PLoS ONE: Multidrug-resistens i forbindelse Lang Ikke-Coding RNA Expression Profil Analyse af gastrisk Cancer

Abstrakt

Effekten af ​​kemoterapi af mavekræft (GC) er fortsat meget ringe på grund af multiresistens (MDR). Men mekanismerne bag MDR GC stadig langt fra fuldt forstået. Formålet med denne undersøgelse er at belyse de potentielle mekanismer i MDR af GC på hovedsagelig den lange ikke-kodende RNA (lncRNA) niveau. I denne undersøgelse blev GC-cellelinie, SGC7901, og to MDR underlinjer, SGC7901 /VCR og SGC7901 /ADR underkastes en lncRNA microarray analyse. Bioinformatik og verifikation eksperimenter blev udført for at undersøge de potentielle lncRNAs involveret i udviklingen af ​​MDR. Pathway analyse viste, at 15 veje svarede til down-regulerede udskrifter, og at 20 veje svarede til up-regulerede udskrifter (p-værdi cut-off er 0,05). GO analyse viste, at de højeste beriget GOs målrettet med op-regulerede udskrifter var “systemudvikling”, og de højeste esenriched GOs er omfattet af de ned-regulerede udskrifter var “sterol biosyntetiske proces”. Vores undersøgelse er den første til at afhøre differentielt udtrykte lncRNAs i human GC cellelinje og MDR underlinjer og indikerer, at lncRNAs er umagen værd for yderligere undersøgelse at være den nye kandidat biomarkører for den kliniske diagnose af MDR og potentielle mål for yderligere behandling.

Henvisning: Wang Y, Wu K, Yang Z, Zhao Q, Fan D, Xu P, et al. (2015) Multidrug-resistens i forbindelse Lang Ikke-Coding RNA Expression Profil Analyse af Gastric Cancer. PLoS ONE 10 (8): e0135461. doi: 10,1371 /journal.pone.0135461

Redaktør: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, UNITED STATES

Modtaget: December 24, 2014 Accepteret: 22 Juli 2015; Udgivet: 20 August, 2015

Copyright: © 2015 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle de rå data og normaliserede data blev vist i https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE69342 (GSE69342)

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Program på Key Basic Research Project ( “973” Program, No. 2010CB529302, No. 2010CB529305, No. 2010CB529306); National Natural Science Foundation of China (nr 81.301.763); Henan provins centrale videnskabelige og teknologiske projekter (nr 142.102.310.473); Key Program, National Natural Science Foundation of China (nr 81.030.044)

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

multiresistens ( MDR) er fortsat en væsentlig hindring for kemoterapi svigt i behandlingen af ​​gastrisk cancer, som er en førende årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan. Flere multilægemiddelresistens-associerede proteiner (MRPs) [1] eller miRNA [2], at mediere MDR gennem forskellige mekanismer er blevet identificeret tidligere. Men mekanismerne bag MDR GC stadig langt fra fuldt klar.

genomer sekventering viste, at eukaryote genomer indkode et overraskende stort antal ikke-kodende udskrifter sammenlignet med prokaryote genomer. Blandt disse ikke-kodende transkripter, mange er lange ikke-kodende RNA’er (lncRNAs), som spiller vigtige roller i regulering mRNA-transkription eller translation på transkriptionelle eller post-transkriptionelle niveau. lncRNAs er RNA, som mangler kodning potentiale, som er 200 bp og tegner sig for mindst 80% af udskrifter af hele genomet [3]. Akkumulerende data viser, at lncRNA spiller vigtige roller i reguleringen af ​​mRNA [4], organel biogenese [5], den subcellulære handel med molekyler [6], og celle udvikling [7] [8].

LncRNA dysregulering var involveret i flere typer af sygdomme, herunder kræft

[

4

,

9

,

10

]. Nemlig, kan lncRNAs spiller vigtige roller i carcinogenese, metastase og invasivitet af flere maligne tumorer gennem påvirker onkogen ekspression. For eksempel kan COX-2-lncRNA, PACER, fungere som ny potentielt mål for COX-2-modulation i inflammation og cancer [11]; RNAi-medieret knock-down af LINC01081 i normale føtale lungefibroblaster viste, at dette positivt lncRNA regulerer FOXF1 udskrift niveau, yderligere indikerer, at faldet i LINC01081 udtryk kan bidrage til udvikling af alveolær kapillær dysplasi med forskydning af pulmonale vener [12]; lncRNA hotair kan også være en værdifuld indikator for tyktarmskræft forvaltning [13] og MALAT1 kan betragtes som en potentiel prognostisk indikator og kan være et mål for diagnose og genterapi for pancreas kanalen adenocarcinom [14]; overekspression af lncRNA H19 øger carcinogenese og metastase af mavekræft og virkningen af ​​H19 i GC medieres af direkte opregulering af ISM1 og indirekte undertrykkelse af CALN1 ekspression via MIR-675 [15]. Derfor, for at få indledende indsigt i de molekylære mekanismer i MDR af GC, vi studerede lncRNA udtryk profil GC MDR underlinjer.

