PLoS ONE: Benzo [a] pyren, aflatoxin B1 og Acetaldehyd mutationsmønstre i TP53 Gene Brug en funktionel analyse: Relevans Human Cancer Ætiologi

Abstrakt

Mutationer i

TP53

gen er de mest almindelige ændringer i humane tumorer.

TP53

mutationsmønstre undertiden har været knyttet til kræftfremkaldende eksponering. I hepatocellulært carcinom, en specifik G er T transversion på codon 249 klassisk beskrevet som et fingeraftryk af aflatoksin B

1 eksponering. Ligeledes G T transversioner i codon 157 og 158 har været relateret til eksponering tobak i humane lungekræft. Men kontroverser stadig om fortolkningen af ​​

TP53

mutational mønster i tumorer som fingeraftryk af genotoxin eksponering. Ved hjælp af en funktionel analyse, den Funktionel analyse af Separeret Alleler i gær (FASAY) Den foreliggende undersøgelse viser mutations mønster af

TP53

i normale humane fibroblaster efter

in vitro

udsættelse for vel- kendte kræftfremkaldende stoffer: benzo

[a]

pyren, aflatoksin B

1 og acetaldehyd. Disse

in vitro

mønstre af mutationer blev derefter sammenlignet med dem, der findes i humane tumorer ved hjælp af IARC database over

TP53

mutationer. Resultaterne viser, at

TP53

mutationsmønstre fundet i humane tumorer kan kun delvist tilskrives genotoxin eksponering. Et komplekst samspil mellem den funktionelle virkning af mutationerne på p53 fænotype og kræft naturhistorie kan påvirke disse mønstre. Men vores resultater støtter kraftigt, at genotoxins eksponering spiller en stor rolle i ætiologien af ​​de betragtes kræftformer

Henvisning:. Paget V, Lechevrel M, André V, Le Goff J, Pottier D, Billet S, et al . (2012) Benzo

[a]

pyren, aflatoxin B

1 og Acetaldehyd mutationsmønstre i

TP53

Gene Ved hjælp af en funktionel analyse: Relevans Human Cancer Ætiologi. PLoS ONE 7 (2): e30921. doi: 10,1371 /journal.pone.0030921

Redaktør: Andy T. Y. Lau, Shantou University Medical College, Kina

Modtaget: 26 august, 2011; Accepteret: December 26, 2011; Publiceret: 3 Feb 2012

Copyright: © 2012 Paget et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Agence Française de sécurité sanitaire de l’Environnement et du travail (AFSSET; konventionen nr EST-2007-48), den Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche (konvention nr 16.848-2005), den Région Nord-Pas de Calais (konvention nr 08.070.005) og Ligue Nationale Contre le Cancer, Comité de l’Orne. Unite de Chimie Environnementale ET Interaktioner sur le Vivant (UCEIV-EA 4492) arbejder i partnerskab med Institut de Recherches en Environnement Industriel (Ireni), som er finansieret af Région Nord-Pas de Calais, den Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche, og europæiske fonde (FEDER). V.P. modtog en post-ph.d.-stipendium fra Région Nord-Pas de Calais. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Somatiske mutationer er en vigtig begivenhed i carcinogenese og det er nu velkendt, at carcinogenese indebærer arvelige genetiske faktorer samt epigenetiske ændringer. Vendepunktet i kræft indvielse er erhvervelsen af ​​målrettede somatiske mutationer, som tildeler til celler en selektiv fordel for klonal proliferation. Blandt de mange forskellige gener involveret i denne proces,

TP53

stadig den hyppigst muteret i humane kræftformer, der tegner sig for over 70% af alle de mutationer, der er beskrevet hidtil i humane kræftformer [1]. Det Internationale Agentur for Kræftforskning (IARC)

TP53

mutation database indeholder 27.580 somatiske

TP53

mutationer (https://www-p53.iarc.fr/, R15 release) [2] . I modsætning til andre tumorsuppressorgener, at langt størstedelen af ​​

TP53

mutationer er missense snarere end ikke sense eller læserammeforskydningsmutationer, hvilket fører til forskellige mønstre i forskellige kræftformer. Interessant nok er disse mønstre er undertiden knyttet til eksponering af ætiologiske faktorer som UV-lys i huden karcinom [3], tobak i lungekræft [4], aflatoksin B

