PLoS ONE: oleanolsyre Starter Apoptose i ikke-småcellet lungekræft cellelinjer og Reducerer Metastase af en B16F10 melanom Model In Vivo

Abstrakt

Baggrund

Lægemiddelresistens, en proces medieret af flere mekanismer, er en kritisk faktor til behandling af lungekræft. Formålet med denne undersøgelse er at fastslå, om oleanolsyre (OA), et pentacyklisk triterpen stede i flere anlæg, er i stand til at omgå de mekanismer medikamentresistens stede i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) cellelinier og fremkalde deres død .

vigtigste resultater

OA faldt cellen levedygtighed NSCLC cellelinjer A459 og H460 på trods af tilstedeværelsen af ​​aktive, multiresistent (MDR) MRP1 /ABCC1 proteiner, og de anti-apoptotiske proteiner bcl-2 og survivin. Disse virkninger skyldes apoptose, hvilket fremgår af kapaciteten af ​​OA til at inducere fragmentering af DNA og aktivere caspase 3. Induktion af NSCLC celledød ved OA kan ikke forklares ved inhibering af MDR proteiner, eftersom behandling med triterpen havde ringe eller ingen virkning på aktiviteten eller ekspressionen af ​​MRP1. Desuden behandling med OA havde ingen virkning på ekspressionen af ​​det anti-apoptotiske protein Bcl-2, men forøgede ekspressionen af ​​pro-apoptotisk protein Bax, ændring af Bcl-2 /Bax balance mod et pro-apoptotisk profil. OA faldt også udtryk for den anti-apoptotiske protein survivin. Endvidere OA faldt ekspressionen af ​​angiogene vaskulære endotelvækstfaktor (VEGF) og faldt udviklingen af ​​melanom-induceret lunge metastase.

Konklusion

Vores data giver en betydelig indsigt i antitumormakrofagaktivatoren og antimetastatisk aktivitet af OA i NSCLC og foreslå, at herunder OA i NSCLC regimer kan bidrage til at mindske antallet af tilbagefald og reducere udviklingen af ​​metastaser

Henvisning:. Lúcio KA, Rocha GDG, Monção-Ribeiro LC, Fernandes J, Takiya CM, Gattass CR (2011) oleanolsyre Starter Apoptose i ikke-småcellet lungekræft cellelinjer og Reducerer Metastase af en B16F10 melanom Model

In Vivo

. PLoS ONE 6 (12): e28596. doi: 10,1371 /journal.pone.0028596

Redaktør: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, USA

Modtaget: Januar 3, 2011; Accepteret: 11. november 2011; Udgivet: 9. december 2011

Copyright: © 2011 Lúcio et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP /FNDCT /NQTN Conv. 01.06.0390.00), Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo en Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ yde nummer e-26 /110,135 /2009) , Instituto Nacional para Pesquisa Translacional em Saúde e Ambiente na Região Amazonica (INCT-INPeTAm /CNPq /MCT Conv. # 57,3695 /2008-3) og Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior (CAPES, ph.d.-stipendium til KAL). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Worldwide, lungekræft er den hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald [1]. Ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) udgør over 80% af alle diagnosticerede lungekræft. Den høje dødelighed af denne sygdom skyldes vanskelighederne ved tidlig påvisning. På tidspunktet for diagnosen, de fleste patienter har en inoperabel fremskreden sygdom, der involverer lymfe-knude eller visceral metastaser, eller begge dele. Platinbaseret kemoterapi, en af ​​de vigtigste behandlinger for NSCLC i de seneste årtier, udstillet adskillige problemer: ud over at være meget giftigt, kemoterapi kun produceret en beskeden forbedring i samlet overlevelse [2]. Selv efter udviklingen af ​​lægemidler rettet mod væksten af ​​en tumor, den samlede overlevelsesraten for patienter med NSCLC forblev lav [3]. Det kemoterapeutiske svigt i lungekræft kan bidrage til metastase og høj sygelighed, hvilket indikerer, at der er brug for effektive behandlingsformer.

