PLoS ONE: Profilering Kritiske Cancer genmutationer i kliniske tumorprøver

Abstrakt

Baggrund

Påvisning af kritiske kræft genmutationer i kliniske tumor prøver kan forudsige patienternes resultater og informere behandlingsmuligheder; dog high-throughput mutation profilering forbliver underudviklet som diagnostisk metode. Vi rapporterer gennemførelsen af ​​en genotype og validering algoritme, der gør det muligt robust tumor mutation profilering i kliniske omgivelser.

Metode

Vi udviklet og implementeret en optimeret mutation profilering platform ( “OncoMap”) for at afhøre ~400 mutationer i 33 kendte onkogener og tumor suppressorer, hvoraf mange er kendt for at forudsige respons eller resistens over for målrettede behandlinger. Udførelsen af ​​OncoMap blev analyseret under anvendelse af DNA afledt af både frosset og FFPE klinisk materiale i et bredt sæt af cancertyper. En efterfølgende dybtgående analyse blev udført på histologisk og klinisk kommenterede pædiatriske gliomer. Følsomheden og specificiteten af ​​OncoMap var 93,8% og 100% i frisk frosset væv; og 89,3% og 99,4% i FFPE-afledt DNA. Vi har detekteret kendte mutationer ved de forventede frekvenser i almindelige kræftformer, såvel som nye mutationer i voksne og pædiatriske kræftformer, der sandsynligvis vil forudsige øget respons eller resistens over for eksisterende eller udviklingsmæssige behandlinger mod kræft. OncoMap profiler understøtter også en ny molekylær lagdeling af pædiatriske lav kvalitet gliomer baseret på

BRAF

mutationer, der kan have umiddelbar klinisk effekt.

Konklusioner

Vores resultater viser den kliniske gennemførlighed af high-throughput mutation profilering at forespørge et stort panel af “handlingsrettede” kræft genmutationer. I fremtiden kan denne form for tilgang indarbejdes i både kræft epidemiologiske undersøgelser og klinisk beslutningstagning at angive brug af mange målrettede anticancermidler

Henvisning:. MacConaill LE, Campbell CD, Kehoe SM, Bass AJ, Hatton C, NIU L, et al. (2009) Profilering Kritiske Cancer genmutationer i kliniske tumorprøver. PLoS ONE 4 (11): e7887. doi: 10,1371 /journal.pone.0007887

Redaktør: Chris Jones, Institut for Cancer Research, England

Modtaget: August 25, 2009; Accepteret: 20 oktober 2009; Udgivet: November 18, 2009

Copyright: © 2009 MacConaill et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Cancer Institute (R21CA126674) til LAG, (K08CA134931) til AJB, og Dana-Farber Cancer Institute. A.J.B. blev støttet af Harvard Clinical Investigator Training Program. Midler til analyse af gastrointestinale tumorer blev leveret American Society of Clinical Oncology, Friends of the Dana-Farber Cancer Institute og H.T. Berry Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Med hensyn til økonomiske oplysninger, Levi Garraway er en konsulent for og /eller modtager sponsoreret forskning fra Novartis, Inc. Ingen af ​​disse relationer udgør en interessekonflikt for dette arbejde. Dette ændrer ikke sin tilslutning til alle PLoS ONE politikker om deling og materialer data.

Introduktion

Mange tumorer indeholder kendetegnende mutationer i onkogener eller tumor suppressor (TS) gener, der kan give en øget modtagelighed til målrettede anticancer behandlinger. Veletablerede eksempler inkluderer

KIT

mutationer i gastrointestinale stromale tumorer (loger), der forudsiger reaktion på imatinib eller nilotinib, og ikke-småcellet lungekræft med

EGFR

mutationer, der er følsomme over for erlotinib [ ,,,0],1], [2], [3]. Tilstedeværelsen af ​​andre mutationer forudsiger en mangel på svar på målrettet terapi. For eksempel, lunge- og tarmkræft, som skjuler mutationer i

KRAS

onkogen reagerer ikke på behandling med anti-

EGFR

agenter [4], og inaktivere

PTEN

mutationer ( eller proteintab) i glioblastomas forudsige resistens over for erlotinib [5]. Således vil den kliniske beslutningsproces baseret på tumor genetisk information i stigende grad blive underrettet af mutationsstatus af flere cancer gener. Men generere en omfattende profil af mål-stand eller på anden måde “handlingsrettede” tumor DNA mutationer i den kliniske arena forbliver udfordrende.

