PLoS ONE: Undersøgelse DNA Indbinding og Konformationel Variation i temperaturfølsomme p53 Cancer Mutanter Brug QM-MM Simulations

Abstrakt

TP53 genet findes at være muteret i 50% af alle kræftformer. P53-proteinet, et produkt fra TP53 gen, er en multi-domæne-protein. Den består af en kerne DNA bindende domæne (DBD), som er ansvarlig for dens binding og transkription af nedstrøms målgener. Mutationerne i p53-protein er ansvarlig for at skabe kræft betingelser og har vist sig at være opstået ved en høj frekvens i DBD region af p53. Nogle af disse mutationer er også kendt for at være temperaturfølsomme (

ts

) i naturen. De er kendt for at udvise delvis eller stærk binding med DNA i temperaturområdet (298-306 K). Henviser til, at 310 K og over de viser fuldstændig tab i binding. Vi har analyseret ændringer i binding og konformationel opførsel ved 300 K og 310 K for tre af

ts

-mutants

nemlig

., V143A, R249S og R175H. QM-MM simuleringer blev udført på vildtype og ovennævnte

ts

-mutants i 30 ns hver. Den optimale estimat af frie bindingsenergi for et bestemt antal grænseflade hydrogenbindinger beregnedes under anvendelse af maksimal sandsynlighed-metoden som beskrevet af Chodera et. al (2007). Denne parameter er blevet observeret at være i stand til at efterligne bindingsaffiniteten af ​​p53

ts

-mutants ved 300 K og 310 K. Således korrelationen mellem MM-GBSA frie bindingsenergi og hydrogenbindinger dannes ved grænsefladen restkoncentrationer mellem p53 og DNA har afsløret temperaturafhængige karakter af disse mutanter. Rolle vigtigste kæde dihedrals blev opnået ved at udføre to-plans principal komponent analyse (PCA). Denne analyse, tyder på, at de konformationelle variationer i de vigtigste kæde dihedrals (

φ

og

ψ

) af p53

ts

-mutants kan have forårsaget reduktion af den samlede stabilitet af proteinet. Opløsningsmidlet eksponering af sidekæderne af grænsefladeresterne fandtes at hæmme bindingen af ​​p53 til DNA. Opløsningsmiddel Tilgængelig Surface Area (SASA) også vist sig at være en afgørende egenskab at skelne konformerne opnået ved 300 K og 310 K for tre

ts

-mutants fra vildtype ved 300 K.

Henvisning: Koulgi S, Achalere A, Sonavane U, Joshi R (2015) Undersøgelse DNA Indbinding og Konformationel variation i temperaturfølsomme p53 Cancer Mutanter Brug QM-mM Simuleringer. PLoS ONE 10 (11): e0143065. doi: 10,1371 /journal.pone.0143065

Redaktør: Freddie Salsbury Jr, Wake Forest University, UNITED STATES

Modtaget: Juli 24, 2015; Accepteret: 30 oktober 2015; Udgivet: November 18, 2015

Copyright: © 2015 Koulgi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte informationsfiler

finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Indledning

p53 pathway spiller en afgørende rolle for effektiv tumor suppression som aktiverer gener som reaktion på cellulært stress [1, 2]. Mutationer i p53 dog hindrer denne vej ved at kompromittere p53 funktionelle aktivitet [3]. I næsten 50% af humane cancere mutationer observeret i p53-proteinet [4, 5], [6]. Størstedelen af ​​disse mutationer findes i sekvensen DNA binding core (DBD) af p53 [7-10]. Disse mutationer er kendt for at påvirke den termodynamiske stabilitet af DBD og hele proteinet samt. Krystalstrukturen af ​​p53 viser, at en stor

β

sandwich tilvejebringer et stillads for en bevaret DBD region. Dette DBD region består af en løkke-sheet-helix motiv og to store løkker tøjret ved en zinkion (Fig 1A) [11]. Det DNA-bindende aktivitet af p53 involverer associering af zinkion, der er kendt for at danne et tetraedrisk koordination kompleks med CYS 176, CYS 238, CYS 242 og HIS 179 rester i proteinet. Zinkionen har en vigtig rolle i stabiliseringen løkkerne i forbindelse med sin tetraedrisk kompleks og korrekte binding af p53 til minor groove i den specifikke DNA i intakte celler [12, 13]. Selv om de fleste af resterne i DNA-bindende domæne af p53 er stærkt modtagelige for mutationer, der er syv hot spots, hvor mutationer forekommer ved en meget høj frekvens [14-19]. Forståelse af strukturelle og funktionelle konsekvens af disse mutationer har været af stor interesse i kræft undersøgelser [14], [20].