1 i leverkarcinom [5] eller aristolochiasyre i renal carcinoma [ ,,,0],6], [7]. Men fortolkning af

TP53

mutational mønster i tumorer som et fingeraftryk af genotoxin eksponering forbliver kontroversiel [8]. Faktisk mutationer følge af eksponering for genotoxins og andre cellulære hændelser under carcinogenese påvirke den endelige mutational profil findes i humane tumorer, f.eks klonselektion af bestemte mutanter, den genetiske ustabilitet i kræftceller eller epigenetiske påvirkninger (f.eks methylering status) [9] – [11]

Som mange

TP53

mutationer findes i tumorer påvirker kraftigt p53. funktionelle egenskaber [12], et funktionelt assay, den funktionel analyse af Separeret Alleler i gær (FASAY) vises som en nyttig teknik til at skelne mellem stille mutationer i

TP53

og dem, der gør det protein inaktivt [13], [14]. DNA fra en række kilder kan screenes ved FASAY for tilstedeværelsen af ​​en

TP53

allel koder en dysfunktionel protein. Vi har tidligere beskrevet mutationsmønstre i normale humane fibroblaster efter

in vitro

udsættelse for acetaldehyd og aflatoksin B

1 (AFB

1) ved hjælp af FASAY [15], [16]. Her har vi gennemført disse data med dem, der opnås med en velkendt genotoxin: benzo

[a]

pyren (B

[a]

P). Udsættelse for B

[a]

P og AFB

1 resulterer i dannelsen af ​​voluminøse addukter overvejende rettet mod guanin. Vi vil drøfte, hvordan disse kan føre til funktionelt forskellige mutationsmønstre i forskellige tumorer.

Endvidere eksperimentelt genererede

TP53

mutationsmønstre blev sammenlignet med dem i relaterede tumorer registreret i IARC-databasen [ ,,,0],2]. Den mutations mønster af B

[a]

P blev sammenlignet med dem af lungekræft og diskuteres grundigt i nærværende dokument. Dette gjorde det muligt at diskutere kausalitet af genotoxins eksponering for human cancer mutationsmønstre.

Materialer og metoder

Cell linje og cellekultur

humane diploide fibroblaster AG1521 (Coriell Institute , Camden, NJ) blev valgt til denne undersøgelse. Fravær af eksisterende mutationer i

TP53

locus i disse celler blev bekræftet ved at sekventere genomisk DNA med en Beckman Automated Sequencer (CEQ 8000). Celler blev dyrket ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO

2 og 95% luft, i Eagles Minimal Essential Medium (MEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS). Før udsættelse for genotoxin blev mediet suppleret med 200 pi (4%) af S9 levermikrosomale brøkdel af phenobarbital- og naphtoflavone-behandlede rotter (Biopredic, Rennes, Frankrig), NADPH (4 uM) og G6P (5 mM). Den nødvendige mængde B

[a]

P (Sigma, CAS-nummer: 50-32-8, op til 200 uM) blev fortyndet i ovennævnte medium og anvendes til at behandle celler i 2 timer ved 37 ° C . Post-eksponering blev dyrkningspladerne vasket tre gange med PBS og inkuberet i frisk medium. Som fordoblingstiden af ​​disse celler er omkring tre dage, inkubationstid på en uge blev valgt til at tillade to cellecyklus og sikrer fiksering af mutationer.

cytotoksicitetsundersøgelsen

AG1521 fibroblaster blev udsat for B

[a]

P ved koncentrationer fra 1 til 200 pM i nærvær af S9, i 2 timer ved 37 ° C i 96-brønds mikroplader. Pladerne blev vasket tre gange med PBS og inkuberet i 3 dage ved 37 ° C. Cytotoksicitet blev evalueret med et XTT-assay (Sigma) ifølge Scudiero protokollen [17].