Den seneste teknologiske fremskridt gør det muligt i princippet at screene en tumor biopsi for mange typer af genomiske forandringer . Men inkorporering af sådanne oplysninger i den kliniske beslutningsproces kræver pålidelig genomisk profilering af frosne, paraffin-afledt, og arkivering tumor-DNA. I denne sammenhæng nukleinsyrer er ofte udsat for nedbrydning og /eller kemiske forandringer, og tilgængeligheden af ​​tumorvæv kan være begrænsende.

Vi har tidligere rapporteret tilpasning af en high-throughput genotyping tilgang at forespørge centrale mutationer i et panel af 17 kendte onkogener. Vi viser nu den kliniske gennemførlighed af massespektrometrisk baseret cancer genmutation profilering for et stort panel af onkogene og TS genmutationer. For at opnå dette, genereret vi en tilgang betegnet OncoMap, som anvender en udvidet samling af 460 assays forhører kendte mutationer i 33 cancer-gener. Brug af denne genomiske profilering fremgangsmåde koblet til en analytisk mutation-ringer algoritme og ortogonale valideringstrin, vi påvist talrige mutationer i genomisk DNA fra både frosset og FFPE tumorvæv. Desuden anvendelsen af ​​systematiske mutation profilering 120 pædiatriske lav kvalitet astrocytomer afslører en klinisk informativ molekylær lagdeling ikke tidligere er indregnet i denne tumortype. Sådanne oplysninger, hvis det blev bredt tilgængelige, kunne oplyse både klinisk beslutningstagning og optimal design af kliniske studier for målrettede lægemidler.

Metoder

Patienter og tumorvæv Collection

anonymiseret tumor prøver blev opnået fra Cooperative humant væv Network (CHTN), Kirurgisk Oncology Universitet Siena, Italien, og Dana-Farber Cancer Institute; humane gliom prøver blev indhentet fra de kliniske arkiver departementerne Patologi på Børnehospital Boston og Brigham og kvinders Hospital. (Den krævede indhold tumor var 70%; nekrose. 10%) Institutionel Review Board (IRB) fritagelse blev opnået for alle prøver fra Dana-Farber /Partnere Cancer Care kontor for beskyttelse af Research Emner. DNA-ekstraktion blev udført som beskrevet i Methods S1.

OncoMap Assay Design og Genotypning

Udvælgelse af kræft genmutationer for assay design og massespektrometrisk genotypebestemmelse blev udført som tidligere beskrevet [6] med modifikationer angivet i Methods S1. Assay, primer og probesekvenser er angivet i tabel S1.

Sample Barcoding og Sequencing

Primere flankerende

KRAS

kodon 12 blev anvendt til PCR-amplifikation af genomisk DNA fra 91 friske frosne og 93 FFPE prøver (primersekvenser er angivet i tabel S2). PCR amplikoner blev analyseret ved Sanger-sekventering. Alternativt

KRAS

kodon 12 blev PCR-amplificeret med stregkodede primere som beskrevet i Methods S1. PCR amplikoner blev samlet og analyseret (Illumina Genome Analyzer II enkelt bane). Sequence data blev analyseret som beskrevet i Methods S1.

Resultater

Karakteristik af kliniske tumorprøver

I alt 903 kliniske tumor prøvemateriale fra 12 forskellige væv steder blev vurderet for denne undersøgelse (tabel 1). Størstedelen af ​​prøverne var adenocarcinomer (n = 625) fra tumorer i bryst, lunge, prostata, og mavetarmkanalen. En samling af GIST’er (n = 34) og gliomer (n = 155) blev også inkluderet. Af disse blev 643 prøver opnået fra frisk frossen væv og 260 stammer fra FFPE blokke. Anslået indhold tumor oversteg 70% i alle prøver, som målt ved patologisk gennemgang (se Methods).

Ydelse af Tumor Mutation Profiling Algoritme

For at lette kræft genmutation profilering i klinisk tumor prøver, udviklede vi OncoMap, et panel af genotypebestemmelse assays, vurderede 396 unikke mutationer i 33 cancer-gener. Den komplette mutation profilering algoritme (figur 1A) involveret massespektrometrisk genotype efterfulgt af både automatiserede opkalds- og manuel gennemgang at generere en liste over kandidat mutationer. Disse kandidater blev udsat for sekundær genotype validering (se Metoder S1). Antages det, at alle primære profilering og assay validering reagenser er på plads, er 7-10 dage kræves for at fuldføre hele OncoMap sekvens.