Da halvdelen af ​​de menneskelige kræftformer er forbundet med mutationer i p53, fremtidig kræft terapeutisk strategier bliver målrettet til lægemidler, der stabiliserer mutant p53 kernedomænet [10]. Dog har mange eksperimentelle undersøgelser på varme spot mutanter afsløret deres temperaturafhængighed for DNA bindende affinitet [21-23]. I de sidste to årtier har været fokuseret omfattende eksperimentelle indsats for at forstå den temperaturfølsomme (

ts

) arten af ​​forskellige p53 mutanter og deres konformationel mekanisme [21-24] [25, 26]. Den første detaljerede eksperimentel undersøgelse på

ts

p53 mutanter rapporteret af Zhang et. al. og Friedlander et. al. har forklaret deres DNA binding på 310 K [21, 22]. De bemærkede, at ved 298 K

ts

-mutants viser bindende evne, som bliver ødelagt irreversibelt ved opvarmning til 310 K [22]. Med disse forsøg var det klart, at de hot spot p53 mutanter V143A, R248Q, R249S, R273H undtagen R175H var stand til at binde til DNA ved sub-fysiologiske temperaturområde (298-306 K) og mister deres bindende helt 310 K. Bindingen stabilitets- og konformationelle tilstande af disse

ts

p53 mutanter er også blevet undersøgt ved binding af monoklonale antistoffer som PAB 1620 og PAB 1801 [21, 22]. Ligeledes en af ​​de værker af Bullock et. al. viste, at anvendelsen af ​​differentiel scanningskalorimetri eller spektroskopi fører til irreversibel denaturering af p53 mutant kernedomæne med temperaturændring [23]. Forsøg med p53 mutanter ved forskellige temperaturområder har fundet at genvinde en vis grad af transaktivering når den udtrykkes ved reducerede temperaturer [21, 24]. På grundlag af temperaturafhængigt kvantitativ foldning af p53 rester og DNA bindingsundersøgelser, er p53 mutanter blevet klassificeret i forskellige klasser [25]. Omfattende arbejde Shiraishi et. al. viste temperaturafhængige intra-molekylære mekanisme af omkring 2000 missense-mutanter. Den omfattede også den transaktiveringsfunktion undersøgelse på 303 K og 310 K [26]. Delvist inaktive temperaturafhængig p53 mutanter er blevet rapporteret til at optræde reaktivering mekanisme, amifostin i gær [27]. Nylige eksperimenter på lobular brystcancerceller har afsløret temperaturfølsomme funktionelle aktivitet af p53 mutanter og der rolle i klonal evolutionær sti [28].

På trods af dyb eksperimentel observation på DNA-bindingsaktivitet af

ts

-mutants af p53 meget få teoretiske og beregningsmæssige undersøgelser er blevet fokuseret på at forstå dette fænomen. Molekylær dynamik simulering er en aktuel tilstand af kunst metode til at undersøge de snørklede i struktur-funktionelle relationer biomolekyler. Det supplerer også de eksperimentelle observationer ved at give indsigt i atomare niveau interaktioner. I nyere tid er der rapporteret nogle analyse ved hjælp af molekylære simuleringer for at undersøge temperaturfølsomme adfærd p53 kræft mutanter. Tan og kolleger analyserede missense mutation af DBD på 310 K baseret på DBD stabilitet korrelation med sekvens struktur og molekylære kontakter i dem [29]. En omfattende stabilitet korrelation blev også foreslået baseret på kliniske og funktionelle data [29]. For nylig den fænotypiske effekt af ikke-synonyme enkelt nukleotid polymorfier i TP53 gen er blevet undersøgt ved hjælp af MD simuleringer på mutant og WT p53 proteiner [30]. På den anden side MD simuleringer på R248Q mutant har afsløret temperaturen følsomme karakter af denne mutant på DNA bindende interaktion og dens dynamiske opførsel [31]. Men der er behov for at undersøge dybere for at pin pege strukturen funktionelle relationer