multilægemiddelresistens (MDR) spiller en kritisk rolle i svigt i lungekræft kemoterapi. Selv om flere mekanismer kan mediere MDR, har forskere viet megen opmærksomhed på overekspression af transportproteiner af adenosin-5′-triphosphat (ATP) -bindende kassette (ABC) familie og til ændringer af faktorer involveret i den apoptotiske proces. Ekspression af MDR proteiner betragtes som den vigtigste årsag til en patients tilbagefald efter behandling; litteratur [4], [5] har beskrevet en sammenhæng mellem ekspressionen af ​​ABC proteiner og dårligt resultat af NSCLC patienter behandlet med kemoterapi. MDR proteiner, såsom P-glycoprotein (P-gp) /ABCB1 og Multiple Drug Resistent Protein 1 (MRP1) arbejde som effluxpumper der er i stand til at fjerne en række lægemidler fra cellen og derved forhindre celledød [6]. Ændringer af mekanismer, der dæmper pro-apoptotiske veje og /eller forstærke antiapoptotiske veje er også vigtige faktorer i udviklingen af ​​kemoterapeutiske resistens i tumorer [7], [8]. Adskillige undersøgelser viste, at inhibering af anti-apoptotiske proteiner af B-celle-lymfom 2 (Bcl-2) [9], [10] eller inhibitor af apoptose (IAP) familier [11], [12] sensibiliserer NSCLC celler til kemoterapi.

Et andet kendetegn for maligne cancerceller er deres evne til at etablere metastase. Siden metastatisk sygdom, snarere end lokal tumorvækst, bestemmer dødeligheden hos patienter, målretning tumormetastase har den højeste prioritet i cancerterapi. En væsentlig mængde beviser har vist tyder, at aksen mellem den vaskulære endotelvækstfaktor (VEGF) receptor og FLK-1 kinase insert domæne receptor (KDR) (VEGF-FLK-1 /KDR) er den dominerende signaltransduktionsvej regulere tumor angiogenese og metastase [13]. Men fordi den vigtigste forudsætning for udvikling af metastaser er tilstedeværelsen af ​​levende tumorceller, mekanismer involveret i resistens, såsom ekspressionen af ​​MDR proteiner og anti-apoptotiske faktorer, er blevet foreslået, som gunstige betingelser for udvikling af metastaser [14], [15].

Mange forbindelser af naturlig oprindelse, er i stand til at modulere lægemiddelresistens. Oleanolsyre (OA), en pentacyklisk triterpenoid findes i en lang række plantearter, præsenterer flere biologiske egenskaber, herunder anti-inflammatorisk [16], [17], hepato- og nefrotoxicity beskyttelse [18], [19], genopretning af hæmatopoietiske system efter bestråling [20] og cytotoksicitet mod flere cancercellelinier [21], [22], [23]. I en tidligere undersøgelse, viste vi, at OA er også effektiv mod MDR erythroleukemic celler, der overudtrykker P-gp og dens følsomme modstykke [24]. Den foreliggende undersøgelse blev udført for at undersøge de cytotoksiske virkninger af OA på NSCLC-celler (A549 og H460), der udtrykkes både MRP1 [25], [26] og anti-apoptotiske faktorer [7], [8], og at undersøge virkningerne af dette triterpen på veje involveret i lægemiddelresistens og udvikling af metastaser.

OA-induceret apoptose i begge cellelinier. Behandling med denne triterpen faldt ekspressionen af ​​survivin og forøget ekspression af Bax, uden at påvirke ekspressionen af ​​Bcl-2 eller MRP1. Desuden OA faldt ekspressionen af ​​VEGF og inhiberede udviklingen af ​​melanom-induceret lunge metastase. Sammen antyder disse data, at OA kan være en god kandidat til behandling af tumorer med iboende udtryk for resistens mekanismer, såsom lunge tumorer.