A. En oversigt over den OncoMap processen fra tumor til mutation profil. Se tekst for detaljer. B. Receiver operatør karakteristiske kurver (Rocs) viser sensitivitet og specificitet for forskellige cutoff værdier på prøve score på validerings- prøver. ROC er plottet for frisk frosset (til venstre) og FFPE-afledt (højre) DNA, ved hjælp af tovejs

KRAS

assays og Illumina data som en sandhed-sæt (se Metoder S1).

OncoMap præstation blev vurderet efter bestemmelse af “jord-sandhed” mutationsstatus på

KRAS

codon 12 ved hjælp af en DNA-stregkoder og massivt parallelle sekventering-by-syntese strategi (se Metoder S1) anvendes på 91 frosne og 93 FFPE -afledte tumor DNA. Når disse dybe sekventering resultater blev sammenlignet med genotype analyser forhører det samme

KRAS

codon, fandt vi OncoMap sensitivitet og specificitet til at være 93,8% og 100%, henholdsvis i DNA fra friske /frosne væv; og 89,3% og 99,4% i FFPE-afledt DNA (figur 1B). I modsætning hertil følsomheden af ​​konventionel Sanger sekventering var 83,3% for frisk frosset væv og 76,0% for FFPE-afledt DNA, hvilket bekræfter den øgede ydeevne genotyping-baserede mutation profilering [7].

OncoMap ydeevne blev evalueret mere udstrakt grad ved at teste 215 friske frosne tumorprøver spænder flere tumortyper, hvor mutationsstatus for nukleotider forhørt af 52 OncoMap analyser tidligere var blevet etableret. Ved denne analyse, mutation profilering opnået en tilsvarende høj specificitet på 99,8%. Analysens sensitivitet optimal i tumorvæv, hvor tumoren-indhold på over 50% (data ikke vist). Selvom individuelle følsomhed værdier ikke kunne bestemmes for alle mutationer analyseres, beregninger ved hjælp af envejs

KRAS

assays (reflekterende af størstedelen af ​​OncoMap analyser) gav næsten identiske sensitivitet og specificitet værdier (Figur S1). Disse resultater antydede, at genotype-baserede mutation profilering platform var egnet til mange kliniske anvendelser.

“Handlingsrettede” Cancer genmutationer tværs Diverse Kræft Typer

Af de 903 kliniske tumor prøver profilerede, 37% (n = 335) indeholdt en eller flere mutationer. I alt blev 417 mutationer identificeret, med 63 prøver udviser co-forekommende mutationer. Ud fra følgende betragtninger 286 mutationer blev fundet af analyser forhører kendte eller kandidatlande onkogener, blev 131 mutationer observeret i TS gener. Således OncoMap platform givet mere omfattende mutation information end tidligere mutation profilering indsats, der udelukkende fokuserede på onkogene mutationer. Som forventet, fordelingen af ​​mutationer afspejles mønstre tidligere observeret i humane tumorer, hvorimod der TS mutationer var lavere (reflekterende af den reducerede dækning af sådanne mutationer ved OncoMap). Som eksempler kan nævnes

PIK3CA Hotel (26%) og

TP53 Hotel (13%) mutationer i brystkræft;

APC Hotel (11%),

BRAF Hotel (10%),

KRAS Hotel (38%),

PIK3CA Hotel (11%) og

TP53 Hotel (9%) mutationer i kolorektal cancer, og

EGFR Hotel (12%),

KRAS Hotel (23%) og

STK11 Hotel (8%) mutationer i lungekræft. De forventede mutation distributioner blev observeret i både friske frosne og FFPE prøver, hvilket understreger den potentielle nytte af OncoMap i kliniske omgivelser.

Mutationer Forudsigelse Reaktion på målrettede behandlinger

Tabel 2 viser et sæt af ” handlingsrettede “kræft genmutationer identificeret heri. Den OncoMap platform håndfast opdaget mutationer, der udgør etablerede markører for respons på målrettede behandlinger. For eksempel,

EGFR

mutationer prædiktive for respons til erlotinib og gefitinib blev identificeret ved den forventede frekvens (12%) i ikke-småcellet lungekræft, og

KIT

mutationer forbundet med følsomhed over for imatinib og nilotinib blev fundet i 76% af GIST’er. Interessant

ERBB2 Salg mutationer blev påvist i fire gastriske adenokarcinomer, øge muligheden for at afprøve et HER-2-inhibitor, såsom trastuzumab i mavecancerpatienter udvalgt ud fra denne genetiske kriterium [8].