ts

-mutants. Som et forsøg på dette papir præsenterer QM-MM simulering undersøgelse om temperatur afhængige p53 mutanter. Zink koordinerede kompleks er meget vigtigt for DNA binding af p53 som forklaret tidligere [12, 13]. Det er svært at opretholde denne koordinering kompleks i klassiske MD simuleringer. Derfor, i mange af de tidligere simulation undersøgelser af p53, forskellige strategier som dummy atom, bundet og modificeret kraftfelt fremgangsmåde er blevet anvendt til opretholdelse af zink koordinerede kompleks [32-34]. Ligeledes i den foreliggende undersøgelse blev der gjort et forsøg på at bevare denne komplekse ved at behandle den med kvantemekanik (QM) i stedet anvende eventuelle tvungne begrænsninger. Udførelse QM om et så vigtigt funktionel del af proteinet vil hjælpe med at efterligne den faktiske biologiske adfærd [35]. Anvendelsen af ​​QM-MM tilgang til at opretholde zink koordinerede kompleks blev inkorporeret i en af ​​vores tidligere undersøgelser af p53 mutanter [36]. Derfor opretholde zink koordinering komplekset var den eneste hensigt at indføre kvante behandling.

Formålet med dette oplæg er at give et indblik i de konformationelle variationer og DNA-bindende egenskaber af

ts

p53 varianter. Tre kendte

ts

-mutants

nemlig

., V143A, R249S og R175H er blevet studeret ved hjælp af QM-MM simuleringer. Temperaturen følsomme karakter er blevet undersøgt ved to temperaturer

nemlig

., 300 K (stuetemperatur) og 310 K (fysiologisk temperatur).

V143A, R249S og R175H er strukturelle mutanter og er kendt at fordreje den konformationelle stabilitet af p53-DBD. V143A ligger i

β

-sandwich region af løkken-sheet-helix motiv af p53-DBD, som er ansvarlig for major groove DNA-binding (Fig 1B). Denne

ts

-mutant er kendt for at skabe hulrum i den hydrofobe kerne, dannet på grund af den

β

-sandwich. Det også drastisk destabiliserer p53 kerne domæne ved en forskel på 4 kcal /mol [14]. V143A er en

ts

-mutant binder bedre end vildtype p53 ved 300 K. Men denne bindingsevne er helt fraværende ved 310 K [21].

R249S ligger på det DNA-bindende overflade, er sidekæden af ​​arginin 249 involveret i at stabilisere loop L3, som er en del af minor groove-DNA-bindende domæne (fig 1B). Denne arginin på få erstattet af serin fører til en ikke-nativ konformation af loop L3, som yderligere påvirker DNA-binding. R249S

ts

-mutant er kendt for at udvise en delvis binding til DNA ved 300 K det samme er helt afskaffet ved 310 K [22].

R175H ligger i nærheden af ​​zink ion tetrahedrale kompleks , som er ansvarlig for minor groove-binding sammen med to store sløjfer L2 og L3 (figur 1B). Det antages, at dette

ts

-mutant forstyrrer zink bindende region. Minimal mængde af strukturelle studier er tilgængelige for dette

ts

-mutant. Dens temperatur afhængig karakter viser, at ved 300 K er der reduceret binding til DNA, som senere går tabt ved 310 K. grundig forståelse af temperaturafhængige karakter af disse mutanter kræver omfattende konformationel analyse. Derfor nærværende tekst behandles de strukturelle og DNA-bindende variationer forekommer i disse tre

ts

-mutants

nemlig

., V143A, R249S og R175H.

