PLoS ONE: Angivelse af tumornekrosefaktor-alfa-medierede gener Forudsiger Gentagelse overlevelse i Lung Cancer

Abstrakt

I denne undersøgelse, vi gennemførte en meta-analyse af high-throughput genekspression data til at identificere TNF

– Restaurant a-medierede gener impliceret i lungekræft. Vi først undersøgt genekspressionsprofilerne af to uafhængige TNF-α /TNFR KO murine modeller. EGF-receptoren signalvej var den øverste pathway associeret med gener medieret af TNF-α. Efter at have tilpasset TNF-a-medieret musegener til deres menneskelige ortologer, sammenlignede vi ekspressionsmønstre af TNF-a-medierede gener i normale og tumor-lungevæv opnået fra mennesker. Baseret på TNF-a-medierede gener, der blev dysreguleret i lungetumorer, udviklede vi en prognostisk gen signatur, der effektivt forudsagte gentagelse overlevelse i lungekræft i to validering kohorter. Resampling tests foreslog, at prognostiske effekt af genet signatur ikke var tilfældigt, og multivariat analyse foreslog, at dette gen signatur var uafhængig af de traditionelle kliniske faktorer og forbedret identifikation af patienter med lungecancer i større risiko for tilbagefald.

Henvisning: Wang B, Song N, Yu T, Zhou L, Zhang H, Duan L et al. (2014) Angivelse af tumornekrosefaktor-alfa-medierede gener Forudsiger Gentagelse overlevelse i lungekræft. PLoS ONE 9 (12): e115945. doi: 10,1371 /journal.pone.0115945

Redaktør: Renato Franco, Istituto dei tumori Fondazione Pascale, Italien

Modtaget: Juli 24, 2014 Accepteret: November 26, 2014; Udgivet: December 30, 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af projektet 61271054 for National Natural Science Foundation of China og blev også støttet af projektet KYZ201320 grundlæggende forskningsmidler til centrale universiteter. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Tong Yu og Miao Zhu, to af forfatterne til manuskriptet, der i øjeblikket tilknyttet med Nanjing Decode Genomics Bioteknologi Corporation. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Tumor nekrose faktor-alpha (TNF-α) er en pleiotropisk inflammatorisk cytokin involveret i systemisk inflammation, der stimulerer den akutte fase reaktion. Dette cytokin påvirker mest menneskelige organer og er involveret i en række biologiske processer, herunder celleproliferation, differentiering, apoptose, lipidmetabolisme, og koagulation [1], [2], [3]. TNF-α fungerer også som en mediator i forskellige patologier, såsom septisk shock, transplantatafstødning, multipel sklerose, diabetes, rheumatoid arthritis, trauma, malaria, meningitis, og adult respiratory distress syndrome [4].

rolle af TNF-α i humane cancere er mere kompliceret [5], [6]. TNF-α har en dobbelt rolle i tumor induktion og progression [7]. TNF-α kan lette dannelsen og vedligeholdelsen af ​​antitumor immunresponser gennem aktivering af naturlige dræberceller og CD8 T-celler [7], [8]. TNF-α hæmmer også tumorinduceret vaskularisering ved at skade det tumor-associerede vaskulatur [9]. Desuden kan TNF-α direkte påvirke tumorceller ved at øge lysosomale enzymer og inducere cytochrom c-frigivelse fra mitochondrier og apoptose [10].

Selvom TNF-α har antitumoraktivitet, er der voksende beviser på, at endogen TNF-α virker som en tumor promotor. TNF-α har været kendt for at bidrage til kronisk inflammation og fremme tumordannelse, vækst og metastase [7], [11]. Det er også blevet observeret, at TNF-α knockout (KO) mus var mere modstandsdygtige over for kemisk carcinogenese af hudtumorer [12], [13]. Derudover mus deficient i TNF-receptor type 1 (TNFR-1) og TNF-receptor type 2 (TNFR-2) var resistente over for udvikling af hudtumorer [14], og knockdown af TNF-α i æggestokkene cancercellelinier medførte mindsket vækst og vaskulær densitet [15]. For nylig Pitroda et al. undersøgte rollen af ​​TNF-α-medieret stromal inflammation i tumorvækst. De fandt, at afbrydelse af stromal TNF-α signalering væsentligt forringet væksten af ​​tumorer i TNF-α receptor (TNFR) KO-mus sammenlignet med den i vildtype (WT) mus [16]. Baseret på denne forsøgsmodel af TNF-α-medieret inflammation og high-throughput genekspression data, de har også udviklet en prognostisk gen signatur, forudsagde overlevelsen i humane cancere [16].