Materialer og metoder

Materialer

oleanolsyre (OA), molekylvægt 456,7, leveret af Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA), blev opløst til 10 mM dimethylsulfoxid (DMSO), opbevaret ved -20 ° C og fortyndet i dyrkningsmedium til brug. DMSO, 3- (4,5 dimethylthiozol-2-yl) -2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid (MTT), propidiumiodid (PI) og rhodamin 123 (Rho123) blev indkøbt fra Sigma. 5-carboxifluorescein diacetat (5-CFDA) blev opnået fra Calbiochem (San Diego, CA, USA). Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM), føtalt kalveserum (FCS), penicillin og streptomycin var fra Life Technologies, Inc. (USA). FACS lyserende opløsning var fra BD Biosciences (San Jose, CA). Caspase-3 assay kit (CaspGlow) var fra BioVision (Mountain View, CA, USA). Antistoffer mod Bax (klon P-19), VEGF (klon C-1) og tubulin (klon B-7) blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Bcl-2-antistof (klon 124) var fra DAKO (Carpinteria, CA, USA) og survivin antistof (ab24479) blev købt fra ABCAM (Cambridge, MA, USA). Biotinyleret anti-mus IgG og CY3-mærket streptavidin var fra Sigma. Biotinyleret anti-gede-IgG, anti-kanin IgG og Vectashield® monteringsmedium blev indkøbt fra Vector Laboratories (Burlingame, CA, USA). 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) og PE-mærket anti-MRP1 (QCRL-2) var fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Anti-MRP1 (klon A23, Axxora, San Diego, CA), Bcl-2 (klon bcl2-100, Zymed, San Francisco, CA), anti-muse HPR (Amersham, Arlington, IL) og anti-kanin-HPR (GE Healthcare, Piscataway, NJ) blev anvendt til western blot.

Celler og dyrkningsbetingelser

den menneskelige ikke-småcellet lungekræft-cellelinjer A549 og H460 og den murine melanom linje B16F10 blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt kalveserum (FCS), 100 U penicillin og 100 ug /ml streptomycin i engangsplastflasker ved 37 ° C med 5% CO

2. Celler blev sub-dyrket ved hjælp af trypsin-EDTA hver 3-4 dage.

Cell levedygtighed assay

Cell levedygtighed blev vurderet ved hjælp af MTT-analysen. Kort fortalt, 180 pi af lungecancer cellesuspensionen (10

4 /brønd) blev fordelt i plader med 96 brønde og inkuberet i 24 timer ved 37 ° C /5% CO

2 for at tillade kulturen at stabilisere. Cellerne blev derefter behandlet med 20 pi medium, forskellige koncentrationer af OA (10, 25, 40 eller 50 ug /ml eller 21,9, 54,7, 87,6 eller 109,5 uM); DMSO koncentrationer for hver dosis blev anvendt som kontroller. Efter 48 timers inkubation blev kulturen behandlet med 20 pi MTT (5 mg /ml) og holdt i 4 timer ved 37 ° C i mørke inden de centrifugeret, og supernatanten blev kasseret. Formazanen fremstillet ved reduktion af MTT af levedygtige celler blev opløst i DMSO og den optiske densitet blev målt i en ELISA-læser (benchmark, Bio-Rad, CA) ved 570 nm (reference filter 630 nm). Forsøg blev gentaget mindst tre gange. Resultaterne blev udtrykt som middelværdien ± SD af procent inhibering af cellelevedygtighed. For at kontrollere, om høje koncentrationer af OA ville forstyrre MTT aflæsninger blev OA inkuberet med MTT i de samme betingelser, der anvendes til bestemmelse af cellelevedygtighed. Der blev ikke observeret nogen interferens.

DNA fragmentation assay

Apoptose blev vurderet ved cellecyklus-analyse under anvendelse af flowcytometri. Efter 24 timer hvilende, de udpladede lungeceller (2 × 10

4 /brønd) blev behandlet med medier eller forskellige koncentrationer af OA (10, 25, og 50 ug /ml) og inkuberet i yderligere 48 timer. Efter denne tid blev cellerne høstet, resuspenderet i en hypotonisk fluorescerende opløsning (50 ug /ml PI og 0,1% Triton X-100 i 0,1% natriumcitrat-buffer) i 1 time ved 4 ° C i mørke. Cellecyklussen blev analyseret ved flowcytometri (FL-2) (FACSCalibur, Becton Dickinson, San Jose, CA) til bestemmelse af sub-G0 /G1 DNA-indhold. Sub-diploide populationer blev anset for at være apoptotiske. indsamling og analyse af data blev kontrolleret af Cellquest software-version 3.1f. Hvert eksperiment blev gentaget mindst tre gange. Resultaterne blev præsenteret som repræsentative histogrammer og som middel ± SD af den procentdel af DNA, der var fragmenteret.

caspaseaktivering assay

Caspase-3-aktivering blev analyseret under anvendelse af et kommercielt kit, ifølge anvisningerne fra producenten (BioVision, Mountain View, CA). Kort fortalt celler udpladet som beskrevet i