Metoder

System Forberedelse

koordinaterne til start struktur blev udvalgt fra kæden B og hele dobbeltstrenget DNA af FBF ID 1TSR [11]. Hver kræft mutant er udarbejdet ved at betragte denne struktur som reference ved hjælp af

xleap

modul AmberTools 1.5 [37]. Zinkionen var til stede i en tetraedrisk koordination kompleks med CYS 176, CYS 238, CYS 242 og HIS 179. binding afstand og vinkel information til tetraedriske kompleks blev opnået fra arbejde rapporteret af Lu et al. i år 2007 [32]. Hele p53-DNA-zinkkompleks blev oprindeligt neutraliseret ved tilsætning Na + -ioner efterfulgt af eksplicit solvatisering under anvendelse af TIP3P vand model [37]. Solvatiseringen blev udført inde i en oktaeder, den mindste afstand mellem det opløste stof (p53-DNA kompleks) og kanten af ​​simuleringen kassen var 12

Å

. Topologi og koordinater for alle p53 varianter blev dannet ved anvendelse af Amber FF03 kraftfeltet [37]. Systemet størrelse for hver af p53 varianter var ca. 63300 atomer.

QM-MM simuleringer

I hver af de opløste p53-DNA-system, blev zink koordinering kompleks tilbageholdt i ikke-bundne form ved hjælp af kvantemekaniske (QM) metode. Resten af ​​simuleringen system var behandlet ved anvendelse af molekylære mekanik (MM) tilgang. Derfor hver minimering, temperatur ramping, ækvilibreringstider og produktion køre protokoller var QM-MM simuleringer. Den PM3 metoden [38] blev udtaget til QM-regionen henviser til, at Amber FF03 kraftfelt blev anvendt på MM-regionen [37]. Det overordnede ansvar for QM-regionen blev anset for at være to tillægge afgiften på zink-ion. Obligationerne indeholder brintatomer i QM og MM-regionen blev hæmmet ved hjælp af SHAKE algoritme [39]. Den kanoniske ensemble, NVT blev påført, hvor antallet af atomer, kassevolumen og temperaturen af ​​hver af systemet blev opretholdt under hele simuleringen [40]. Den QM-MM-interface blev behandlet i henhold til kæden atom tilgang med de foruddefinerede standardparametre [41-43]. Simuleringerne blev udført på et tidspunkt trin 2 fs hjælp Langevin dynamik og en kollision frekvens på 0,1 ps

-1 [40]. Det periodiske randbetingelse (PBC) blev påført for at udføre de konstant volumen dynamik. Den (PME) metode Partikel Mesh Ewald var ansat med en ikke-bundet cut-off på 12

Å

. Minimering blev udført i to trin. I første omgang blev opløsningsmidlet minimeres ved hjælp af den stejleste nedkørsel metode til 20000 skridt. Efterfulgt af, idet p53-DNA-Zn-komplekset frigivet til minimering i de næste 50000 trin. Simuleringen protokol var identisk for alle p53-varianter indtil dette trin. Men som simuleringerne blev udført ved to forskellige temperaturer

nemlig

., 300 K og 310 K, temperaturen rampe blev udført for 40 ps hver for at opnå disse temperaturer, hhv. En ligevægt for 2 ns og en produktion køre i 30 ns hver, blev udført for alle de p53 varianter ved 300 K og 310 K. Amber 10 simulation pakken blev brugt til alle de simuleringer. Samlet seks QM-MM simuleringer blev udført bestående af vildtype p53 ved 310 K, V143A ved 300 K og 310 K, R249S ved 310 K og R175H ved 300 K og 310 K. Dataene for WT og R249S ved 300 K blev opnået fra vores tidligere arbejde [36].

Disse simuleringer blev yderligere analyseret ved hjælp af forskellige moduler af AmberTools 1.5 [44]. Den cpptraj og MMGBSA modul af AmberTools 1.5 blev anvendt til at beregne hydrogenbindinger og gratis energi parametre for simuleringerne. Et værktøj opkaldt GeoPCA, blev anvendt til at udføre to-plans PCA [45]. PCA er en multivariat statistisk teknik, der repræsenterer en række korrelerede variabler som ortogonale hovedkomponenter. Disse hovedkomponenter hjælpe med at analysere variation til stede i en given data. PCA viser sig at være et meget nyttigt værktøj til at undersøge de forskellige typer af lokale bevægelser, som er ansvarlige for konformationelle ændringer i de simulerede proteiner. Endvidere blev opløsningsmidlet tilgængelige overfladeareal (SASA) beregnet ved hjælp af programmet NACCESS [46].