Her studerede vi det differentielt udtryk profiler af lncRNAs og mRNA mellem GC cellline SGC7901 og MDR underlinjer SGC7901 /ADR og SGC7901 /VCR ved hjælp lncRNA microarray analyse. Sammenligning af differentielt udtrykte udskrifter mellem underlinjer og forældrenes cellline afslørede 15 veje, der svarede til down-regulerede udskrifter og 20 veje, der svarede til opreguleret udskrifter (p-værdi cut-off var 0,05). Gene ontologi (GO) analyse viste, at de mest højt beriget GO vilkår for de up-regulerede udskrifter var “systemudvikling”, “nukleosom”, og “bindende”, og de mest højt beriget GO vilkår for de ned-regulerede udskrifter var “sterol biosyntetiske proces “,” celle periferi “og” steroid dehydrogenase aktivitet “. Vores resultater viste, at lncRNA og mRNA udtryk profiler afveg betydeligt mellem MDR underlinjer og forældrenes cellelinie. Dette fund tyder på, at de afvigende ekspressionsniveauer af lncRNAs kan bidrage til udviklingen af ​​MDR af GC. Yderligere undersøgelse af forskellene i lncRNA udtryk profiler kan give nye potentielle metoder til at vende MDR fænotype af GC.

Resultater

differentielt udtrykte lncRNAs

De microarray data highthroghput lncRNA viste en alt 27,883 lncRNAs udtrykt i mavekræft cellline, SGC7901 og to multidrug resistens underlinjer, SGC7901 /ADR og SGC7901 /VCR (S1 tabel). For at udlede relationer mellem prøver, var hierarkisk clustering analyse bruges til at arrangere celllines i grupper efter deres ekspressionsniveauer, præsentere relationer de lncRNA udtryk tilstande mellem celllines (Fig 1A og 1B). Yderligere undersøgelse af disse data udviste i gennemsnit 1637 differentielt udtrykt lncRNA. Blandt dem, 638 var konsekvent opreguleret og 999 blev konsekvent nedreguleret (fold change≥2.0) (S2 tabel). ASHG19A3A028863 (fold ændring: 146,0139) var den mest up-regulerede lncRNA, og ASHG19A3A007184 (fold ændring: 58,7105) var den mest nedreguleret lncRNA. Desuden nedreguleret lncRNAs var mere udbredt end opreguleret lncRNAs i vores microarray data (S2 tabel).

A. Den scatterplot af lncRNA ekspressionsprofil. B. Heat kort og hierarkisk klyngedannelse dendrogram af lncRNA chips.

differentielt udtrykte mRNA

Der var 19,644 mRNA identificeret i GC MDR underlinjer analyseret af mRNA-ekspression profilering data ved hjælp af microarray analyse og den Hierarkisk klyngedannelse analysen forholdet mellem de mRNA ekspression tilstande, der var til stede i GC MDR underlinjer og deres forældres cellelinie (fig 2A og 2B) (S3 tabel). Blandt de differentielt udtrykte mRNA mellem SGC7901 /ADR, SGC7901 /VCR og SGC7901, 730 var konsekvent opreguleret og 650 var konsekvent nedreguleret i SGC7901 /ADR og SGC7901 /VCR celllines forhold SGC7901 (Fig 2B). (S4 tabel). NM_000735 (gen symbol: CGA, fold ændring: 106,19) var den mest up-regulerede mRNA, og NM_001136574 (gen symbol: LANCL1, fold ændring: 25,43) var den mest nedreguleret mRNA (Fig 2B)