Flere tumorer nærede mutationer, der kan forudsige respons på testpræparater agenter. For eksempel blev

BRAF

V600E

mutationer identificeret i colorektal (n = 16), ovarie (n = 1), thyroid (n = 4) og endometrial (n = 1) cancere, såvel som pædiatriske gangliogliomas (n = 22; se nedenfor). Tumorer huser disse mutationer kan reagere på en selektiv

BRAF

inhibitor [6], [9]. Vi identificerede også 96 prøver over syv forskellige typer cancer (bryst n = 14, kolorektale n = 24, endometriale n = 15, esophageal n = 4, gastriske n = 34, prostata n = 3, og pædiatrisk astrocytom n = 2) som har mutationer i enten

PIK3CA

eller

PTEN.

Disse mutationer kan forventes at berige for tumorer, som reagerer på de PI3 kinase hæmmere under udvikling.

mutationer Forudsigelse Modstand mod målrettede behandlinger

Sammen med mutationer, der bibringer øgede følsomhed over for målrettede behandlinger, OncoMap håndfast opdaget mutationer forbundet med resistens over for flere agenter. Etablerede eksempler omfatter

KRAS

mutationer i ikke-småcellet lungekræft (23%) og kolorektal cancer (38%), som giver resistens over for erlotinib, gefitinib (lunge) eller cetuximab (kolorektal) [4], [10 ], [11]. Mens 94% af

KRAS

identificerede mutationer lokaliseret til kodonerne 12 eller 13, 6% forekom andetsteds i genet (mest almindeligt ved kodon 61). Da de fleste undersøgelser af

KRAS

associeret modstand har udelukkende fokuseret på codon 12 og 13 [3], [12], [13], OncoMap identificeret yderligere

KRAS

mutationer, der kan påvirke følsomheden over for anti-EGFR behandling. OncoMap også identificeret en

HRAS

mutation i en lunge adenocarcinom og en

NTM

mutation i en kolorektal adenocarcinom. Mutationer, der involverer alternative RAS isoformer er sjældne i disse kræftformer; tænkes, kan disse også resistens over for anti-EGFR-behandling.

Mutation profilering også identificerede mutationer, som giver “sekundære” modstand mod målrettede behandlinger (fx modstand alleler opstår i løbet af målrettet terapi). I GIST tumorer, hvor 31

KIT

mutationer blev identificeret i 25 prøver; både primær (imatinib-responsive) og sekundære (imatinib-resistente)

KIT

mutationer blev fundet i overensstemmelse med tidligere mutation profilering undersøgelser [7]. Især flere

KIT

mutationer involverer exon 9 (

KIT

Y503_or F504insAY, 5 tilfælde) blev påvist i ubehandlede GIST tumorer. Disse mutationer er forbundet med en øget krav om behandling for at fremkalde et klinisk respons [14], [15]. En

PDGFRA

mutation (D842V) prædiktiv af resistens over for imatinib [15] blev også identificeret i en GIST prøve.

Akt1

E17K

mutation har tidligere været rapporteret i bryst, tyk- og ovariecancer. Den OncoMap platform identificeret sjælden

Akt1

mutationer i disse tumortyper, samt enkelt

Akt1

E17K

tilfælde i endometrie, esophageal skællede, gastrisk, og prostatakræft. Denne mutation kan forudsige resistens over for PI3 kinase hæmning (og tænkes receptor tyrosinkinaseinhibering) i nogle sammenhænge [16].