Resultater og Diskussion

Effekt på DNA binding af p53

ts

-mutants

DNA-bindende evne af alle p53 varianter blev estimeret ved at beregne ændringen i frie bindingsenergi, og antallet af hydrogenbindinger (hbonds) dannet af grænsefladeresterne mellem p53 og DNA. Den frie energi-værdier blev beregnet under anvendelse af MMPBSA modul af AmberTools 1.5 [44]. Ændringen i fri energi blev beregnet som følger: (1) (2) AE

gas

, (

dk

,

rec

,

lig

) er den molekylære mekanik energi og AG

sol

(

dk

,

rec

,

Lig

) er solvatisering energi beregnet ved Generaliseret Born (GB) solvatisering model for komplekse, receptor og ligand henholdsvis. Disse to udtryk bidrager til enthalpi del af beregningen fri energi. Den TΔ S

(

dk

,

rec

,

Lig

) sigt viser entropiske bidrag til den beregnede fri energi. Entropi beregning er stærkt beregne intensiv, blev sprunget over gratis energiberegninger. Derfor blev følgende ligning anvendt i den foreliggende arbejde, (3) Den MM-GBSA fri energi med og uden entropiske bidrag blev beregnet for de sidste 10 ns af simuleringerne (S1 og S2 Figner). De frie energi værdier observeret en lignende tendens i begge tilfælde. Derfor TΔ S

(

dk

,

rec

,

Lig

), der tilskriver entropi del af fri energi er ikke medtaget i de frie energi vilkår beregnet. Disse frie energiværdier blev yderligere optimeret til at opnå en optimal estimat af fri energi for bestemt antal hbonds mellem p53 og DNA under anvendelse af maksimal sandsynlighed-metoden [47]. Ligningen bruges til at udlede den optimale estimat af fri energi var som følger, (4) (5) er den optimale estimat af ΔΔ

G

binde Hotel (

opt

ΔΔ

G

binder

) til k antal grænseflade hbonds mellem p53 og DNA [47]. Betragtninger,

x

n

er Δ Δ G

binde

for snapshot nummer n og

δ

2

x

k

er et mål for usikkerheden observeret i de frie energi værdier

x

n

med k antal grænseflade hbonds (eq 5).

antallet af hbonds blev beregnet under anvendelse af cpptraj modul af AmberTools 1.5 [44]. Cut-off for donor-acceptor obligation afstand og vinkel blev anset for at være 3

Å

og 135 ° hhv. De hbonds dannet af de otte grænseflade rester

nemlig

., LYS 120, SER 241, ARG 248, ARG 273, ALA 276, CYS 277, ARG 280 og ARG 283 med DNA blev betragtet som interface hbonds for alle p53-varianter. Også, i et af vores tidligere værker blev en lignende form for tilgang anvendes baseret på MM-GBSA frie bindingsenergi og hbonds dannet mellem p53 og DNA. Denne sammenligning havde åbenbaret forskellen i DNA-bindende egenskab af vildtype, kræft og redning mutanter af p53 [36]. Tilsvarende analyse udført i dette dokument repræsenterer optimal estimat af MM-GBSA frie bindingsenergi (

opt

ΔΔ

G

binder

) specifikke for de hydrogenbindinger dannes af grænsefladerester.

opt

ΔΔ

G

binde

blev beregnet for vildtype (WT) og alle tre

ts

-mutants af p53 ved 300 K og 310 K. hele 30 ns bane blev anset for denne analyse. Sammenligningen af ​​

ts

-mutants med WT ved 300 K og 310 K er blevet afbildet i figur 2. Fig 2A og 2D viser resultaterne for V143A og WT ved 300 K og 310 K hhv. Det blev observeret, at ved 300 K, den frie energi-værdier var lavere for V143A i sammenligning med WT, hvilket tyder bedre binding i V143A (Fig 2A). På den anden side blev det observeret, at svække ved 310 K (Fig 2D). Fig 2B og 2E viser den fri energi af binding af R249S og WT ved 300 K og 310 K hhv. Det blev klart observeret, at ved begge temperaturerne de frie energi værdier for R249S var højere end den WT. Fig 2C og 2F viser sammenligningen mellem R175H og WT ved 300 K og 310 K hhv. Her igen R175H havde højere fri energi værdier end WT ved begge temperaturer.