A. Heat kort og hierarkisk clustering dendrogram af mRNA chips. B. Forms viser top 10 differentielt udtrykte mRNA.

GO analyse

For at bestemme gen og gen-produkt attributter i biologiske processer, cellulære komponenter og molekylære funktioner, Gene ontologi (GO) analyse blev udført hermed. Fishers eksakte test er gjort for at teste, om der er mere overlap mellem DE listen og GO annotation listen end det kunne forventes ved en tilfældighed. Den p-værdi angiver betydningen af ​​GO vilkår berigelse i DE generne. Jo lavere p-værdi, jo mere markant GO Term (p-værdi = 0,05 anbefales). Den viste, at de højest beriget GOs målrettet med op-regulerede udskrifter var vævshomeostase (GO: 0.048.731; ontologi: biologisk proces; p = 6.84E-08) (fig 3A), nukleosom (GO: 0.000.786; ontologi: cellulære komponent; p = 2.10E-07) (fig 3B) og bindende (GO: 0.005.488; ontologi: molekylær funktion; p = 0,001) (fig 3C), og at de højest beriget GOs er omfattet af de ned-regulerede udskrifter var sterol biosyntetiske proces (GO: 0016126; ontologi: biologisk proces; p = 0,000) (fig 3D), celle periferi (GO: 0.071.944; ontologi: cellulære komponent; p = 3.80E-06) (fig 3E) steroid dehydrogenase aktivitet (GO: 0.016.229; ontologi: molekylær funktion. p = 0,001) (fig 3F) (S5 Table)

lagkagediagram viser de ti bedste tællinger af de betydelige berigelse vilkår. Den ontologi dækker tre domæner: biologisk proces, Cellular komponent- og Molekylær Funktion. Fishers eksakte test bruges til at finde, hvis der er mere overlap mellem DE listen og GO annotation listen end det kunne forventes ved en tilfældighed. Den p-værdi angiver betydningen af ​​GO vilkår berigelse i DE generne. Jo lavere p-værdi, jo mere markant GO Term (p-værdi = anbefales 0,05) (AC) De højest berigede GOs målrettet med op-regulerede udskrifter: A, Biologisk proces (BP), B, Cellular komponent ( CC), C, Molecular funktion (MF). (DF) De højest berigede GOs målrettet med ned-regulerede udskrifter: A, Biologisk proces (BP), B, Cellular komponent (CC), C, Molecular funktion (MF)

Pathway analyse

i denne undersøgelse pathway analyse udviste at 20 veje konsekvent svarede til opregulerede transkripter og at det mest berigede netværk var “Alkoholisme-Homo sapiens (humane)” (Fisher-P-værdi = 3.66E-08) bestående 24 målrettede gener (fig 4A); desuden vejen analyse viste også, at 15 veje konsekvent svarede til nedregulerede transkripter og at det mest berigede netværk var “Steroid biosyntese-Homo sapiens (humane)” (Fisher-P value = 0,00044) bestående af 5 målrettede gener (Fig 4B ) (S6 tabel, den anbefale p-værdi cut-off er 0,05). Blandt disse veje har genet kategorien “døgnrytmen” forstyrrelse blevet rapporteret at være forbundet med forskellige cancere, herunder mavecancer [16], kronisk myeloid leukæmi [17], hoved og hals pladecellecarcinom [18], hepatocellulært carcinom [19 ], endometrisk carcinom [20], og brystkræft [21]. Genet kategorien “NOD-lignende receptor-signalvejen”, som består af NOD1, er blevet vist, at NOD1 /card4 og NOD2 /CARD15 genet polymorfismer kan være forbundet med ændret risiko for gastrisk [22], kolorektal [23], lunge [24 ], larynx [25], galdeblæren [26], pancreas [27], tyndtarm, nyre [28], urinblære kræft [29], hudcancer, lymfom [30] og leukæmi [31]. Her har vi undersøgt yderligere udtryk og funktion af Arnt (aryl kulbrinte receptor nukleare translokatoren) medieret MDR1 (multiresistens 1) opregulering vej. Det konstateredes, at Arnt og MDR1 var signifikant opreguleret i SGC7901 /ADR og SGC7901 /VCR cellelinjer sammenlignet med SGC7901 blev virkningen af ​​signifikant opregulering af MDR1 medieret af Arnt ekspressionsvektor transfektion kompromitteret via Sp1 siRNAs transfektion. Plate kolonidannelse assay viste, at SGC7901 /ADR celle kolonidannelse satser var remarably højere i pARNT + /siSp1- gruppen sammenlignet med pARNT + /siSp1 + gruppe med tillægget adriamycin (ADR) i kulturen Meida (p 0,0001) (fig 5).