Post-mærkning

metode Post-mærkning blev tilpasset fra Reddy og Randerath [18]. Genomisk DNA blev ekstraheret under anvendelse af klassiske phenol /chloroform-metoden efter behandling af RNAse A og T1 efterfulgt af proteinase K (Sigma-Aldrich) og post-mærkning assay blev derefter udført som tidligere beskrevet [19]. Fra autoradiogrammerne således opnåede, var pletter svarende til addukterne udskåret til måling af radioaktivitet. Resultaterne udtrykkes som relative addukt Niveauer (RAL) beregnet som følger: RAL = (cpm

addukter /CPM

BPDE) × 110,7 × 10

-8, hvor cpm

addukter og CPM

BPDE svarer til tællinger per minut fra det udskårne pletter og fra den positive kontrol udstedes fra kalvethymus udsat for B

[a]

P-7,8-dihydrodiol-9,10-epoxidet (BPDE), og bærer 110,7 addukter i 10

-8 normale nukleotider som målt andetsteds [20]. Positiv kontrol er venligst leveret af F. Beland, Jefferson, USA.

FASAY

RNA ekstraktion og Reverse transskription (RT) -PCR blev udført som beskrevet tidligere [15]. Til at amplificere cDNA-primere indeholdende en phosphorthioatbinding ved 3 ‘enden blev bestemt: P3 [5′-ATT-TGA-TGC-TGT-CCC-CGG-ACG-ATA-TTG-AA (r) C-3′] og P4 [5’-ACC-CTT-TTT-GGA-CTT-CAG-GTG-GCT-GGA-GT (s) G-3 ‘]. FASAY blev udført i henhold til Flaman

et al.

[14], med visse modifikationer som tidligere beskrevet [15]. Plasmid pSS16 og gærstamme YIG397 var generøst doneret af JM Flaman (INSERM U614, Rouen, Frankrig) og J. Cachot (LEMA EA3222, Le Havre, Frankrig), henholdsvis

TP53

. – udtrykker plasmider blev reddet fra isolerede røde kolonier, som blev returneret til kultur og lyseres med

Zymolase

(MP-Biomedicals). Purelink Quick Plasmid Miniprep Kit® (Invitrogen) blev anvendt til at redde plasmiderne. Før sekventering,

TP53

cDNA blev re-forstærket med primere P5 [5′-TCT-GTC-ACT-TGC-ACG-TAC-TCC-3 ‘] og P6 [5’-AGA-GGA-GCT -GGT-GTT-GTT-GG-3 ‘], som skal dække exon 4-9 ifølge sekvens beskrevet i GenBank (NM_000546). To sæt primere blev valgt til sekventering rekombinationssitene på hver side af den

TP53

cDNA: ved 5′-område-primere PA [5′-CAG-TCA-GAT-CCT-AGC-GTC-GAG-3 ‘] og PB [5′-CTC-CGT-CAT-GTG-CTG-TGA-CT-3’]; ved 3 ‘region primere PC [5′-AAG-GAA-ATT-TGC-GTG-TGG-AG-3′] og PD [5’-CAG-GCC-CTT-CTG-TCT-TGAAC-3 ‘].

Sequence værktøjer analyse

Thierry Soussi database (https://p53.free.fr/) blev anvendt en reference til

TP53

vildtype sekvens og IARC-databasen R14 frigivelse (https://www-p53.iarc.fr/) blev anvendt til at sammenligne forskellige

TP53

mutationsmønstre [2]. BLAST værktøj fra NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) blev anvendt til analyse af sekvens ligheder.

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført ved hjælp af SAS-software frigive 9.2. En chi i anden-test med én frihedsgrad blev anvendt til at vurdere sammenhængen mellem de observerede og teoretiske frekvenser af mutationer ud af basesubstitutioner i exon 4 til 9. Sammenligninger mellem de udskiftninger mønstre vedrørende de genotoxins blev udført ved hjælp af en Fishers eksakte test . Alle tests var tosidet med et signifikansniveau på 0,05.

Resultater

Cytotoksicitetsstudier på AG1521 fibroblaster

Cell vækst efter 2 timers eksponering af AG1521 humane fibroblaster til B

[a]

P ved forskellige koncentrationer viste en moderat cytotoksicitet B

[a]

P i disse betingelser, blev IC50 skønnes at være over 200 uM (Figur 1). Vi valgte derefter eksponeringskoncentrationer i området fra 1 uM svarende til den højere koncentration uden nogen vækstinhibering til 50 um svarer til en 25% vækstinhibering. Således blev cellulære skader minimeres, og genoptagelse af kulturen var lettere efter eksponering. Rækken af ​​koncentrationer af acetaldehyd og AFB

1 anvendte, blev tidligere beskrevet og diskuteret [15], [16]. Acetaldehyd blev brugt på 0,1-7,5 mM og AFB på 16-800

1 nM.

cytotoksicitet B

[a]

P menneskelige fibroblastsAG1521 efter 2 timer eksponering og 3 dage opsving (4 brønde pr koncentration, gennemsnit og standardafvigelser).