Cellelevedygtighed assay

(M M) blev inkuberet i 48 timer med medium (kontrol) eller forskellige koncentrationer af OA (10, 25 eller 50 ug /ml), før det høstes , centrifugeret og suspenderet i caspase-3-assay-opløsning. Dette assay opløsning indeholder en potent caspaseinhibitor konjugeret til FITC, der er celle gennemtrængelig, ikke-toksisk og irreversibelt til aktiveret caspase. Efter 1 timers inkubation (37 ° C, 5% CO

2) blev cellerne vasket to gange med vaskebuffer, og procentdelen af ​​caspase-3-aktiverede celler blev analyseret ved flowcytometri (FL-1). Resultater blev præsenteret som histogrammer repræsenterer tre forskellige eksperimenter.

Aktivitet af MDR proteiner

Aktiviteten af ​​MDR proteiner blev bestemt ved akkumulering af specifikke substrater. Rho123 og 5-carboxyfluorescein-diacetat (CFDA), et ikke-fluorescerende molekyle, der omdannes til det fluorescerende carboxy-fluorescein (CF) af intracellulære esteraser, blev anvendt til måling af aktiviteten af ​​P-gp /ABCB1 og MRP1 /ABCC1 henholdsvis [ ,,,0],27], [28].

i hvert eksperiment blev cellerne (1 x 10

5 /brønd) blev podet i plader med 24 brønde og præinkuberet i 24 timer ved 37 ° C /5% CO

2 for at tillade kulturen at stabilisere sig. Celler blev inkuberet i 30 minutter med medium (autofluorescens); 400 nM Rho123 eller 5 uM CFDA i nærvær af medium, hæmmere af P-gp (25 pM Verapamil) eller MRP1 (50 uM MK-571); eller den ønskede koncentrationer af OA. Derefter blev cellerne vasket i PBS, høstet og opbevaret på is indtil flowcytometrianalyse (FACSCalibur, Beckton-Dickinson cytometer). Resultater blev præsenteret som repræsentative histogrammer eller som middelværdi ± SD af arbitrære enheder af gennemsnitlige fluorescensintensitet (MIF).

Ekspression af MDR proteiner

MRP1 ekspression blev vurderet ved anvendelse af flowcytometri og western blot. Celler blev udpladet og behandlet i 24 timer med medier eller OA (enten 25 eller 50 ug /ml). For flowcytometri blev celler høstet, permeabiliseret med FACS lyserende opløsning og inkuberet med PE-mærket anti-MRP1 (klon QCRL-2) i 30 minutter ved 4 ° C. Efter to PBS vaskninger blev celler resuspenderet i FACS-opløsning og fluorescensen evalueret. Resultaterne blev præsenteret som repræsentative histogrammer. Til Western-blot blev helcelleekstrakterne fremstillet ved fortynding cellepellets direkte i RIPA (50 mM Tris-HCI, pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5% Sodium deoxycholat, 0,1% SDS og 1% protease inhibitor Kit (Amersham, Arlington , IL). Lige store mængder protein blev separeret ved SDS-PAGE og overført til polyvinylidendifluorid (PDF) membraner. Blots blev blokeret i 2 timer i PBS /0,05% Tween indeholdende 5% fedtfri tørmælk, probet med specifikke antistoffer til MRP1 ( klon A23, 1:1000) eller tubulin (klon b-7, 1:500) natten over og inkuberet med HPR-konjugerede sekundære antistoffer (1:2000 fortynding. Amersham Biosciences, UK) i 1 time ved stuetemperatur Blots blev udviklet ved anvendelse den forøget kemiluminescens-systemet (ECL, Amersham, Arlington, IL) ifølge producentens instruktioner. Band intensitet blev kvantificeret under anvendelse af Scion Billede Software og proteinekspression blev normaliseret i forhold til a-tubulin.

immunocytokemi assays

A459-celler (3 x 10

4 /brønd) blev podet på dækglas i 24 brønds plader, henstår i 24 timer og derefter behandlet med medium eller 50 pg /mL OA. Efter 24 timers inkubation blev cellerne vasket to gange med phosphat saltvand (PBS), pH 7,4, og fikseret med en 4% bufret paraformaldehyd opløsning indeholdende 4% saccharose i 40 minutter ved 4 ° C. Efter tre vaske i PBS blev dækglassene inkuberet i 30 minutter i en 50 mM NH

4CL opløsning, pH 8,0, og herefter vasket igen i PBS (3X). Ikke-specifik binding af immunglobuliner blev blokeret i 60 minutter med en PBS-opløsning indeholdende 5% BSA, 0,1% Triton X-100, 0,05% Tween 20 og 0,01% gelatine. Det næste trin var at inhibere endogen biotin under anvendelse af et biotin blokering kit (Vector Lab.), Ifølge producentens instruktioner.