(A) Pathway: Alkoholisme-Homo sapiens (menneske). (B) Pathway: Steroid biosyntese-Homo sapiens (menneske) .Den bar plot viser top ti Berigelse score (-log10 (P-værdi)) værdien af ​​den signifikante berigelse vej. Gul markerede noder er forbundet med ned-regulerede gener, orange markerede noder er forbundet med opreguleret eller kun hele datasæt gener, grønne knudepunkter har ingen betydning.

(A) udtryk for Arnt, MDR1 og Sp1, en, western blotting, b, QRT-PCR. (B) Effekten af ​​siARNT transfektion på ekspressionen af ​​Arnt, MDR1 og Sp1, en, western blotting, b, QRT-PCR af SGC7901 /ADR, c, QRT-PCR af SGC7901 /VCR. (C) Effekten af ​​pARNT (Arnt udtryk vektor) og siSp1 transfektion på ekspressionen af ​​Arnt, MDR1 og Sp1, en, western blotting, b, QRT-PCR af SGC7901 /ADR. (D) Plate kolonidannelse assayet af SGC7901 /ADR-celler med adriamycin supplement i dyrkningsmediet (1 pg /ml) på det angivne tidspunkt. (Data var hjælp af tre separate eksperimenter (middel ± SEM), envejs ANOVA analyse, *** p 0,0001)

Real time kvantitativ PCR validering

Til. undersøge microarray data, seks opreguleret lncRNAs og ti under-regulerede lncRNAs blev tilfældigt udvalgt fra de konsekvent differentielt udtrykte lncRNAs hjælp SGC7901 /ADR, SGC7901 /VCR og SGC7901 cellelinier og QRT-PCR resultater og microarray data er konsistente (fig 6A ); for yderligere at undersøge ekspressionsniveauerne af de disse lncRNAs i lægemiddelresistente gastriske væv, tyve lægemiddelresistente gastriske prøver og parret ikke multiresistente væv blev undersøgt for ekspressionsniveauet af disse lncRNAs ved brug af kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) (fig 6B) .De resultaterne viste, at mavekræft prøver behandlet med ADR i 5 dage udstillet signifikant forskel i ekspressionsniveauer af disse seksten lncRNAs afformentioned sammenlignet med kontrolgrupper (fig 6C). Desuden viste korrelationsanalyse at lncRNA NR_015379 ekspressionsniveauerne negativt blev korreleret med hæmning satserne for disse tyve resistente gastriske prøver (Fig 6D og 6E, p 0,01).

(A) Seksten lncRNAs ekspressionsniveauerne i SGC7901 /ADR og SGC7901 /VCR celllines sammenlignet med SGC7901 cellelinie. (B) Skematisk diagram af mavekræft prøver behandlet med HDRA efterfulgt af QRT-PCR og hæmning rate assay. (C) Seksten lncRNAs ekspressionsniveauerne i tyve mavekræft prøver behandlet med ADR sammenlignet med kontrolgrupper. (DE) lncRNA NR_015379 ekspressionsniveauerne var negativt korreleret med hæmning satser mavekræft prøver behandlet med ADR.

diskussion

Vores tidligere forskning har allerede konstateret, at miR-21 kan fremme lægemiddelresistens af forskellige kræftformer [32 ]; LncRNA-MRUL fremmer ABCB1 udtryk i multiresistente gastrisk cancer celle underlinjer [33]; CUTL1 aktivitet er omvendt forbundet med lægemiddelresistens og således er et attraktivt terapeutisk mål til modulering multilægemiddelresistens i gastrisk cancer [34]; gastrisk CSCS blev identificeret fra VCR-klargjort SGC7901 cellelinie, kendetegnet ved høj tumorigenicitet og evnen til selv-fornyelse og differentiering [35]; MAD2 kan spille en vigtig rolle i udviklingen af ​​human gastrisk cancer og at tavshed MAD2 gen kan bidrage til at håndtere den multilægemiddelresistens af gastriske cancerceller [36] og hypoxi-fremkaldte MGr1-Ag /37LRP ekspression aktiveret af HIF-1 afhænger på ERK-aktivering. Disse begivenheder er afhængige af reaktive oxygen mellemprodukter [37] .Men de multilægemiddelresistens mekanismer GC er langt mere belyst og lncRNAs dysregulering af GC MDR underlinjer endnu ikke er blevet undersøgt.