Anbring mærkning af B

[a]

p-induceret DNA addukter

Figur 2A viser mønsteret for DNA voluminøse addukter efter 2 timers eksponering til B

[a]

P 1, 10 og 50 pM under tilstedeværelse af eksogene metabolisering fraktion (S9mix). Positiv kontrol blev opnået fra nøgent kalvethymus-DNA udsat for 35 nM BPDE, den aktive metabolit (figur 2B). En større plet migrerer ligeledes på tyndtlagskromatografi plader var synlige i de fire prøver. Efter B

[a]

P eksponering, blev en anden, men meget svag plet også observeret for de 2 højeste koncentrationer. Den RAL i DNA fra B

[a]

P-eksponerede celler efter eksogen metabolisering var væsentligt over grænsen for kvantificering af 1,75 × 10

-8. Denne værdi blev bestemt efter en intern proces med validering (upublicerede data). Dette demonstrerer effektiviteten af ​​metaboliserende procedure. Imidlertid er et plateau effekt nås ved 10 uM.

(A) AG1521 celler efter 2 timers eksponering til B

[a]

P. (B) kalvethymus-DNA efter udsættelse for 35 nM B (a) P-7,8-dihydrodiol-9,10-epoxid (BPDE kontrol). RAL værdier er middelværdien af ​​to uafhængige analyser.

mutationsrater i FASAY

Tabel 1 viser de samlede resultater for B

[a]

P. Hver koncentration blev testet in triplo. Som reproducerbarhed blandt tredobbelte var meget høj, er det samlede antal kolonier for hver koncentration vist.

Blandt de røde kolonier, der opstår fra ubehandlede kontrolceller, kun nogle få bear mutationer i den centrale del af

TP53

, dvs. exon 4 til 9. de øvrige røde kolonier blev betragtet som artefakter, som de gennemførte ufordøjet pSS16 plasmid eller mutationer placeret i rekombinationsstederne. Blandt de 3 røde kolonier fra kontrol celler, der bærer en mutation i den centrale del af

TP53

, 2 viste en AGT insertion i exon 7/8 som sandsynligvis en splejsningsdefekt snarere end en sand mutationsbegivenhed, som beskrevet tidligere [15]. Det er bemærkelsesværdigt, at antallet af denne splejsningsdefekt var sammenlignelig blandt de eksperimenter på de tre genotoxins diskuteret her. Kun én sand mutation blev fundet i kontrolcellerne, hvilket tillader beregning af en spontan mutation sats på 0,05%. Denne sats var omkring 9 til 18 gange lavere end de mutationsrater beregnet i udsatte celler. Denne enkelt spontan mutation, var en G En overgang inden for en CpG sekvens i codon 267 (CGG TGG). Denne form for mutation er klassisk tilskrives spontan deaminering af 5-methylcytosin, selv om vi ikke kan udelukke muligheden for en fejl som følge af DNA-polymerase under RT-PCR trin.

De mutationsrater i udsatte celler bestod mellem 0,45 til 0,92%. Som observeret med data post-mærkning, er et plateau nås på 10 uM.

Identifikation af

TP53

mutationer i B

[a]

P udsat AG1521 humane fibroblaster

tabel 2 viser de 37 sande mutationer findes i B

[a]

p-eksponerede celler. Fem mutationer var en- eller flere-baseinsertioner /deletioner, hvilket fører til et rammeskift. De resterende mutationer var enlige nukleotidsubstitutioner herunder 1 nonsens og 25 missense mutationer. Den mutations mønster er afbildet i figur 3C: G T transversioner var de mest fremherskende (8/37, 21,6%). De efterfølges af G A, G A ved CpG og A G overgange (7/37, 18,9% for hver enkelt af dem), sletninger (4/37, 10,8%), G C transversioner (2/37 , 5,4%), A T transversioner (1/37, 2,7%) og én base insertion (1/37, 2,7%). Denne mutations mønster derpå diskuteret i sammenligning med tidligere opnået efter AG1521 fibroblaster udsættelse for acetaldehyd (figur 3A) og aflatoxin B

1 (AFB

1, figur 3B) [15], [16].

