Abstrakt
MikroRNA’er (miRNA) er korte ikke-kodning RNA regulatorer, der styrer genekspression primært gennem post-transkriptionel lyddæmpning. Vi har tidligere identificeret
miR-205
i en signatur for menneskelig livmoderhalskræft ved hjælp af en dyb sekventering tilgang. I denne undersøgelse har vi bekræftet, at
MIR-205
ekspression var ofte højere i human livmoderhalskræft end deres matchede normale vævsprøver. Funktionelt, viser vi, at
miR-205
fremmer celledeling og migration i humane livmoderhalskræft celler. For yderligere at forstå de biologiske roller
miR-205
, vi udførte
in vivo
krydsbinding og Argonaute 2 immunudfældning af miRNA ribonukleoprotein komplekser efterfulgt af microarray analyse (CLIP-Chip) for at identificere dens potentielle mRNA mål. Anvendelse CLIP-Chip på GAIN- og tab af funktion eksperimenter, vi identificeret en række afskrifter som potentielle mål for
miR-205
. Flere mål er funktionelt involveret i cellulær proliferation og migration. To af dem, cyr61 og CTGF, blev yderligere valideret af Western blot-analyse og kvantificering af mRNA berigelse i Ago2 immunopræcipitater vha QRT-PCR. Desuden både
Cyr61
og
CTGF
blev nedreguleret i livmoderhalskræft væv. Sammenfattende vores resultater afslører nye funktionelle roller og mål for
MIR-205
i human livmoderhalskræft, som kan give ny indsigt om sin rolle i cervikal carcinogenese og dens potentielle værdi for klinisk diagnose.
Henvisning: Xie H, Zhao Y, Caramuta S, Larsson C, Lui WO (2012)
miR-205
Expression Fremmer Cell Proliferation og migration af menneskelig livmoderhalskræft celler. PLoS ONE 7 (10): e46990. doi: 10,1371 /journal.pone.0046990
Redaktør: Siu Tim Cheung, University of Hong Kong, Hongkong
Modtaget: 13. april, 2012; Accepteret: September 7, 2012; Udgivet: 3 oktober 2012
Copyright: © Xie et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Forskningsrådet svensk (523-2009-3517, 521-2010-3518); Den Åke Olsson Fond til Hæmatologisk Research; den svenske Cancer Foundation; Den Åke Wiberg Fond; Kong Gustaf V Jubilæumsfond; Kræftens Bekæmpelse i Stockholm; Axel og Signe Lagerman s Donation Foundation; Karolinska Institutet og Stockholms Amt. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
livmoderhalskræft, den tredje mest almindelige kræftform blandt kvinder på verdensplan [1], er stærkt forbundet med infektion og efterfølgende transformation af cervikale celler med specifikke humant papillomvirus (HPV) undertyper [2]. Det faktum, at livmoderhalskræft udvikler sig fra godt anerkendte præmaligne former, giver en vigtig mulighed for tidlig diagnose og forebyggelse. I dag sådan primær screening omfatter cytologiske analyser og HPV identifikation. Dog kan disse undersøgelser ikke pålideligt skelne læsioner med invasiv potentiale fra læsioner, som spontant vil relatere. Derfor udvikling af mere robuste markører for sygdomsprogression ville være værdifulde supplementer til de nuværende screeningsmetoder.
MikroRNA’er (miRNA) er korte ikke-kodning RNA (-22-nukleotider), der generelt kontrollerer genekspression på posten -transcriptional niveau gennem mRNA nedbrydning og /eller translationel undertrykkelse [3]. Disse små molekyler er blevet påvist at spille vigtige roller i en lang række fysiologiske og patologiske processer, herunder cancer udvikling og progression. Vi, og andre, der tidligere har identificeret ændrede miRNA udtryk underskrifter i human livmoderhalskræft [4] – [10]. Flere af disse miRNA har konsekvent blevet rapporteret som dysreguleret i livmoderhalskræft (
f.eks
.
miR-143
,
miR-145
,
miR-21
og
miR-205
). Nogle få har også været funktionelt karakteriseret i humane cervikale cancerceller. Blandt dem,
miR-143
,
miR-145
og
miR-34a
har vist sig at hæmme celledeling, og
miR-146a
og
miR-21
at øge cellevækst [8], [10], [11].