I denne undersøgelse GC-cellelinie , SGC7901, og to MDR underlinjer, SGC7901 /VCR og SGC7901 /ADR blev udsat for en lncRNA microarray analyse. Bioinformatik og verifikation eksperimenter blev udført for at undersøge de potentielle lncRNAs involveret i udviklingen af ​​MDR. Pathway analyse viste, at 15 veje svarede til down-regulerede udskrifter, og at 20 veje svarede til up-regulerede udskrifter (p-værdi cut-off er 0,05). GO analyse viste, at de højeste beriget GOs målrettet med op-regulerede udskrifter var “systemudvikling”, og de højeste esenriched GOs er omfattet af de ned-regulerede udskrifter var “sterol biosyntetiske proces”.

Stigende beviser viste, at lncRNA ( lange ikke-kodende RNA) kan spille en vigtig rolle i carcinogenese og tumorinvasion og metastase [38]. For eksempel John [39] osv påvist, at lncRNA

PCGEM1

er associeret med prostatacancer; transformerende vækstfaktor-β-induceret lncRNA-Smad7 fandtes at inhibere apoptose af muse brystcancer JygMC (A) celler og således foreslår ed en kompleks mekanisme til regulering af anti-apoptotiske og tumor-progressive aspekter af TGF-β signalering [40] ; lncRNA, prostatakræft-associeret udskrift 29 (PCAT29), blev karakteriseret sammen med sit forhold til androgen receptor, fungerede som en androgen-reguleret tumorsuppressor i prostatacancer [41]; Yuan osv opdaget en hidtil ukendt TGF-β-induceret lncRNA, lncRNA-ATB, som stimulerede EMT gennem sekvestrere MIR-200S og lettes kolonisering ved at stabilisere

IL-11

mRNA og dermed fremme både tidlige og sene trin af cancermetastase [42].

det har vist sig, at lncRNAs spiller afgørende roller i ændring af ekspressionen af ​​protein-kodende gener via cis- eller trans-mekanismer. Her fandt vi, at lncRNAs opreguleret i SGC7901 /ADR og SGC7901 /VCR forhold til SGC7901lncRNA såsom AF119893, som var intron antisense til NRP2 (neuropilin-2). Det er blevet foreslået, at NRP2 /VEGF-C-aksen spiller en rolle i blærekræft terapi modstand og VEGF-paxillin-NRP2 pathway kunne udgøre en ny terapeutisk mål for kræft og andre angiogenese-relaterede sygdomme. lncRNA AF461897 var intron sans-overlapning af ABCB9. Dong etc har vist, at MIR-31 udøvede en anti-apoptotisk virkning sandsynligvis gennem hæmning af ABCB9 og således tilvejebringe en ny strategi, der omfatter brugen af ​​MIR-31 som et potentielt mål i NSCLC kemoterapi. lncRNA BC065904 var intron sans-overlapning af CTBP2, en af ​​de transkriptionelle corepressorer af C-terminalt bindende protein (CtBP) familie, der fungerede som en co-repressorkomplekset af E2F7 og som en regulator af DNA-skader reaktion. lncRNA NR_026900 var exon sense-overlappende QSOX1, som blev påvist at reducere proliferation, migration og invasion af brystcancerceller in vitro og reducerer tumorvækst in vivo.

På den anden side, lncRNAs nedreguleres i SGC7901 /ADR og SGC7901 /VCR sammenlignet med SGC7901lncRNA såsom AF113689 var naturligt antisense til RRM1. Khatri etc har rapporteret, at pre-eksponering af RRM1 siRNA faldt IC50 værdi gemcitabinhydrochlorid 5 folder i A-549 celler i forhold til gemcitabinhydrochlorid alene, hvilket indikerer, at RRM1 var en potentiel onkogen for lungekræft. lncRNA uc010iyh var intron antisense NAIP (neuronapoptose Inhiberende Protein), som er en af ​​IAP-familien. Det er blevet vist, at IAP kan inddrages i prostata lidelse (BPH, PIN og PC) udvikling siden kunne provokere inhibering af apoptose og efterfølgende celleproliferation. LncRNA uc003jsd var exon sense-overlapning af PDE4D, dvs. cAMP-specifikke 3 ‘, 5’-cyklisk phosphodiesterase 4D. Lin etc viste, at PDE4D fungerer som et tumor-fremmende faktor og repræsenterer en unik målrettes enzym af cancerceller. LncRNA NR_002332 var exon sense-overlapning af ST7, undertrykker af tumorigenicitet 7, som er blevet foreslået at være et tumorsuppressorgen i kromosomet region 7q31.1-q31.2.