Disse observationer opnået fra beregning af

opt

ΔΔ

G

binder

på grundlag af hydrogenbinding, viser, at alle de tre

ts

-mutants miste deres bindingsaffinitet ved 310 K i forhold til WT. Men V143A shows forbedret binding end WT ved 300 K, der er også blevet rapporteret af eksperimenter på

ts

p53 mutanter

nemlig

., Friedlander et. al (1996), Bullock et. al (1997, 2000) og Zhang et. al. (1994) [22], [23], [25], [21]. Disse eksperimentelle undersøgelser tyder også på, at R249S og R175H binder svagt ved 300 K, men aktiviteten er helt tabt på 310 K. Således de opnåede resultater for R249S og R175H fra simuleringer undersøgelse diskuteret i dette papir, er enige om at observationerne rapporteret i disse eksperimentelle undersøgelser [22], [23], [25], [21].

for at tilføje understøttelse til disse observationer en grund på MM-GBSA afledte ΔΔ

G

binder

mod tiden er givet i de supplerende data som S3 fig. En temperatur sammenligning af disse

ts

-mutants er også blevet tilvejebragt i de supplerende data som S4 Fig. Disse resultater supplerer også de ovennævnte eksperimentelle resultater rapporteres på

ts

-mutants af p53.

opt

ΔΔ

G

binder

være en statistisk beregnet parameter skulle vise sig at være mere markant med stort antal observationer. Derfor blev en identisk simulering for WT 300 K udført for 30 ns og snapshots blev taget til fange hver 10 ps som øger datapunkterne til 6000 snapshots. S5 Figur viser sammenligningen for

opt

ΔΔ

G

binde

for WT ved 300 K med 3000 (Run1) og 6000 (Run1 + Run2) snapshots hhv.

Temperatur følsomme mutanter stabilitets- og vigtigste kæde dihedrals

ts

-mutants af p53 er kendt for at fremkalde tab i DNA binding samt strukturel forvrængning af p53 DBD. For at give et indblik i de strukturelle ændringer, der sker på grund af mutationer de vigtigste kæde dihedrals

φ

og

ψ

blev udsat for Principal Component Analysis (PCA). PCA viser sig at være et meget nyttigt værktøj til at undersøge de forskellige typer af lokale bevægelser, som er ansvarlige for konformationelle ændringer i de simulerede proteiner. De vigtigste kæde dihedrals (

φ

og

ψ

) blev anvendt som reaktion koordinater og PCA blev udført ved hjælp GeoPCA [45]. Forstanderen Komponent 1 (PC1) og 2 (PC2) blev beregnet for de mutanter og vildtype. De grunde til PC2 mod PC1 er stillet i de supplerende data fra S6-S9 fig. S6 og S7 Fig viser fordelingen af ​​konformerer baseret på PC1 og PC2 af

φ

dihedrals ved 300 K og 310 K hhv. Tilsvarende S8 og S9 Figurerne viser fordelingen af ​​konformerer baseret på PC1 og PC2 af

ψ

dihedrals ved 300 K og 310 K hhv. Variansen observeret i PC1 og PC2 for både

φ

og

ψ

vinkler i alle sagerne har fået i S10 Fig. Det kunne ses, at både

φ

og

ψ

vinkler viste mere variation i PC2 værdier ved begge temperaturer.