Lungekræft er den hyppigst diagnosticeret cancer og er den hyppigste årsag til kræft dødsfald hos mænd, omfattende 17% af de samlede tilfælde nye kræft og 23% af de samlede kræftdødsfald [17]. I denne undersøgelse har vi udført meta-analyse på high-throughput ekspression microarray data til identifikation af TNF

– Restaurant a-associerede gener, der blev impliceret i lungekræft. Først identificerede vi generne potentielt reguleres af TNF-α og TNF-receptorer. Brug to uafhængige microarray datasæt, vi karakteriseret de fælles gener dysreguleret i TNF-α KO og TNFR KO mus. Vi anså disse gener som TNF-a-associerede gener. For det andet har vi udviklet et prognostisk gen signatur afledt af TNF-a-associerede gener, og vi matchede TNF-a-associerede gener i mus til deres menneskelige ortologer. Vi sammenlignede derefter ekspressionen af ​​humane TNF-a-associerede gener i normale og tumorvæv af to lungekræft kohorter. Sytten TNF-α-associerede gener blev identificeret som værende almindeligt differentielt udtrykt mellem de to grupper; Derfor er disse gener består en multi-molekylær cancer resultat prædiktor. Denne molekylære signatur effektivt forudsagt gentagelse overlevelse i lungekræft og var uafhængig af de standard kliniske og patologiske prognostiske faktorer.

Resultater og Diskussion

TNF-a-associerede gener

Vi først undersøgt generne potentielt reguleres af TNF-α og dens receptorer. TNF-α binder to receptorer, TNFR1 og TNFR2. TNFR1 udtrykkes i de fleste væv, hvorimod TNFR2 findes kun i celler i immunsystemet. To uafhængige microarray datasæt indeholdende genekspression information til både WT og TNF-α /TNFR KO-mus blev indsamlet fra Gene Expression Omnibus (GEO) database [18]. Vi sammenlignede genekspression mønstre af gastriske tumorer i WT og TNF-α KO mus (GEO tiltrædelse ID: GSE43145) og af melanomer af WT og TNFR KO mus (GEO tiltrædelse ID: GSE33253) [16]. På et 5% falsk opdagelse sats (FDR), 390 gener var almindeligt opreguleret sammenlignet med WT mus i begge datasæt (S1 tabel). I modsætning hertil blev 305 gener fundet at være almindeligt nedreguleret sammenlignet med WT-mus (S1 Table). Vi anså disse dysregulerede gener TNF-α-medierede gener. Pathway-analyse under anvendelse PANTHER databasen [19] viste, at den øverste pathway forbundet med disse dysreguleret gener var “EGF-receptor-signalvejen” (

P

= 0,029 ved Fishers eksakte test) (S2 tabel), hvilket tyder på en stærk forbindelse mellem TNF-α og epidermal vækstfaktor receptor (EGFR). EGFR er et medlem af ErbB-familien af ​​receptorer. Ændring i EGFR kan resultere i kræft [20], herunder lungekræft, anal kræft, og glioblastoma multiforme. TNF-α er et centralt regulator af flere inflammatoriske signalveje, og et vigtigt mål for TNF-α kan være signalvejen nedstrøms for EGFR [21]. Faktisk har TNF-α blevet vist at inducere EGFR transaktivering i en række forskellige celler [22], [23], [24].