Pathway analyse afslørede potentielle veje involveret i udvikling af multiresistens (MDR) af gastrisk cancer. Arnt var en af ​​de 20 veje konsekvent svarede til up-regulerede udskrifter og blev rapporteret at være involveret i multiresistens udvikling af flere maligne tumorer [43], herunder myelomatose [44], og AML (akut myeloid leukæmi) [45] . MDR1 koder P-glycoprotein, som er en energi-afhængig efflux pumpe, der kunne eksportere plane hydrofobe molekyler, herunder nogle kemoterapeutiske lægemidler, såsom adriamycin, cisplatin, taxol og så videre fra cellen [46, 47]. Her fandt vi, at Arnt og MDR1 var signifikant opreguleret i SGC7901 /ADR og SGC7901 /VCR cellelinjer compacared til SGC7901, effekten af ​​signifikant opregulering af MDR1 medieret af Arnt ekspressionsvektor transfektion blev kompromitteret via Sp1 siRNAs transfektion, som angivet rolle Arnt-MDR1pathway i MDR fænotype af mavekræft.

Yderligere undersøgelse viste, at nogle protein-kodende gener involveret i narkotika-resistens fænotype og udvikling af maligne tumorer måske var cis-reguleret af korrelerede lncRNAs . For eksempel ABCB1 (ATP-bindende kassette, sub-familie B (MDR /TAP), medlem 1, P-glycoprotein (P-gp) kodning gen), der ligger 400KB opstrøms lncRNA MRUL (NR_024549: MDR-relaterede og up- reguleret lncRNA), var signifikant opreguleret gennem en potentiel forbedring-lignende rolle MRUL spiller og fremmes lægemiddel-resistens fænotype af SGC7901 /ADR og SGC7901 /VCR celler [33]; ADAM22, en kandidat gen for malign transformation af æggestokkene endometriose [48], blev korreleret med lncRNA AL133090 i et exon forstand-overlappende måde; PLCG1 var korreleret med lncRNA AK021471 i et intron forstand-overlappende måde og tilbagevendende mutationer i PLCG1 blev identificeret i angiosarcomer [49]; FYN var korreleret med lncRNA AK AK090692 i et intron forstand-overlappende måde og antagomir-1290 undertrykker CD133 (+) celler i ikke-småcellet lungekræft ved at målrette fyn-relaterede Src familie tyrosinkinase [50] osv

Denne undersøgelse viste, at liberaliseringen af ​​lncRNAs var involveret i udviklingen af ​​multidrug-resistens phynotype af mavekræft. Yderligere analyse af disse lncRNAs og relaterede veje kunne give indsigt i de mekanismer kemoterapi resistens af mavekræft og tilvejebringe nye retninger for omvendt multilægemiddelresistens phynotype.

Materialer og metoder

Etik redegørelse

Alle de eksperimentelle procedurer blev godkendt af Institutional Review Board i den fjerde Military Medical University. Skriftligt informeret samtykke blev opnået for alle patientprøver.

cellelinjer og cellekultur

Den menneskelige GC cellelinje SGC7901 blev opnået fra Academy of Military Medical Science (Beijing, Kina). To multiresistente underlinjer, SGC7901 /VCR og SGC7901 /ADR, blev udviklet i vores laboratorium [51]. SGC7901 /VCR, SGC7901 /ADR og SGC7901 blev dyrket i RPMI1640-medium (Thermo Scientific Co., USA), der blev suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS) (Thermo Scientific Co., USA) i en befugtet inkubator med 5% CO2 ved 37 ° C. VCR (1,0 ug /ml) eller ADR (0,5 ug /ml) blev tilsat til dyrkningsmediet af de passende celler til at opretholde resistente fænotype.

RNA-isolering, mærkning og array-hybridisering

Totalt RNA blev høstet fra SGC7901, SGC7901 /ADR og SGC7901 /VCR hjælp TRIzol-reagens (Invitrogen, CA, USA) og RNeasy Kit (Qiagen Co., Tyskland) ifølge producentens anvisninger, herunder en DNase-fordøjelse trin. Totalt RNA fra hver cellline blev kvantificeret under anvendelse af en NanoDrop ND-1000 (OD 260 nm, NanoDrop, Wilmington, DE), RNA integritet blev vurderet ved anvendelse af standard denaturerende agarosegelelektroforese, og renheden blev vurderet ved forholdet mellem absorbans ved 260 nm til 280 nm (A260 /A280). Dobbeltstrenget cDNA (ds-cDNA) blev syntetiseret under anvendelse af 5 ug totalt RNA ved en Invitrogen SuperScript ds-cDNA syntesekit i nærvær af 100 pmol oligo dT-primere. Derefter blev de ds-cDNA mærkes og udføres hybridisering som tidligere beskrevet [52]. RNA mærkning og microarray hybridisering blev udført ved KangChen Bio-tech, Shanghai, PR China.