Kræft med Co-forekommende “Handlingsrettede” Mutationer

Tilstedeværelsen af ​​samarbejde forekommende mutationer, der påvirker kritisk cancer gener kan ændre det kliniske respons på monoterapi målrettet terapi. Her 20 adenocarcinomer (10 kolorektal, to endometrie og 8 gastriske) udviste co-forekommende

PIK3CA

og

KRAS

mutationer. Mens sammenfaldende mutationer i disse gener tidligere er blevet rapporteret i kræft i tyktarmen [17],

PIK3CA

KRAS

mutationer har typisk udstillet en gensidigt udelukkende mønster af forekomst i endometriecancer [18 ], [19]. En endometrie adenocarcinom med co-forekommende

FGFR2

PTEN

mutationer blev også identificeret. To tumorer nærede sammenfaldende

BRAF

PTEN

mutationer (en endometrie, en kolorektal), og en ekstra kolorektal prøve indeholdt både en

PIK3CA

og en

BRAF

mutation. Disse tumorer kan forventes at udvise resistens over for receptor tyrosinkinaseinhibering.

Molekylær Klassificering af Pediatric Brain tumorer af Cancer Gene Mutation Profilering

Evnen til at udføre robust mutation profilering af klinisk og arkivering tumorvæv kan fremme systematisk molekylær karakterisering af “forældreløse” kræftformer, herunder nogle pædiatriske tumorer, hvor tilstrækkelig væv er ofte mangler. For at udforske denne hypotese blev OncoMap bruges til at forespørge en række pædiatriske lav kvalitet gliomer (LGGs) hvis mutation spektrum ufuldstændigt defineret. Denne analyse omfattede genomisk DNA fra 127 pædiatriske og 28 voksne gliomer (til sammenligning) spænder fem histologiske undertyper af pilocytic astrocytoma, ganglioglioma, og diffus astrocytom.

Kandidat Prognostisk eller terapeutiske mål i Pediatric Brain tumorer

Flere potentielt “handlingsrettede” cancer gener blev fundet muteret hos pædiatriske LGAs. Som eksempler kan nævnes

PDGFRA

(n = 1) og

PIK3CA

(n = 2), som kan forudsige respons på eksisterende lægemidler (f.eks imatinib eller nilotinib) eller agenter i udvikling (f.eks PI3 kinaseinhibitorer). To pædiatriske LGAs nærede mutationer i

MYC

, en veletableret onkogen homolog af

NMYC

, som forstærkes og tegn på dårlig prognose i pædiatrisk neuroblastom [20], [21]. Således kan tumor mutation profilering forfine patient lagdeling og /eller sygdom prognose i nogle pædiatriske hjerne kræft.

BRAF

V600E Mutationer er almindelige i Pediatric Gangliogliomas

Gentagelser af

BRAF

locus er blevet rapporteret som den hyppigste aberration i pædiatriske LGAs (66% [18]), mens aktivering punktmutationer i

BRAF

forekomme mindre hyppigt (4-6%) [22], [23 ]. Vi identificerede aktivering

BRAF

V600E

mutationer i 11% (10/88) af pædiatriske LGAs-en højere procentdel end tidligere rapporteret [22], [23]. Interessant nok

BRAF

V600E

mutation var mest udbredt i ganglioglioma undertype af pædiatriske LGAs (klassiske og ikke-klassiske; 8/14 tumorer, p = 0,00005), som vist i fig. 2.

BRAF

V600E

mutationer blev ikke identificeret i nogen af ​​de undersøgte voksne tumorer, selv om

TP53

mutationer almindeligvis forekom i denne indstilling (10/28 tilfælde). Omvendt kun 2 pædiatriske gliomer nærede en

TP53

mutation; i begge tilfælde, var sammenfaldende med en anden mutation (

EGFR

FLNB

henholdsvis). Disse resultater tyder på, at OncoMap kunne lette klassificeringen af ​​lav kvalitet astrocytomer og andre sjældne tumor typer baseret på genetiske kriterier

Forkortelser:. PA – pilocytic astrocytoma, WHO grad I; LGG, nos – lav kvalitet gliom, ikke andetsteds specificeret, WHO grad I eller II; GG – ganglioglioma; A2 – astrocytoma, WHO grad II; HG – high-grade gliom, WHO grad III eller IV. Parentes angiver det samlede antal prøver (i diagram) eller antallet af prøver med angivne mutation (uden figur).

Diskussion

Klinisk onkologi er midt i overgangen fra en behandling paradigme dikteret primært af anatomiske site af tumor oprindelse til en, hvor genetiske og /eller molekylære karakteristika spiller en afgørende rolle i at vejlede valg af behandling. Desuden spredning af målrettede agenter i udvikling og klinisk praksis nødvendiggør samtidig gennemførelse af ledsagende diagnostiske metoder, der beriger for subpopulationer størst sandsynlighed vil reagere på et lægemiddel. Der er derfor behov nye diagnostiske metoder til at profilere enhver tumor for pivotale genetiske mutationer i flere cancer gener samtidigt, i modsætning til de fleste eksisterende test, der fokuserer på enkelte gener (eller proteiner).