Efter at celler blev inkuberet med en 1:50 fortynding af et monoklonalt muse-anti-Bcl -2 antistof, 2 ug /ml polyklonalt kanin-anti-Bax-antistof, 2 gu /ml monoklonalt muse-anti-VEGF-antistof eller 5 ug /mL survivin antistof, alle fortyndet i PBS indeholdende 3% BSA og 0,05% Tween og holdes natten over ved 4 ° C i et fugtigt kammer. Derefter blev cellerne vasket i PBS indeholdende 0,25% Tween 20 og inkuberet i 1 time med 10 ug /ml af det sekundære antistof, der er valgt til retssagen biotinyleret anti-gede-IgG, anti-kanin IgG eller anti-mus IgG. Efter dette trin blev dækglassene vasket (3 gange) med PBS /0,25% Tween og inkuberet i 1 time ved stuetemperatur med 10 ug /ml streptavidin konjugeret til Cy3. Derefter blev dækglassene vasket og derefter farvet med 0,5 ug /ml DAPI i 5 minutter. Efter to flere vaske, en med PBS og en i destilleret vand, blev dækglas monteret med Vectashield® montering medium og observeret af epi-fluorescens mikroskopi (Eclipse E-800, Nikon, Japan). DAPI-farvede dækglas blev inspiceret at udelukke muligheden for Mycoplasma forurening.

Den kvantitative analyse blev udført ved hjælp af et billede analysesystem (Image-Pro® Plus 4.5, Media Cybernetics, Inc, Silver Spring, MD, USA) bestående af et digitalkamera (Evolution, Media Cybernetics, Inc., Silver Spring, MD, USA) koblet til et fluorescensmikroskop. Billeder af høj kvalitet af celler blev fanget (2048 × 1536 pixel puffer) under anvendelse af 40 × objektivlinsen. Mindst tyve felter pr dækglas blev talt og procentdelen af ​​immunoreaktive celler blev beregnet ud fra DAPI-positive celler.

Ekspressionen af ​​Bax, Bcl-2, VEGF og survivin blev også vurderet ved Western blot under anvendelse af specifikke antistoffer . Udpladede celler blev behandlet med medium eller 50 mg /ml OA i 24 timer og hele celleekstrakter blev fremstillet som beskrevet i

Ekspression af MDR proteiner

(M M). Proteiner blev separeret ved SDS-PAGE, overført til PDF-membraner og probet med specifikke antistoffer for Bax (klon P-19, 1:1000), Bcl-2 (klon Bcl2-100, 1:500), VEGF (klon C1, 1 :100), survivin (klon ab469, 1: 1000) eller tubulin (klon b-7, 1:500). Blots blev udviklet ved anvendelse af forstærket kemiluminescens-system (ECL, Amersham, Arlington, IL) ifølge producentens instruktioner. Band intensitet blev kvantificeret ved hjælp af Scion billede Software og proteinekspression blev normaliseret i forhold til a-tubulin.

Udvikling af lunge metastase induceret af B16F10 melanomaceller

Alle dyr eksperimentelle procedurer blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra den etiske komité for Evaluering af Animal brug i eksperimenter fra IBCCF /CCS /UFRJ (CAUAP-IBCCF) og godkendt under betegnelsen, Project # 1005.

på dag 0, mandlige C57BL /6 mus (10 til 12-uger-gamle) blev injiceret i deres halevener med B16F10 melanomceller (1 × 10

6 celler /dyr). Tumor-celle-bærende mus blev inddelt i fire grupper på fem og 3 dage efter podning, behandlet dagligt i to uger (fra mandag til fredag) med 20 pi saltvand, DMSO eller OA (5 mg kg

-1 eller 10 mg kg

-1). Dosen af ​​triterpen for tredje og fjerde gruppe blev besluttet ved henvisning til en tidligere rapport [29]. Kropsvægt hver mus blev registreret hver 4 dage for at bestemme, om behandlingen påvirket dyrets sundhedstilstand. Atten dage efter inokulering af tumorcellerne blev musene aflivet ved cervikal dislokation under anæstesi med CO

2. Lungerne blev fjernet, og to uafhængige observatører bestemmes antallet af metastatiske knuder på lungerne af hver mus. Resultater udtrykkes som middel ± SD af antallet af metastaser.