Highthroughput lncRNA ekspressionsprofil analyse

Kvalificeret RNA blev anvendt til at syntetisere dobbeltstrenget cDNA under anvendelse af Superscript Dobbelt- cDNA Synthesis Kit (Invitrogen Co., USA). Dobbeltstrenget cDNA blev mærket og hybridiseret til humane LncRNA microarray V2.0 (Arraystar Co. USA). microarray V2.0 indeholder omkring 33.000 lncRNAs indsamlet fra de autoritative datakilder, herunder NCBI RefSeq, UCSC, RNAdb, LncRNAs fra litteratur og UCRs. Sekvenser blev udvalgt med proprietære strategier. Gentag sekvenser og ncRNAer kortere end 200 bp blev slettet. For at øge statistisk tillid, blev hvert menneske lncRNA vifte bestående af 60,302 forskellige prober (60 merer) og hver udskrift blev repræsenteret af 1-5 sonder. Hver udskrift blev repræsenteret af en specifik exon eller splejsning vejkryds sonde til at identificere individuelle udskrifter præcist. Den microarray hibridization og bioinformatisk analyse blev udført af KangChen Bio-tech, Shanghai, PR China. De rå data intensitet og normaliserede data blev vist i Gene Expression Omnibus (GSE69342: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE69342).

Kvantitative real-time PCR (QRT-PCR)

Den samlede RNA fra SGC7901, SGC7901 /ADR og SGC7901 /VCR blev isoleret under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen, CA, USA) og blev derefter revers transkriberet under anvendelse PrimeScript RT reagenskittet med gDNA Eraser (Perfect Real Time) (Takara, Dalian Kina) i overensstemmelse med producentens struktioner. Ekspressionen af ​​otte opreguleres lncRNAs og seks nedreguleres lncRNAs blev målt ved QRT-PCR under anvendelse SYBRGreen assays (Takara, Dalian, Kina), og GAPDH blev anvendt som en intern kontrol. Primerne er anført i tabel 1. Ekspressionsniveauet af hvert lncRNA blev repræsenteret som gange ændring under anvendelse af 2- △△ Ct metoder. Ekspressionsniveauet af lncRNAs differentielt udtrykt mellem SGC7901 og MDR underlinjer SGC7901 /ADR og SGC7901 /VCR blev analyseret ved anvendelse af Students t-test med SPSS (version 17.0 SPSS LNC). En værdi på p 0,05 blev betragtet som signifikant.

Histoculture Drug Respons Analyse (HDRA) Frisk GC tumorvæv blev høstet fra hver kirurgisk resektion prøve og placeret i en 24-brønds plade. Cubes of kollagengel svamp (1 cm

3) blev nedsænket i 1 ml RPMI 1640 supplering med 20% føtalt bovint serum. Tumorvæv blev anbragt på kollagensvamp efter ADR tilsat ved en slutkoncentration på 6 pg /ml, og de blev inkuberet ved 37 ° C med 5% CO2. Tumorvæv behandlet med normalt saltvand (N.S) uden ADR blev anvendt som kontrol. Evaluering og beregningsmetoder er som tidligere beskrevet [53]. Inhiberingshastigheden (IR) af tumorvækst = (1-gennemsnitlige absorbans af behandlede brønde per gram tumor /middelabsorbans af kontrolbrønde per gram tumor) × 100. I denne undersøgelse blev IR cut-off-værdi lig med eller større end 30% (IR30) defineret som kemosensitivitet ifølge foreløbige undersøgelse resultat [54]. Lige som anvist, bør klinikken patologiske oplysninger af tumor væv kilde bruges til HDRA henholdsvis blev præsenteret i tabel 2.