I denne undersøgelse har vi tilpasset genotyping- baseret mutation profilering til karakterisering af både frosne og FFPE-afledt tumorprøver spanning 12 kræftformer. Vi robust detekteret kræft genmutationer, der direkte klinisk anvendelse og forudsige resistens over for eksisterende midler, såsom tyrosinkinaseinhibitorer (fx

EGFR

og

KRAS

mutationer). Vi identificerede også multiple mutationer, der kan vejlede brugen af ​​nye midler. Endelig i en specifik undersøgelse af pædiatriske lav kvalitet astrocytomer, demonstrerede vi den særlige værdi denne platform kan have for sjældne “forældreløse” kræft ved at identificere mutationer, der kan informere molekylær klassifikation samt nye terapeutiske muligheder for børn med disse maligne sygdomme.

Diagnostiske indgreb, der med held indføre tumor mutation profilering til klinisk praksis skal omgå en række tekniske og logistiske forhindringer. Chief blandt disse er opnåelsen af ​​robust ydeevne i prøver afledt af FFPE og /eller arkivers tumor materiale. Vi fandt, at OncoMap platform opnået næsten 100% specificitet i både friske /frosne og FFPE-afledt tumor-DNA, hvilket indikerer, at falske positive mutation opkald er sandsynligvis være relativt sjældne med denne fremgangsmåde. Det skal dog bemærkes, at nå dette niveau af specificitet krævede gennemførelsen af ​​en analytisk sekvens, hvor rå genotypebestemmelse data udsættes for automatiseret basen ringer fulgt af en manuel gennemgang af kandidat mutationer og validering af alle kandidater, der benytter alternative genotype kemi. Således må den kliniske implementering af OncoMap inkorporere både genomisk datagenerering og bioinformatisk analytiske ekspertise i en molekylær patologi eller klinisk diagnostisk indstilling.

følsomhed OncoMap påvirkes af iboende teknologiske parametre, individuelle mutation assay ydeevne, og kvalitet og renhed af tumorvæv. Den 89-94% analysesensitivitet observeret i denne undersøgelse er tilstrækkeligt for mange translationel og kliniske anvendelser; men der er selvfølgelig omstændigheder, hvor endnu højere assay følsomheder vil være ønskelig. Berigelse af tumorceller ved hjælp af kerne nål dissektion eller laser-capture mikrodissektion før mutation profilering kan tilbyde en avenue at øge følsomheden, især i tumorer, hvor det stromale eller inflammatorisk indhold er høj. Samtidig, følsomheden af ​​OncoMap langt overstiger værdien af ​​Sanger sekventering, som fortsat guldstandarden for mange genetiske diagnostiske tilgange. Desuden bredden af ​​kræft gener og specifikke mutationer afhørt af OncoMap-støttet af de førnævnte strenge følsomhed og specificitetsbestemmelser-væsentligt overstiger værdien af ​​de eksisterende kommercielle massespektrometrisk-baserede genomisk profilering tilgange [24].

genomisk guidede terapier kan spille en særlig fremtrædende rolle i sjældne tumorer, hvor store randomiserede undersøgelser ofte er upraktisk. For at teste evnen af ​​OncoMap at identificere ualmindelige og /eller prøve begrænset tumorer, der kan have gavn af bestemte klasser af terapeutiske midler vi profileret et panel af pædiatriske lav kvalitet gliomer for fælles kræft genmutationer. Kendskab til de genetiske abnormiteter til stede i pædiatriske LGAs er begrænset, selv om de seneste undersøgelser har identificeret

BRAF

translokationer, kromosomale dobbeltarbejde, og lejlighedsvis base-mutationer i lav kvalitet astrocytomer [18], [25], samt diverse mekanismer til aktivering af ERK /MAPK-vejen i pilocytic astrocytomer [23]. Disse resultater tyder på, at de små molekyler hæmmere af

BRAF

allerede i voksne forsøg kan også repræsentere lovende terapi for undergrupper af disse tumorer. Vores resultater viser, at frekvensen af ​​

BRAF

punktmutationer i pædiatriske LGAs som helhed kan være højere end tidligere rapporteret, og specifikt at gangliogliomas besidder