Statistisk analyse

Data er præsenteret som gennemsnit ± SD. T-test blev udført under anvendelse Instat software. En værdi på

s

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

A549 og H460 cellelinjer udtrykker aktiv MRP1 pumpe

A549 og H460. cellelinjer signifikante niveauer af MDR transportproteiner [25], [26]. For at undersøge tilstedeværelsen af ​​aktive pumper i disse linjer blev celler inkuberet med fluorescens substrater for P-gp (Rho123) eller MRP1 (CFDA) i nærvær eller fravær af inhibitorer for disse proteiner og derefter det intracellulære fluorescens blev målt. Den manglende ændring i fluorescens observeret i nærvær af verapamil, en specifik P-gp inhibitor [30], og den store stigning i fluorescens opnået, når A549 og H460 blev behandlet med MK571, en specifik MRP1 inhibitor [31], viste, at disse linjer har meget lav eller ingen P-gp-aktivitet, men vise en stærk MRP1 aktivitet (figur 1).

i P-gp /ABCB1 aktivitet, A549 eller H460 celler blev inkuberet i 30 minutter med medium (aF) eller 400 nM rhodamin 123 i fravær (Rho) eller nærvær af 50 uM verapamil (VP), for MRP1 /ABCC1, celler blev inkuberet med 5 uM CFDA i fravær (CF) eller nærvær af 50 uM MK-571 (MK) . Efter vask blev cellulære fluorescens målt ved flowcytometri. Histogrammer er repræsentative for tre uafhængige forsøg udført i to eksemplarer.

oleanolsyre hæmmer levedygtighed og inducerer caspase-afhængige DNA fragmentering i NSCLC linjer

For at vurdere den cytotoksiske effekt af OA på A549 og H460, celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af OA eller med cisplatin (en traditionel kemoterapeutisk lægemiddel til NSCLC) og derefter, 48 timer senere; levedygtigheden af ​​cellerne blev målt ved en MTT assay. Oleanolsyre faldt levedygtigheden af ​​cellelinierne i en dosisafhængig måde (figur 2A). Mikroskopisk observation af cellerne foreslog, at virkningen af ​​OA skyldtes apoptose. For at udforske denne observation yderligere, blev behandlede celler inkuberet med en hypotonisk opløsning indeholdende PI og derefter en cellecyklus-analyse blev udført ved hjælp af flowcytometri (FCM). Sub-diploide populationer blev anset apoptotiske. Den øgede procentdel af fragmenterede DNA-celler og aktivering af caspase-3-aktivitet induceret af OA behandling (fig 2B og 2C), forstærket den apoptotiske karakter OA cytotoksicitet. Denne observation blev bekræftet ved AnnexinV /PI (data ikke vist).

A549 eller H460 celler blev inkuberet med forskellige OA-koncentrationer (10, 25, 40 eller 50 ug /ml eller 21,9, 54,7, 87,6 eller 109,5 uM) eller cisplatin i 48 timer. (A) Cellelevedygtighed blev vurderet ved MTT og plottet som en procentdel af cellernes levedygtighed inhibering. Resultaterne repræsenterer middelværdien ± SD af 4 eksperimenter udført i triplikat. (B) Parallelt blev celler behandlet med en hypotonisk opløsning indeholdende propidiumiodid (PI) og DNA-indhold blev analyseret ved flowcytometri. Øvre panel: repræsentativ histogram af cellecyklussen. Lavere panel: procentdel af apoptotiske sub-G1 celler. Værdier repræsenterer middel ± SD af 3 eksperimenter udført i triplikat. (C) caspase-3 aktiverede celler blev bestemt ved flowcytometri under anvendelse af et CaspGlow kit som beskrevet i M M. Histogrammer er repræsentative for to uafhængige forsøg udført i to eksemplarer.