cellelinjer og dyrkningsbetingelser

Den menneskelige GC celle line SGC7901 blev opnået fra Academy of Military Medical Sciences (Beijing, Kina). Multiresistente underlinjer SGC7901 /VCR og SGC7901 /ADR blev udviklet i vores laboratorium. SGC7901 /VCR, SGC7901 /ADR, og SGC7901 blev dyrket i RPMI 1640-medium (Thermo Scientific, USA) suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS) (ThermoScientific) i en 5% CO2 befugtet inkubator ved 37 ° C. Vincristin (VCR, Sigma, Inc., St. Louis, MO; 1,0 ug /ml) og ADR (Sigma, Inc., St. Louis, MO; 0,5 ug /ml) tilsat til dyrkningsmediet af passende celle underlinier til opretholde resistente fænotype

Konstruktion af pcDNA3.1 (+) -. Arnt plasmid

til over-express Arnt, pcDNA3.1 (+) – Arnt plasmid blev konstrueret. Den menneskelige Arnt cDNA ekspressionsvektor (pcDNA3.1 (+) – Arnt) blev bygget af CW Biotech Co. Ltd, Beijing, Kina. Kort fortalt blev plasmidet pcDNA3.1 (+) – blev ARNT fremskaffes efter cDNA-sekvensen fra GenBank. Den ARNT genet blev genereret ved PCR-amplifikation. Plasmidet pcDNA3.1 (+) blev ekstraheret gennem en Maxi Preparation Kit (Omega, Georgia, USA). PCR-produktet blev subklonet i BamHI (Takara, Mountain View, USA) og HindIII (Takara) steder af pcDNA3.1 plasmidet ved T4 ligase (Takara, Mountain View, USA). PcDNA3.1 (+) -. ARNT konstruktion blev verificeret ved DNA-sekventering (Invitrogen, Grand Island, USA) (data ikke vist)

Frembringelse af Arnt stabile cellelinjer

SGC7901 /ADR celle blev dyrket i 12-brønds plader med 1,0 x 10

5 celler i hver brønd i en inkubator med konstant tilførsel af 5% CO2 ved 37 ° C. Mediet blev skiftet 24 timer senere med forskellige koncentrationer af G418 antibiotikum G418 (600 ug /ml) og erstattet hver 3. dag i 14 dage efter cellekultur. Parentale celler blev transficeret med pcDNA3.1 (+) – Arnt plasmider under anvendelse af lipofectamin 2000 i overensstemmelse med producentens anvisninger. Densiteten af ​​celler var 2 × 10

5 celler per brønd i seks-brønds plader. Monoklonalt celle koloni med G418-resistens blev dannet ved anvendelse af begrænsende fortyndingsmetode ved dyrkning enkelt celle i 100 pi medium i 96-brønds plader i 24 timer. Monoklonale cellekolonier blev fordøjet 15 dage senere for yderligere forstærkning til dyrke celler med stabil ARNT ekspression i plader med 24 brønde. Celler blev overført til cellekultur kolbe, indtil der var ca. 90% konfluente. De Arnt over-udtrykte cellelinjer transficeret af pcDNA3.1 (+) – Arnt blev navngivet som SGC7901 /ADR Arnt

Lille interferens RNA (siRNA) transfektion

For at knockdown den Arnt mRNA-ekspression. , siRNA transfektion blev udført. For transfektioner blev Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og 50 nM siRNA (Gene Pharma Co., Shanghai, Kina) anvendt ifølge producentens anbefalinger som tidligere [55] beskrevne. SiRNA-sekvenser anvendes, er: 5′-AGUUUAUCCACAUCAUCUGGG-3 ‘, 5′-CAGAUGAUGUGGAUAAACUUC-3’

Western blotting

totalt celleprotein blev lyseret under anvendelse af lysepuffer suppleret med phenylmethylsulfonylfluorid (1 mM. ) på is. Derefter protein blev elektroforesebehandlet gennem 12% SDS polyacrylamidgeler og overført til en PVDF-membran (Millipore, Massachusetts, USA). 5% fedtfri mælkepulver blev anvendt til at blokere membranerne ved stuetemperatur i 1 time og de primære antistoffer blev inkuberet natten over. Derefter blev membranerne inkuberet med sekundære antistoffer mærket med HRP i 1 time ved stuetemperatur efter tre 10-minutters vaske i triethanolamin saltvandsopløsning med Tween (TBS-T). Endelig blev detekteret signalerne under anvendelse af et ECL-kit (Pierce Biotech., Rockford, IL, USA) blev og membranerne scannes og analyseres med en ChemiDoc XRS + (Bio-Rad, California, USA) imaging system med imaging software (Version 1.0) .