φ

dihedrals viste ændring i PC2 med stigning i temperaturen for WT og alle de tre p53-mutanter. Men for

ψ

dihedrals bortset WT alle de tre

ts

mutanter viste ingen signifikant variation med hensyn til temperatur. For at observere konsekvenserne af denne ændring i

φ

og

ψ

dihedrals på den overordnede stabilitet af proteinet, den Δ

G

protein

blev afbildet mod PC2 værdier for WT og hver af p53

ts

-mutants (fig 3 og 4). Figurerne 3 og 4 forklare befolkningen fordeling af afarter baseret på PC2 af

φ

og

ψ

vinkler wrt den fri energi af det samlede protein (Δ G

protein

) hhv. Analysen blev udført på snapshots opfanget ved hver 10 ps i de sidste 10 ns af simulationen. Fig 3A og 3D viser fordelingen for WT og V143A ved 300 K og 310 K hhv. Fordelingen af ​​befolkningen i V143A shows overlapper med WT ved begge temperaturer. WT og V143A opnå cis kropsbygning ved 300 K, som yderligere gradvist driver mod trans region ved 310 K. Men Δ G

protein

værdier forøget ved 310 K for dem begge i forhold til 300 K. fig 3B og 3E beskriver fordelingen for R249S og WT ved 300 K og 310 K hhv. Ved 300 K, WT opnår cis og R249S er spredt i trans region med højere fri energi værdier. Ved 310 K, R249S tendens til at befolke cis-formen med fri energi højere end WT på 310 K og selv ved 300 K. Fig 3C og 3F afspejler adfærd R175H i forhold til WT ved 300 K og 310 K hhv. Befolkningen synes at være stærkt spredt langs hele spektret af

φ

med fri energi værdier højere end WT ved begge temperaturer.

Disse observationer tyder på, at for V143A den konformationer tendens til at befolke den samme region med lignende fri energi værdier som ses i WT ved 300 K og 310 K. Derved udlede tilsvarende konformationer opnås ved

φ

vinkler i V143A og WT ved begge temperaturer. Men for R249S

Ø

vinkler kunne med held angiver geometrisk modsatte konformationer opnået ved 300 K og 310 K i sammenligning med WT og selvstændige. Hvori, ved 310 K den frie energi værdier var højere end den for WT med en forskel på 1000 kcal /mol. Stivheden vundet af de

Ø

vinkler i R249S ved 310 K kan have ført til stigningen i fri energi, der udleder tab af stabilitet. R175H viste ingen særlig dominerende kropsbygning vundet af de

Ø

vinkler som befolkningen syntes at være helt spredt. , Ved begge temperaturer R175H syntes imidlertid at være mindre stabil end WT i form af fri energi af p53 molekylet. Derfor figur 3 udleder, der øger i temperaturen inducerer ændringer i

φ

vinkler for WT, V143A, R249S og R175H hvilket igen reducerer deres stabilitet.

Fig 4A og 4D viser

ψ

vinkler fordeling for WT og V143A ved 300 K og 310 K mod Δ G

protein

. De konformationer i både WT og V143A synes at være spredt og spænder lignende gratis energi niveauer. ved 310 K WT tendens imidlertid at befolke cis region mens V143A fortsat spredt. De frie energi niveau på 310 K var ens for både V143A og WT og højere end det, der blev observeret ved 300 K. Fig 4B og 4E taler om konformationel fordeling af WT og R249S ved 300 K og 310 K hhv. Ved 300 K, er befolkningen spredt ud over hele området af

ψ

men de gratis energi værdier er højere i forhold til WT. Ved 310 K, blev spredt adfærd R249S opbevares på endnu højere fri energi niveauer i forhold til sig selv og WT. Fig 4C og 4F beskriver befolkningens fordeling for R175H ved 300 K og 310 K hhv. Ved 300 K, blev konformerne for R175H spredt over hele området fra -180 ° til 180 °, og ved højere fri energi niveau i forhold til WT. Ved 310 K, konformerne tendens til at klynge ind cis- og trans-regioner for R175H selvom de gratis energi er højere end den WT. Samlet set for alle de tre mutanter

ψ

vinkler førte til konformationer, der øger den frie energi af p53-molekylet på 310 K i forhold til WT og sig selv ved 300 K.