For at bestemme om TNF-a-medierede gener afledt fra mus var relevante til humane cancere, vi matchede TNF-a-medieret musegener til 651 forskellige humane ortologer. Dernæst analyserede vi de ekspressionsmønstre for disse TNF-a-medieret humane gener i lungekræft. Vi udforskede forskellen i genekspression mellem normale og tumorvæv i to uafhængige lungekræft kohorter fra Spanien (ES [GEO tiltrædelse ID: GSE18842]) [25] og Taiwan (TW [GEO tiltrædelse ID: GSE19804]) [26]. En parret t-test blev anvendt til at identificere de differentielt udtrykte gener mellem de normale og tumorvæv (Fig. 1). I alt blev 232 TNF-α-medierede gener identificeres som værende almindeligt differentielt udtrykt mellem de normale og tumorvæv (justeret

P

0,05 og fold forandring 1,25) i begge kohorter (S3 tabel). Et hundrede og tyve-ni TNF-α-medierede gener var opreguleret i tumorvæv, mens 103 TNF-α-medierede gener blev nedreguleret (S3 tabel). For at undersøge i hvilke funktionelle kategorier disse gener falder, vi gennemførte gen ontologi analyse ved hjælp af GO-databasen [27]. Vi fandt, at disse gener blev væsentligt beriget af GO biologisk proces termer, såsom “makromolekyle kataboliske proces”, “tRNA aminoacylering”, og “ubiquitin-afhængigt protein katabolisk proces” (S4 tabel).

Forbundne normal og tumorvæv fra patienter med lungecancer i ES og TW kohorter blev inkluderet i sammenligningen. Y-akse: log2-transformerede udtryk værdier

En 17-gen signatur forudsiger gentagelse overlevelse i lungekræft

Vi hypotese, at den 232 differentielt udtrykte TNF-α-medieret. gener kan forudsige tumor resultat i lungekræft. Univariate Cox proportionel risiko regressions mod tilbagefald overlevelse blev gennemført over 232-genet sæt i en uddannelse kohorte fra Korea (KR [GEO tiltrædelse ID: GSE8894]) [28]. Kun gener med absolutte værdier af Wald statistik (forholdet regressionskoefficienten til standardfejlen) større end to blev tilbageholdt. I alt vi identificeret 17 TNF-a-medierede gener forbundet med lungekræft tilbagefald overlevelse i uddannelsen kohorte. Vi har udpeget de 17 TNF-a-medierede gener som 17-genet signatur (fig. 1 og tabel 1).

Vi anvendte et pointsystem til at tildele hver patient en gentagelse score, der var en lineær kombination af ekspressionen af ​​17-genet signatur vægtet med koefficienterne opnået fra træning kohorte (se Fremgangsmåder til detaljer) [16], [29], [30], [31]. Vægten for hvert gen er angivet i tabel 1. De 17-gen-positive patienter blev defineret som dem, der har en gentagelse score større end gruppen medianen. Som forventet var der en signifikant reduceret gentagelse overlevelse for de 17-gen-positive patienter i uddannelse kohorten (fig. 2). De 17-gen positive patienter havde en signifikant øget risiko for gentagelse af 2,95 gange i KR-kohorten (tabel 2).

gentagelse score på 17-genet signatur forudsiger dårlig klinisk resultat i lungekræft. De sorte kurver er for de 17-gen-signatur-positive patienter, mens de grå kurver er for de 17-gen-signatur-negative patienter. De 17-gen-signatur-positive patienter blev defineret som dem, der har en gentagelse score større end den gruppe, median score.

P

-værdier blev beregnet ved hjælp af log-rank test for forskelle i overlevelse. Det venstre panel viser uddannelse kohorte (KR), mens de midterste og højre paneler viser validering kohorter (JP og SE).