(A)

In vitro

Acetaldehyd-eksponerede humane fibroblaster AG1521 (FASAY) (n = 35 mutationer, data fra [15]), (B)

In vitro

AFB

1-eksponerede humane fibroblaster AG1521 (FASAY) (n = 37 mutationer, data fra [16]), (C)

In vitro

B

[a]

P-eksponerede humane fibroblaster AG1521 (FASAY) (n = 37 mutationer).

lokalisering af mutationer blandt

TP53

exons 4 til 9

Figur 4 viser lokaliseringen af ​​mutationer fra B

[a]

P (denne undersøgelse), AFB

1 og acetaldehyd [15], [16]. B

[a]

P mønster viser to hot-spots, codon 248 og 127, mens AFB

1 hot-spots er codon 179 og 220 og acetaldehyd dem codon 248, 245 og 283.

Mutationsanalyse mønster som ses i AG1521 fibroblaster efter B

[a]

P (Orange barer, n = 32 mutationer); AFB

1 (pink barer, n = 29 mutationer); og acetaldehyd (blå søjler, n = 32 mutationer) eksponering. Kodoner indtastet i kursiv er store hot-spots i humane tumorer i henhold til IARC database.

For at vurdere, om mønsteret af B

[a]

P mutationer kunne være et spørgsmål chance, analyserede vi de data, som beskrevet af Shen

et al.

[21]. Til denne analyse af hot-spots, kun basesubstitutioner forekommer i exon 5 til 9 blev taget i betragtning. Hot-spots blev defineret som de 24 mutationer, som tegner sig for 50% af mutationerne rapporteret i lungekræft i R14 IARC databasen. Efter faldende frekvens, disse er codon: 273, 248, 249, 245, 158, 157, 175, 179, 282, 220, 242, 163, 176, 154, 280, 266, 298, 237, 193, 281, 159, 135, 234 og 244. Hvis der blev antaget disse 24 hot-spots til at blive tilfældigt muteret, så de ville forudsiges at blive ramt 24/205 (samlet antal codon i exon 5 til 9), dvs. ved en frekvens på 11,7 %. Ud af de 30 basesubstitutioner i exonerne 5 til 9 i vores undersøgelse, 11 (36,7%) svarer til en af ​​de ovennævnte hotspots identificeret for lungekræft, en sats betydeligt højere end forudsagt for tilfældige begivenheder (11,7%; p = 2,10

-5). Den samme analyse blev udført ved hjælp af enten kun hot-spots findes i lungekræft fra rygere, eller en anden definition af hot-spots, dvs. mutationshyppighed overlegne til 2% af alle mutationer, som foreslået af Olivier

et al.

[ ,,,0],22]. Disse analyser var stærkt signifikante uanset de anvendte parametre (data ikke vist).

Disse observationer sammen med sammenligning af mutationssteder med lungekræft hot-spots, som vist ovenfor, kraftigt argumentere imod en tilfældig fordeling af mutationer i vores analyse

diskussion

Vi vil behandle to vigtige spørgsmål:. første, der eksperimentelt genereret mutation profiler er repræsentative for dem, der forekommer naturligt for en given genotoxin? For det andet er baseret på en samling af forsøg og epidemiologiske data om mutationer forbundet med humane tumorer, kan kemisk inducerede mutationer af

TP53

på specifikke steder (codon) identificeres som en vigtig begivenhed i carcinogenese?

Forholdet mellem B

[a]

P mutagenicitet og

TP53

mutationer

Mange genotoksiske metabolitter produceret fra B

[a]

P. Den vigtigste måde, som indebærer CYP1A, CYP1B, CYP3A og epoxidhydrolaser, fører til den ultimative genotoksisk metabolit (±) -anti-BPDE som binder sig til DNA og danner overvejende DNA addukter på

N2

stilling guanin og i mindre grad på

N6

stilling adenin [23] – [25]. En anden vej involverer dihydrodiol dehydrogenaser AKR1A1 og 1C1-4 som oxiderer B

[a]