I tilfælde af WT både

φ

og

ψ

vinkler viste forandringer med stigning i temperaturen. V143A, R249S og R175H viste ændringer i

φ

vinkel fordeling med stigning i fri energi værdier ved 200 kcal /mol ved 310 K i forhold til 300 K. Men i tilfælde af alle tre

ts

-mutants

ψ

vinkel fordelingen var ens ved begge temperaturer, men de gratis energi værdier viste sig at være højere med 200 kcal /mol ved 310 K. Disse fordelinger af konformerer baseret på fri energi af p53-molekylet og PC2 af de vigtigste kæde dihedrals tyder på, at enten

φ

eller

ψ

eller begge kan være ansvarlige for ændringer i dens stabilitet. Derfor kan den konformationelle fordeling baseret på vigtigste kæde dihedrals og fri energi af p53-molekylet med til at udlede, at temperaturen inducerer ændring i den overordnede struktur af p53. Denne tilpasning af forskellige konformationer ved højere temperatur inducerer tab af stabilitet i V143A, R249S og R175H i form af fri energi.

Temperatur effekt på interface-rester af

ts

-mutants

DBD af p53 er kendt for at have to adskilte områder, der bidrager i binding til DNA

viz

., loop-sheet-helix motiv og Loops 2, 3 med zink koordinerede kompleks. Disse to regioner består af otte vigtige rester

nemlig

., LYS 120, SER 241, ARG 248, ARG 273, ALA 276, CYS 277, ARG 280 og ARG 283, som spiller en afgørende rolle i at danne p53-DNA interaktioner. For at kontrollere temperaturen effekt på deres deltagelse i DNA-bindingsaktivitet blev sidekæden opløsningsmiddeltilgængelig overfladeareal (SASA) og fri energi bidrag i binding beregnet for disse otte rester. Denne analyse blev udført for de sidste 10 ns af simuleringerne.

Opløsningsmiddel Eksponering af interface-rester.

Der har været forskellige undersøgelser rapporteret om modeller af forskellige protein-systemer som diskuterer eksponeringen opløsningsmiddel som én af de afgørende faktorer i opretholdelsen af ​​stabiliteten af ​​proteinet [25, 48, 49]. Især i tilfælde af p53 enhver ændring i sin eksponering opløsningsmiddel er kendt for at spille en vigtig rolle i fastlæggelsen stabilitet dens mutanter [25]. Men eksponering af nedgravede rester tendens til at destabilisere proteinet mere i forhold til dem, der ligger på overfladen af ​​proteinet. For at undersøge disse eksperimentelle resultater blev der sidekæden SASA for de otte grænsefladeresterne beregnet.

Fig 5 beskriver den gennemsnitlige sidekæde SASA for alle otte grænsefladeresterne ved 300 K (Fig 5A) og 310 K (fig 5B). De fejl barer i disse to tal angiver standardafvigelsesværdier. Adfærd sidekæde SASA for hver af de otte interface-rester w.r.t tid for alle p53-varianter på 300 og 310 K er blevet leveret i supplerende data (S11-S18 Figner). Overvejer WT ved 300 K så nær nativ konformation af p53, har sammenligningen af ​​andre p53 varianter blevet diskuteret her. Forskellen i SASA værdierne er blevet rapporteret i parenteser. Når denne forskel i SASA var større end standardafvigelsen af ​​p53 variant det blev anset for at være statistisk signifikant. V143A havde fire ud af otte rester

nemlig

., LYS 120, ARG 273, CYS 277 og ARG 280 med mere udsatte (10-30

Å

2) sidekæder på 300 K og 310 K end WT 300 K. Ud af disse fire bortset ARG 273 resten tre viste statistisk signifikant SASA forskel. Opløsningsmidlet eksponering for ARG 248 ved 300 K var mindre end WT på 300K (20

Å

2), som viste sig at stige på 310 K. Men denne stigning i SASA for ARG 248 ved 310 K blev ledsaget af store standardafvigelse (ca. 20

Å

2). De resterende tre rester

nemlig

., SER 241, ALA 276 og CYS 277 afveg lidt (mindre end 15

Å

2) sammenlignet med WT 300 K. R249S havde seks al. al. al.