Vi næste undersøgte den prognostiske effekt af gentagelse score, blev bestemt under anvendelse af 17-genet signatur i uafhængig validering kohorter. To validering kohorter fra Japan (JP [GEO tiltrædelse ID: GSE31210]) [32] og Sverige (SE [GEO tiltrædelse ID: GSE37745]) [33] blev indsamlet. Kaplan-Meier overlevelse analyse viste en signifikant reduceret gentagelse overlevelse for de 17-gen-positive patienter i validerings- kohorter (

P

= 5,4 × 10

-5 til JP-kohorten og

P

= 0,011 for SE kohorten ved log-rank test) (fig. 2). Univariate Cox proportional hazards regression viste, at 17-gen-positive patienter havde en signifikant øget risiko for fornyet 2,67-fold i JP kohorte og 2,08 gange i SE-kohorten (tabel 2). Disse resultater viste, at 17-genet signatur er prædiktive for tilbagefald overlevelse i lungecancere.

Vi undersøgte også den prognostiske strøm til hvert gen i 17-genet signatur i JP kohorte, som er den største kohorte i denne undersøgelse. Patienterne blev stratificeret i to grupper efter ekspressionsniveauet af hvert gen, ved hjælp af medianen som cutoff. Vi identificerede tre gener,

HNRNPAB

,

PPIL1

, og

SRPK1

, som kan bruges til at forudsige tilbagefald overlevelse individuelt (justeret

P

.. 0,05 ved log-rank test) (S1 fig)

Faktisk blandt de 17-gen sæt,

ABCE1

,

CKS1B

,

HNRNPAB

,

PCDH7

,

PPIL1

, og

SRPK1

allerede er blevet rapporteret til at spille en vigtig rolle i kræft patogenese. For eksempel tavshed

ABCE1

af små interfererende RNA kan hæmme proliferation og invasiv af småcellet lungekræft-cellelinjer [34].

CKS1B

-depleted brystkræftceller ikke kun udstilling bremset G (1) progression, men disse celler også ophobes i G (2) -M grund blokeret mitotisk indgang [35].

HNRNPAB

viste sig at være overudtrykt i stærkt metastatiske celler og tumorvæv fra patienter med hepatocellulært carcinom med recidiv [36].

PCDH7

var opreguleret i knogle metastatisk brystkræft væv, og undertrykkelse af

PCDH7

hæmmede brystcancercelleproliferation, migration og invasion in vitro [37].

PPIL1

blev observeret at være hyppigt overudtrykt i colon cancerceller sammenlignet med noncancerous epitelceller i colon mucosa [38]. Mere interessant, kan afvigende

SRPK1

ekspression i begge retninger fremme kræft ved at interferere med PHLPP-medieret dephosphorylering af Akt [39]. I denne undersøgelse har vi vist, at selv om den prognostiske effekt af 17-genet signatur er overlegen, de enkelte gener, såsom

HNRNPAB

,

PPIL1

, og

SRPK1,

kan bruges som individuelle biomarkører til at forudsige tilbagefald overlevelse.

resampling test for 17-genet signatur

Vi har udført en resampling test for at afgøre, om den prædiktive effekt af 17- gen signatur var signifikant bedre end tilfældige gen sæt. Vi konstruerede 1.000 tilfældig gen signaturer, som hver indeholder 17 gener, der blev tilfældigt udvalgt fra det humane genom. Gentagelse scoringer blev beregnet på grundlag af de randomiserede gen underskrifter, og univariate Cox proportionel risiko regressions for overlevelse blev udført for hver resampled gen signatur. Sammenhængen mellem de enkelte tilfældige gen underskrift og tilbagefald overlevelse blev målt ved hjælp af Wald statistik. Vores alternative hypotese var, at Wald statistik værdien af ​​vores 17-genet signatur bør være højere end den af ​​de randomiserede gen signaturer, hvis 17-genet signatur var mere prædiktiv end de randomiserede signaturer. Fig. 3 angiver, at Wald statistik af de 17-genet signatur var signifikant højere end for de randomiserede gen signaturer (

P

= 0,045 for JP kohorten og

P

= 0,009 for SE-kohorten ), hvilket tyder på, at associationen mellem 17-genet underskrift og tilbagefald overlevelse er ikke tilfældigt.

de sorte romber angiver Wald statistik over 17-genet signatur. De grå histogrammer viser fordelingen af ​​Wald statistik for de 1.000 resamples gen signaturer med samme størrelse under nulhypotesen af ​​ingen sammenhæng mellem 17-genet underskrift og tilbagefald overlevelse.