P dihydrodiols til catecholer [26]. Catecholer kan derefter gennemgå mono-elektroniske oxideringer fører til

o

-quinones som danner DNA-addukter, såsom B

[a]

P-7,8-dione-

N

2

-dG og B

[a]

P-7,8-dione-

N

6 fotos -Da [27], [28]. I denne undersøgelse under eksponeringen af ​​AG1521 fibroblaster til B

[a]

P, enzymer blev leveret eksogent, i henhold til standard praksis i genotoksicitetstestning. Analysen post-mærkning afslørede en stor plet, der co-migrerede med den, der ses i kontrol-DNA udsat for BPDE. Dette tyder stærkt på, at B

[a] resultater

P eksponering overvejende i BPDE-DNA-addukter.

Efter aftale med dataene i litteraturen, fandt vi, at størstedelen af ​​basesubstitutioner induceret af B

[a]

P blevet placeret på G: C-basepar, hvoraf kun 6 inden CpG regioner. Guaniner i methylerede CpG-sekvenser er typiske mål for DNA-addukter [10], [23]. Det er sandsynligt, at DNA-methylering er dårlig i et cellulært model som den anvendes her, men Shen

et al.

Under anvendelse af samme reporter gærstamme transformeret med kemisk modificerede plasmider, observeret, at DNA-methylering påvirkede ikke generering af BPDE addukter [21].

Brug UvrABC endonuclease i kombination med ligation-medieret PCR (LMPCR), fordelingen af ​​BPDE addukter på exon 5, 7 og 8 i

TP53

i HeLa-celler er blevet kortlagt [29], [30]. Stærk adduktdannelse forekom ved de guaniner i codon 154, 156, 157, 158, 159, 245, 248 og 273, hvoraf de fleste er beskrevet som hot-spots i lungekræft (157, 158, 245, 248 og 273; IARC database, udgave R14). Faktisk blev den codon 248 hyppigst ramt af B

[a]

P i vores analyse. For det andet ved anvendelse af methyleret og BPDE-eksponerede DNA-fragmenter indeholdende exon 5 i

TP53

, addukter blev fundet hos tre andre kodoner: 152, 175, 181, som alle blev afdækket i den foreliggende undersøgelse, såvel [10] .

B

[a]

p inducerede mutationsmønstre er blevet grundigt undersøgt i mange gener i forskellige biologiske systemer. Analyser udført i gnavere celler

in vitro

eller

in vivo

på reportergener såsom

HPRT

eller

Lacl

har konsekvent rapporteret overvægten af ​​G T transversioner og, i mindre omfang, af G a overgange og sletninger [31] – [34]. Satsen for G T transversioner synes at være koncentrationsafhængig [31]. Interessant, ved anvendelse af et gær-assay med forskellige stammer deficiente i nukleotid excision reparation, blev det påvist, at DNA-polymeraser η og ζ var påkrævet i kombination til translesion reparation tværs BPDE addukter, hvilket fører til G T transversioner [35]. Pol ζ alene var også i stand til at generere større deletioner i denne analyse.

Afhængigt af eksperimenterende tilgang, er der observeret uoverensstemmelser mellem mutationsmønstre i

TP53

induceret af

in vitro

og

in vivo

eksponering for B

[a]

P eller BPDE. Ved hjælp af samme gær assay som os, men efter en direkte BPDE eksponering af en methyleret plasmid bærer menneske

TP53

sekvens, Yoon

et al

har fundet en klar overvægt af G . T transversioner mens Shen

et al

har fundet hovedsageligt G . A overgange [11], [21]. Den direkte sekventering af

TP53

i human-p53 knock-in (Hupki) murine embryonale fibroblaster efter

in vitro

eksponering for B

[a]

P har vist primært G T transversioner [36], [37]. Tilsvarende G T mutationer blev også fundet overvejende hudtumorer efter B

[a]

P eksponering [38]. Kortlægningen af ​​

TP53

fra forskellige tumorer induceret efter

in vivo

eksponering af mus til B

[a]

P eller kultjære førte i samme omfang af G T , G A og G C mutationer [39]. I det hele taget er det klart af det store flertal af undersøgelser, at uanset genet blive undersøgt og brugt det biologiske system, G T transversion er kendetegnende for B

[a]

P eller BPDE eksponering. I den forbindelse blev vi overrasket over at finde disse transversioner tegner sig for kun 22% af mutationer i vores undersøgelse, men stigende fra 17% ved 1 uM til 27% ved 50 uM. Som foreslået af Wei

et al.