Effekter af oleanolsyre på MDR aktivitet og udtryk

For at undersøge, om den cytotoksiske effekt af OA på A549 og H460 blev medieret af modulation af MDR pumpe, vi analyserede virkningerne af OA på MRP1 aktivitet og udtryk. Celler blev inkuberet i 30 minutter med CFDA i nærvær af forskellige koncentrationer (OA 6,25, 12,5, 25 eller 50 ug /ml) og akkumuleringen af ​​CF målt ved fluorescens. Som vist i figur 3A, har behandling med OA ikke ændre akkumulering af CF ved A549. En lille, men signifikant stigning i fluorescens blev observeret i H460, hvilket antyder, at OA kan være i stand til at modulere MRP1 aktivitet. På den anden side var det også muligt, i stedet, at OA modificerer ekspressionen af ​​MRP1. Denne mulighed blev analyseret ved FCM og western blot i celler inkuberet med medium eller OA (25 eller 50 ug /ml, hver i 24 timer og derefter behandlet med anti-MRP1. Som vist i figur 3B og 3C, ingen ændring af MRP1 ekspression var observeret.

(A) til bestemmelse MRP1 aktivitet, blev A549 eller H460 celler inkuberet i 30 minutter med medium (aF), 5 uM CFDA i fravær (CF) eller nærvær af 50 uM MK-571 (MK -571), eller med CFDA i nærvær af forskellige koncentrationer af OA (6,25, 12,5, 25 eller 50 ug /ml). Cellular fluorescens blev målt ved flowcytometri. Resultater udtrykkes som middelværdi ± SD af den gennemsnitlige fluorescensintensiteten opnået . i 3 forskellige eksperimenter udført tredobbelt * og ** angiver

s

0,05 og

s

. 0,01 henholdsvis i forhold til kontrol (CF) (B) for at bestemme MRP1 ekspression blev celler behandlet med medium eller OA (25 eller 50 ug /ml) i 24 timer før de blev høstet, permeabiliseret og inkuberet med PE-mærket anti-MRP1 i 30 minutter ved 4 ° C. efter to PBS vaskninger cellerne blev resuspenderet i FACS-opløsning og fluorescensen blev evalueret. Histogrammer er repræsentative for tre uafhængige forsøg. (C) fastlæggelse MRP1 ved western blot, blev helcelleekstrakterne opnået fra celler behandlet som beskrevet i B. Proteiner blev adskilt ved natriumdodecylsulfat (SDS) -gels, overført til PDF-membraner og probet med et antistof mod MRP1 som beskrevet i M M sektion. Tal repræsenterer band intensitet i forhold til a-tubulin.

oleanolsyre hæmmer ekspressionen af ​​proteiner involveret i at modstå apoptose og inducere angiogenese på A549-cellelinje

For at undersøge om den cytotoksiske aktivitet af OA kunne skyldes modulering af involverede veje i apoptose resistens, blev A549-celler behandlet i 24 timer med 50 ug /ml af denne triterpen og derefter ekspression af Bcl-2, Bax og survivin blev analyseret under anvendelse immuncytokemiske teknikker. Vi fandt ingen mycoplasma i dækglas forberedt til immuncytokemi. Vi observerede, at ekspressionen af ​​Bcl-2 ikke ændrede efter behandling med OA (figur 4A-B); der var en signifikant (

s

0,005) stige i Bax (figur 4C-D) og et signifikant fald (

p

0,0001) i ekspressionen af ​​survivin protein (figur 4e F). Disse resultater antydede, at behandling med OA ændret den cellulære miljø mod en apoptotisk profil, og at denne proces kan også bidrage til at reducere antallet af metastatiske foci. For at udforske denne mulighed yderligere blev virkningen af ​​OA på ekspressionen af ​​VEGF [13], en faktor involveret i celleproliferation og angiogenese, blev evalueret ved immuncytokemi. Data præsenteret i figur 4 (G-H) viste, at behandling med OA førte til en betydelig reduktion (

s

0,05) af VEGF-positive celler. Lignende resultater blev observeret, når virkningerne af OA på ekspressionen af ​​disse proteiner blev analyseret ved western blot (figur 5). Tilsammen viser disse data forstærke en eventuel inhiberende virkning af OA på lægemiddelresistens veje og udvikling af metastaser.