En tidligere offentliggjorte undersøgelse af Venet et al. sammenlignet 47 prognostiske brystkræft underskrifter til underskrifter fra tilfældige gener [40]. Det blev konstateret, at -60% af underskrifterne ikke var signifikant bedre resultat prædiktorer end randomiserede underskrifter fra ens størrelse, og ~23% var værste prædiktorer end medianen tilfældige signatur [40]. Derfor er det ikke muligt at konkludere, at en bestemt mekanisme er forbundet med human cancer fra konstateringen af, at et gen signatur for denne mekanisme forudsiger kræft resultat, fordi de fleste randomiserede signaturer gør [40]; Men her, vi angiver, at vores 17-genet signatur overvinder dette problem.

multivariatanalyse

Vi undersøgte udviklingen i det 17-genet signatur i sammenligning med kliniske faktorer i forbindelse med lungecancer udfald . For JP kohorte, vi betragtede faktorer, herunder patientens alder, køn, rygning historie, scene,

EGFR-service /

KRAS-service /

ALK

gen ændring status, og Myc proteinniveau . I JP kohorte, scene og

EGFR-service /

KRAS-service /

ALK

gen ændring status kan individuelt forudsige tilbagefald overlevelse (S2 Fig.). For SE kohorte, tog vi alder, køn, og scene i betragtning. Dog kan ingen af ​​disse faktor i SE-kohorten individuelt forudsige tilbagefald overlevelse. En multivariat Cox proportional hazards regression af overlevelse viste, at 17-genet signaturstatus forblev en signifikante variabel i forhold til de kliniske faktorer i hvert validering kohorte (

P

= 3,4 × 10

-3 til JP kohorte og

P

= 2,5 × 10

-2 for SE-kohorten) (tabel 3). I JP kohorte, patientens alder, scene, og

EGFR-service /

KRAS-service /

ALK

ændring status var også betydelige variabler. Men i SE kohorte, den 17-genet signaturstatus var den eneste signifikante covariant i den flerdimensionale model (tabel 3). Disse resultater tyder på, at 17-genet signatur er stort set uafhængig af de traditionelle kliniske faktorer og forbedrer identifikationen af ​​lungecancerpatienter i større risiko for tilbagefald.

17-genet signatur blev afledt fra en “hypotese-drevet” metode i stedet for hele genomet screening. Traditionelt blev den prognostiske effekt af de individuelle gener i humane genom testet én efter én. Generne med den bedste statistisk signifikans vil blive bevaret og anvendes som cancer biomarkører. Men statistisk afledte gen underskrifter fra hele genomet screening er ofte meget præcise i opdagelsen kohorter, hvorfra de blev identificeret, men de fleste af dem er ikke blevet valideret som nyttige kliniske redskaber [41], [42]. I denne undersøgelse har vi først den hypotese, at TNF-α er impliceret i lungekræft. Så vi pre-identificeret de gener, der er potentielt medieret af TNF-α /TNFR hjælp TNF-a /TNFR KO-mus. Multivariat analyse viser, at denne metode “bottom-up” giver et gen sæt med lovende forudsigelseskraft, som tilføjer prognostisk værdi for kliniske og patologiske fund i lungekræft.

Konklusioner

Vi undersøgte det gen udtryk profiler af to uafhængige TNF-α /TNFR KO murine modeller. EGFR signalvej viste sig at være den øverste pathway associeret med gener medieret af TNF-α. Baseret på TNF-a-medierede gener fundet i murine modeller, udviklede vi en prognostisk gen signatur, der effektivt forudsagte gentagelse overlevelse i lungekræft i to validering kohorter. Når du arbejder kooperativt med kendte traditionelle kliniske faktorer, kan 17-genet signatur forbedre forudsigelse nøjagtighed til at identificere patienter med højere risiko for recidiv.