[31], kan det være et spørgsmål om dosis. Mange

in vitro

studier har brugt BPDE i uM område [11], [35] mens vi brugte B

[a]

P i samme område, hvilket naturligvis førte til en lavere eksponering at BPDE i vores protokol. Nogle

in vitro

undersøgelser anvendte B

[a]

P i uM området, men i disse undersøgelser eksponeringstiden varierede fra 4 til 9 dage i stedet for de 2 timer i vores protokol [ ,,,0],36], [37]. Dette antyder, at G T transversioner kunne være kendetegnende for en stærk eksponering til B

[a]

P, et scenario, der forekommer plausibelt i forbindelse med tobaksrøg eksponering i storrygere, mens moderat eksponering kan medføre til både G T, G A, G C og sletninger, som findes i mange studier. Denne hypotese understøttes af forekomsten af ​​G T transversioner i lungekræft i forhold til eksponering tobak. Ifølge IARC database (figur 5), denne udbredelse varierer fra 25% i ikke-rygere til 32% i rygere og 55% i storrygere

Fra venstre til højre:.

in vitro

B

[a]

P-eksponerede humane fibroblaster AG1521 (FASAY) (n = 37); human lungekræft, ikke rygere (n = 288); humane lungecancere, rygere (n = 870); humane lungecancere, storrygere (n = 20). Lungekræft data fra IARC-databasen R14. Sjældne mutationer blev udeladt i disse mønstre

Omvendt til satsen for G . T transversion, fandt vi en høj grad af G A overgange (38%), hvoraf halvdelen er placeret i CpG-sekvenser . Dette kan delvis forklares ved spontane mutationer, som ses i kontrol celler. Men en teknisk skævhed kan overvejes, da vores protokol ikke skelnede mellem to uafhængigt opstår, men identiske mutation begivenheder og en af ​​følgende situation: (i) flere mRNA-transkripter fra samme mutant celle, der efterfølgende uafhængigt fanget i plasmider eller (ii) klonal ekspansion af en mutant celle, før høst af puljen af ​​behandlede celler. I tabel 2 kun 3 mutationer kan være potentielt relevant for en sådan skævhed, hvilket tyder på, at kulturgenstandsspor dobbeltarbejde mutationer kan være sjældne. Desuden duplikeres mutationer er for det meste G A overgange i CpG-steder. Dette kan fejlagtigt øge hastigheden af ​​denne særlige mutation.

Sammenligning af

TP53

mutationsmønstre profiler opnået for de genotoxins, B

[a]

P, acetaldehyd og AFB

1

Resultater opnået ved anvendelse af FASAY at evaluere mutagene effekter af

in vitro

eksponering af normale humane fibroblaster til B

[a]

P, acetaldehyd og AFB

1 blev sammenlignet. Fishers eksakte test viste, at med hensyn til den type mutation, B

[a]

P og AFB

1 mønstre ikke var statistisk forskellige (p = 0,6735), mens forskellene mellem mønstre for acetaldehyd og enten B

[a]

P eller AFB

1 var statistisk af borderline signifikans (p-værdier på 0,0546 og 0,0705, henholdsvis). Disse tre forbindelser er kendt for at forårsage forskellige typer af DNA-skader, der kunne på sin side afhænge af de enkelte mutationer. Acetaldehyd-induceret mønster er hovedsagelig kendetegnet ved en meget høj andel af G A overgange (66%), for det meste placeret i CpG-sekvenser, som er en sandsynlig grund for dannelsen af ​​interstrengstværbinding addukter i CpG-sekvenser [15]. I modsætning hertil den høje G T transversioner observeret blandt B

[a]

P- og AFB

1-inducerede mutationer, er blevet anerkendt som et adelsmærke for deres mutagenicitet,

in vitro

in vivo

[4], [40]. Dette er for det meste tilskrives tilstedeværelsen af ​​voluminøse addukter

B

[a]

P mønster afslører to unikke funktioner i forhold til de af AFB

1 og acetaldehyd:. Forekomsten af ​​G C overgange og en højere sletninger (11% vs. 5-6%). Betragtninger AFB

1 og acetaldehyd induceret single-base sletninger, kunne B

[a]

P generere sletninger op til 24 nukleotider. Denne funktion kan være resultatet af en bestemt translesion syntese vej af B

[a]

P addukter som diskuteret ovenfor.