BRAF

V600E mutationer ved meget høj frekvens . Denne observation kan også hjælpe i diagnostisk identifikation af disse tumorer. Gangliogliomas, som har en tendens til at være indolente tumorer, kan derfor deler nogle egenskaber med kutan nevi, hvis melanocyt forstadier også stammer fra nervesystemet (neural crest), udviser indolent vækst, og hvor

BRAF

V600E mutation er også meget udbredt. Vi identificerede også flere mutationer, der ikke tidligere er rapporteret i pædiatrisk astrocytom, hvoraf nogle (

EGFR

,

PIK3CA

,

PDGFRA

) repræsenterer potentielt handlingsrettede mål. I konkordans med tidligere rapporter [22], [26], [27] vi konstatere, at mutationer i gener ofte observeret hos voksne anaplastisk astrocytomer og /eller glioblastomer, såsom

TP53

eller

PTEN

, kun sjældent i pædiatriske pilocytic og lav kvalitet diffuse astrocytomer.

Selv om vores resultater støtter den kliniske gennemførlighed af high-throughput tumor mutation profilering, vi anerkender, at massespektrometrisk genotype tilgang har visse begrænsninger, der kan udelukke dens gennemførelse som en endelig kræftdiagnostik platform. Disse omfatter det endelige antal specifikke punktmutationer, der kan analyseres (betegnet

a priori

inden en delmængde af kræft gener), vanskeligheder med at designe genotype analyser, der identificerer små indsættelser eller sletninger ( “in-dels”) større end ~50bp i størrelse, at en manglende evne registrere de fleste TS genmutationer (som kan forekomme hvor som helst i genet, ikke bare “hotspot” regioner) eller yderligere genomiske forandringer såsom højt niveau gen amplifikationer eller sletninger, der også kan påvirke vigtige cancer gener , og den noget arbejdskrævende karakter af manuel gennemgang og retvinklede assay validering. På lang sigt kan tilpasning af nye genomics teknologier som anden generation sekventering tilbyde en samlende tilgang til omfattende tumor mutation profilering. Kan dog OncoMap platform tilbyder en øjeblikkelig avenue, som systematisk mutation profilering kan iværksættes for at guide klinisk forsøg design samt anvendelse af eksisterende målrettede agenter på tværs af mange kræftformer.

Sammenfattende denne undersøgelse er den første storstilet anvendelse af OncoMap platform for tumor mutation profilering i den kliniske og arkivering indstilling. Disse resultater oplive derfor en ramme, hvor systematisk tumor profilering kunne fremstå som et almindeligt brugbart middel til at guide patienten lagdeling for rationelle kræftmedicin. På trods af den iboende kompleksitet i kræft, der inkorporerer den voksende viden om den molekylære basis for kræft i både store molekylære epidemiologiske undersøgelser og i sidste ende bør klinisk beslutningstagning i sidste ende fremskynde fremkomsten af ​​mere effektive anticancer behandlingsformer.

Støtte oplysninger

Metoder S1.

Profilering kritiske kræft genmutationer i kliniske tumorprøver

doi:. 10,1371 /journal.pone.0007887.s001

(0,07 MB DOC)

tabel S1. Salg OncoMap 3 centrale PCR-primer og extension probesekvenser

doi:. 10,1371 /journal.pone.0007887.s002

(0,13 MB XLS)

tabel S2.

KRAS

G12 PCR primersekvenser bruges til at generere amplikoner for Sanger og Illumina sekventering

doi:. 10,1371 /journal.pone.0007887.s003

(0,03 MB XLS)

figur S1.

Udførelse af OncoMap i frisk frosset og FFPE-afledt DNA. Modtager operatør karakteristiske kurver (Rocs) er plottet for frisk frosset (venstre panel) og FFPE-afledt (højre panel) DNA, mod ensrettede OncoMap KRAS-analyser, ved hjælp af Illumina data som en sandhed-sæt (se Metoder S1).

Doi : 10,1371 /journal.pone.0007887.s004

(0,06 MB PPT)

tak

Vi takker Nicholas Wyhs, Benjamin Ebert og Sewit Tekki for teknisk ekspertise; Suely Marie til tilvejebringelse carcinoma prøver. Sanger sekventering blev afsluttet på Agencourt Bioscience Corporation, Illumina sekventering på cofaktor Genomics.