Metoder

Microarray databehandling

Alle de mikroarraydata analyseret i denne undersøgelse blev opnået fra GEO database [18]. GC robust multichip gennemsnit (GCRMA) algoritme [43] blev anvendt til at opsummere ekspressionsniveauet af hver probe fastsat for microarray data. Betydningen analyse af microarrays (SAM) algoritme [44] blev anvendt til at identificere de differentielt udtrykte gener mellem WT og TNF-a /TNFR KO-mus. En parret t-test blev anvendt til at påvise de differentielt udtrykte gener mellem de normale og tumor humane lungevæv.

P

-værdier blev justeret ved hjælp af Benjamini-Hochberg procedure.

Risk pointsystem

Til træning kohorte (KR), univariate Cox proportionel risiko regressions blev brugt til at evaluere sammenhængen mellem gentagelse overlevelse og genekspression. En fornyet score blev derefter beregnet for hver patient ved anvendelse af en lineær kombination af genekspression, der blev vægtet med den Wald statistik (forholdet regressionskoefficienten til standardfejlen), som vist nedenfor [16], [29], [30], [31]:

Her

S

er en gentagelse score af patienten;

n

er antallet af gener;

Z

Jeg

betegner Wald statistik af gen

i

(angivet i tabel 1);

e

Jeg

betegner ekspressionsniveauet af gen

jeg

; og

μ

Jeg

og

τ

jeg

er middelværdien og standardafvigelsen af ​​genekspression værdier for gen

i

tværs af alle prøver. Patienterne blev derefter opdelt i positive og negative grupper, med medianen af ​​tilbagefald score som cutoff. En højere recidiv score indebar en dårligt resultat. Pointsystemet og de tilknyttede skalering koefficienter fastsat baseret på uddannelsesmæssige kohorter og derefter evalueret i validerings- kohorter [16], [29], [30], [31].

Statistisk værktøj

Alle statistiske analyser blev udført af R-platformen. “Overlevelse” bibliotek blev anvendt til at gøre overlevelse analyse. Den statistiske signifikans mellem to Kaplan-Meier-kurver blev bestemt ved log-rank test ved “survdiff” -funktionen. Både univariate og multivariate Cox proportionel risiko regressions blev gennemført af “coxph” funktion.

Støtte Information

S1 Fig.

udtryk for

HNRNPAB

,

PPIL1

, og

SRPK1

forudsiger gentagelse overlevelse individuelt. Patienterne i JP kohorten blev stratificeret i to grupper efter ekspressionsniveauet af hvert gen, ved hjælp af medianen som cutoff. De sorte kurver er for patienterne genekspression højere end medianen, mens de grå kurver er for de andre patienter

doi:. 10,1371 /journal.pone.0115945.s001

(PDF)

S2 Fig .

Stage og

EGFR-service /

KRAS-service /

ALK

gen ændring status individuelt forudsige gentagelse overlevelse i JP-kohorten. Den venstre panel er for scenen. Den sorte kurve er for patienter med stadie II, mens den grå kurve er for patienter med stadie I. højre panel er til gen-ændring status. Den sorte kurve er for patienter uden ændring, mens den grå kurve er for patienter med ændring.

P

-værdier blev beregnet ved hjælp af log-rank test for forskelle i overlevelse

doi:. 10,1371 /journal.pone.0115945.s002

(PDF)

S1 Table.

Generne almindeligvis udtrykkes forskelligt mellem WT og TNF-α /TNFR KO mus

doi:. 10,1371 /journal.pone.0115945.s003

(XLSX)

S2 Table. .

Den øverste 10 PANTHER veje er forbundet med de dysregulerede gener i TNF-a /TNFR KO mus

doi: 10,1371 /journal.pone.0115945.s004

(XLSX)

S3 Table. Salg The TNF-a-medierede gener, der udtrykkes forskelligt mellem de normale og tumorvæv

doi:. 10,1371 /journal.pone.0115945.s005

(XLSX)

S4 Table. Salg The GO biologisk proces vilkår forbundet med TNF-a-medierede gener, der er dysreguleret i tumorvæv

doi:. 10,1371 /journal.pone.0115945.s006

(XLSX)