Således er en foreløbig analyse ved hjælp af FASAY muligt for os at registrere og skelne forskellige eksperimentelt genereret mutation mønstre i

TP53

, som derefter blev anvendt til at sammenligne med eksisterende epidemiologiske data på kort over DNA-addukter og tumor mutationer i

TP53

.

Forekomst af eksperimentel

TP53

mutanter i humane tumorer og funktionelle virkninger af mutationer

Den poolede fordeling af muterede kodoner opnået efter udsættelse for hver af de tre genotoxins diskuteret her tilladt os at identificere 6 store hot-spots i human tumorer, kodoner 248, 273, 175, 245, 282, 249 (figur 4).

på den fænotypiske niveau, blandt de 63 mutanter, der følger af et nukleotid substitution, de to hyppigst hentet i humane tumorer blev også findes i vores eksperimentelle mønstre, dvs. Arg175His og Arg248Gln (tabel 3). Desuden fire substitutioner (Arg175His, Arg248Gln, Arg273Cys og Gly245Ser) udgør tilsammen mere end 10% af de mutanter, der findes i humane tumorer. Kun tre mutanter findes i vores undersøgelse er aldrig blevet beskrevet i humane tumorer (Gly117Val, Gly262Leu, Asn288Ile). Dette tyder stærkt på, at FASAY genopretter mutanter, der bærer en funktionel ændring tillader selektion under carcinogenese processen.

Vi evaluerede den funktionelle konsekvens af mutationer opstår efter

in vitro

udsættelse for tre kemikalier i lyset af data fra Dearth

et al. Hoteller, som revideret virkningen af ​​76

TP53

mutanter hyppigt observeret i humane tumorer [12]. Fjorten ud af de 76 analyserede mutanter blev hentet i vores tre eksperimentelle mønstre (tabel 3). Som forventet, disse 14 mutanter var blottet for aktivitet på

RGC

sekvenser, der blev anvendt i vores FASAY protokol. Denne analyse viser, at de fleste af de eksperimentelle mutationer havnen større funktionsnedsættelse, dvs. fuldstændigt tab af transkriptionsaktivitet på 22 p53 DNA-bindende sekvenser (DBS) og dominerende negativ effekt (DNE). Omvendt har nogle af mutationerne, der er hyppige i humane tumorer er usandsynligt, at hentes af FASAY fordi de bevarer transkriptionelle aktivitet [12]. Dette omfatter for eksempel Arg175Leu eller Glu285Lys, der ikke blev fundet i vores analyse.

Men den funktionelle analyse af mutanter af FASAY gør det ikke muligt for os at skelne mellem forskellige typer af kræft. Faktisk hvis FASAY tillade os at hente mutanter forekommer hyppigt i humane tumorer, disse mutanter var hverken særlig hyppige eller sjældne i tumorer at være udsat for en bestemt genotoxin. For eksempel Arg175His og Arg248Gln findes i B

[a]

P og AFB

1 mønstre er de hyppigst identificerede mutanter i de humane tumorer, der tegner sig for 4,25% og 3,21% af alle mutanter (Tabel 3), men de udgør kun 1,2% af lungekræfttilfælde eller leverkarcinom mutanter ifølge IARC database. På samme måde, Arg273Cys afbildet i acetaldehyd mønster er hyppigere i hele human tumor-spektrum (2,44%) end i det for øsofageal cancer (1,3%).

Denne analyse fremhæver evne af kemikalier til at inducere hyppige og meget svækket

TP53

mutanter, som kan være en vigtig begivenhed involveret i carcinogenese. Sammenlignet med klassiske mutagenese assays under anvendelse af reportergener, denne funktionelle

in vitro

tilgang giver stærke argumenter for en biologisk plausibilitet carcinogenicitet for en genotoxin. Ikke desto mindre er det rekapitulerer kun den initierende trin i carcinogenese og dermed er unøjagtige i at forudsige, hvilke særlige mutation kunne være en drivende kraft i løbet af de efterfølgende trin af carcinogenese i en given væv.