /S6 pathway. Grønne og blå cirkler surround nucleophosmin /B23 og Rb phospho-epitoper, hhv. (B) Grafen viser forholdet mellem phosphoryleringsniveauerne af de angivne proteiner i celler ubehandlede versus dem udsættes for Triflorcas. (C) phosphorylering niveauer af nucleophosmin /B23 ved Ser

4 og Rb på S

780 blev forøget og nedsat henholdsvis i GTL-16 celler udsat for Triflorcas (TFC; 3 uM til 24 timer).

Da både Rb og nucleophosmin /B23 er vigtige regulatorer af cellecyklusprogression, vi næste vurderet, om disse ændringer i fosforylering tilstand blev sideløbende med ændring af cellens cyklus. Celler blev farvet med propidiumiodid og deres fordeling i forskellige cellecyklusfaser blev vurderet ved flowcytometrisk analyse. Ubehandlede GTL-16 celler blev prolifererende, som bekræftes af flowcytometri mønster (figur 7A og data ikke vist). Triflorcas behandling ændrer GTL-16 cellecyklusfordeling, med en forøgelse af G0 /G1-celle population på bekostning af S og G2 /M befolkning (figur 7A og data ikke vist). Som kontroller behandling af GTL-16 celler med enten SU11274 eller nocodazol, førte til en blokering i G0 /G1 eller G2 /M-fase, henholdsvis (data ikke vist). Således Triflorcas påvirker cellecyklusprogression af GTL-16-celler. Morfologisk analyse af celler udsat for Triflorcas viste en betydelig stigning i antallet af flerkernede celler, hvilket indikerer mitotisk svigt (figur 7B og C). I modsætning hertil blev der ikke mitotisk svigt observeret i celler behandlet med SU11274, crizotinib eller PHA665752 (Figur 7C). Tilsammen viser disse resultater, at anti-tumor-aktivitet fremkaldt af Triflorcas kan delvis konto for phosphoryleringssteder ændringer i distinkte signalsystemer mål, såsom komponenter af PI3K /Akt pathway, Rb og nucleophosmin /B23, som korrelerer med ændringer i cellecyklus progression og mitotisk svigt.

(A) graf, der viser forholdet mellem procentdelen af ​​GTL-16 celler i G0 /G1-fasen over procentdelen af ​​celler i S + G2 /M-fasen. Celler blev behandlet med Triflorcas (TFC; 3 uM) eller vehikel (CNTR) i 48 timer, derefter farvet med propidiumiodid. Værdierne er udtrykt som middelværdi ± S.E.M. *** P 0,001; Studenterrelaterede

t

test (n = 3). Procentdele af celler i G0 /G1, S, og G2 /M-faser er rapporteret i tabellen. (B) GTL-16-celler blev dyrket i nærvær af Triflorcas eller køretøj, og kerner blev visualiseret under anvendelse DAPI-farvning. Pile viser eksempel på celler med multiple kerner (40X forstørrelse). (C) Kvantificering af celler med mitotisk svigt udtrykt som procentdel af det samlede antal analyserede celler. Triflorcas (TFC; 3 eller 10 uM), men ikke SU11274 (SU; 1 uM), crizotinib (crizo; 1 uM), eller PHA665752 (PHA; 1 uM) førte til en betydelig stigning i antallet af celler med mitotisk svigt. Værdierne er udtrykt som middelværdi ± S.E.M. *** P 0,001; Studenterrelaterede

t

test.

Triflorcas forringer overlevelse og Anchorage-uafhængig Vækst af humane cancerceller præget af RTK Bytte

En væsentlig begrænsning af molekylære behandlinger ved hjælp af agenter målretning distinkte RTK’er er medikamentresistens mekanisme, som kan være enten konstitutiv eller erhvervet efter behandling. I denne sammenhæng er det blevet vist, at Met, kan ErbBs og PDGFRs gensidigt erstatte hinanden for at opretholde aktiviteten af ​​RTK-drevne onkogene pathways [9], [26] – [29].