(øvre panel) Immunofluorescens af A549-celler farvet for Bcl2 (A-B), Bax (C-D), survivin (E-F) og VEGF (G-H). A549-celler blev behandlet med medium (A, C, E, G) eller med 50 ug /ml OA (B, D, F, H) i 24 timer, fikseret, farvet med de primære antistoffer, afslørede med biotinyleret IgG efterfulgt af streptavidin -CY3j og tæller farvet med DAPI, som beskrevet i M M. Repræsentative immunofluorescens mikrografier af tre eksperimenter. Bar: 100 um. (Nedre panel) Grafisk fremstilling af de histomorphometrical resultater af immuncytokemisk analyse. Procentdelen af ​​immunoreaktive celler blev beregnet ud fra DAPI-positive celler. Bcl-2 blev ikke moduleret af OA (p 0,05), men Bax blev signifikant forøget (*

s

0,005), mens survivin og VEGF blev faldt betydeligt efter behandling (**

p

0,0001 og ***

s

. 0,05, henholdsvis)

A549 celler blev behandlet med medium eller med 50 ug /ml oleanolsyre i 24 timer og helcelleekstrakter blev opnået som beskrevet i M M. Proteiner blev separeret ved SDS-PAGE, overført til PDF membraner, probet med antistoffer til Bcl-2, Bax, Survivin, VEGF eller α-tubulin og udviklet med ECL, som beskrevet i M M. Tallene angiver band intensitet i forhold til a-tubulin.

oleanolsyre hæmmer udviklingen af ​​melanom-induceret lunge metastase

Metastase anses generelt en tumorvækst stammer fra celler, der mistede adhærens trådte cirkulationen, og derefter overført til bestemte metastatiske nicher; i tilfælde af lungecancer, disse nicher er hjernen, leveren og knogler. I mangel af en model for metastase er specifikt for denne særlige type lungekræft, anvendte vi det melanom-model, der ofte anvendes i litteraturen til at undersøge effekten af ​​lægemidler på metastase, for at få adgang virkningerne af OA på udviklingen af ​​metastaser

in vivo

. Til dette formål blev lungemetastaser induceret af

i.v..

Inokulering af B16F10 melanomceller som tidligere beskrevet [29]. På en måde svarende til A549 og H460, disse celler også vise en aktiv MRP1 pumpe (resultater ikke vist). Begyndende 3 dage efter tumorinokulation, blev grupper af mus behandlet intranasalt i 2 uger med 10 doser PBS (kontrol) eller forskellige koncentrationer af OA (5 eller 10 mg kg

-1 day

-1). Musene blev aflivet på dag 17, og antallet af pulmonal metastaser blev talt. Den højere koncentration behandling med OA signifikant (

s

0,05). Reduceret antallet af metastaser i forhold til ubehandlede kontroller (figur 6)

Grupper af mus, der indsprøjtes i halen vener med B16F10 melanomaceller, blev behandlet med saltvand, DMSO, OA (5 mg kg

-1 dag

-1) eller OA (10 mg kg

-1 dag

-1), som beskrevet i M M snit og i det øverste panel; antallet af lunge metastase blev talt på dag 18 (nedre panel). Resultater udtrykkes som middel ± SD af antallet af metastaser. * Angiver

s

. 0,001 i forhold til kontrol (DMSO)

Diskussion

Tilstedeværelsen af ​​iboende eller erhvervet resistens over for kemoterapeutika er en stor hindring for den effektive behandling af NSCLC. Faktisk har den iagttagelse, at omkring halvdelen af ​​patienterne dør, fordi tumoren spreder sig til fjerntliggende organer blevet tilskrevet udviklingen af ​​MDR. Data præsenteret her vist, at OA modulerede faktorer involveret i apoptose modstand og ud over at være aktivt mod NSCLC linjer, der udtrykte iboende MRP1 /ABCC1 aktivitet, inhiberede udviklingen af ​​melanom-induceret lunge metastase.

Fordi MDR proteiner er findes i den normale lunge epitel, tumorer afledt af dette væv hæve niveauerne af disse proteiner efter kemoterapi eller strålebehandling [32], [33] og er ofte ufølsomme for cytotoksiske midler. Data præsenteret i dette papir viste, at OA er cytotoksisk og induceret apoptose af to NSCLC celler, der konstitutivt udtrykker MRP1 [25], [26] og nuværende høje MRP1 aktivitet (figur 1). Oleanolsyre-medieret celledød skyldes apoptose, hvilket fremgår af OA evne til at inducere fragmentering af DNA og aktivere caspase 3 (figur 2).