MIR-23b
blev for nylig fundet at undertrykke ekspressionen af urokinase-plasminogenaktivator (uPA) og inducere cellemigration i humane cervikale cancerceller [12]. Tilsammen disse observationer tyder på, at dysregulerede miRNA har en funktionel rolle i livmoderhalskræft udvikling af kræft og kan blive anvendt som diagnostiske værktøjer.
I denne undersøgelse undersøgte vi den funktionelle rolle af
miR-205
i human livmoderhalskræft. Dette miRNA var en af de mest betydningsfulde miRNA anvendes til livmoderhalskræft klasse forudsigelse og var signifikant overudtrykt i livmoderhalskræft prøver sammenlignet med matchede normale modstykker [9]. Øget ekspression af
miR-205
er også blevet observeret i endometrie adenocarcinom [13], hoved og hals pladecellekræft cellelinjer [14], planocellulært lunge karcinom [15] og ovariecancer [16]. Derimod reduceret ekspression af
MIR-205
er blevet rapporteret i melanom [17] og kræft i spiserøret [18], nyre [19], blære [20], [21], bryst [22] og prostata [23].
Baseret på de ovennævnte undersøgelser,
mIR-205
kan fungere som et onkogen eller tumorsuppressorgen afhængig af de cellulære sammenhænge. I overensstemmelse med sin dobbelte rolle, har flere undersøgelser vist sin tumor fremme og undertrykkende roller i forskellige cancer cellelinjer. For eksempler,
MIR-205
er blevet vist at undertrykke cellemigration /invasion gennem epitel-til-mesenkym overgang i både humane prostata- og brystcancerceller [23], [24], samt at målrette
HER3
tyrosinkinasereceptor i brystcancerceller [22]. Til støtte for en onkogen funktion,
miR-205
viste sig at målrette
SHIP2
for Akt overlevelse signalering i hoved og hals pladecellekræft celler [14]. I betragtning af kompleksiteten af dens funktionalitet, ville det være interessant at undersøge de funktionelle roller
miR-205
i livmoderhalsen udvikling af kræft.
Her beskriver vi de funktionelle konsekvenser af
miR- 205
regulering i humane livmoderhalskræft celler. I GAIN- og tab af funktion eksperimenter, vi viser, at
miR-205
regulerer celleproliferation og migration i humane livmoderhalskræft celler. Vi identificerede yderligere et sæt af formodet
miR-205
mål ved hjælp af en biokemisk tilgang. Flere af disse kandidat mål er funktionelt forbundet med celleproliferation og migration. To af de potentielle
miR-205
mRNA mål blev yderligere valideret i cellekultur eksperimenter. Vores resultater er et vigtigt bly til yderligere indsigt i den funktionelle rolle
MIR-205
i human cervikal udvikling af kræft.
Resultater
miR-205
Expression i human livmoderhalskræft prøver
Vi har tidligere identificeret en række miRNA, der kunne skelne livmoderhalskræft prøver fra deres normale modstykker ved hjælp af en sekventering-baserede miRNA profilering tilgang [9]. I den klassificeringen,
miR-205
havde den højeste score, hvilket tyder på en vigtig funktion i livmoderhalsen udvikling af kræft. For at bekræfte den ændrede udtryk niveau af
miR-205
i livmoderhalskræft, vi målte
miR-205
udtryk ved real-time kvantitativ revers transkription-PCR (QRT-PCR) i 27 matchede par af livmoderhalskræft og normalt væv. Efter aftale med sekventering-baserede resultater,
miR-205
blev fundet signifikant overudtrykt i human livmoderhalskræft i forhold til deres normale modstykker
P
0,001; Figur 1A). I 19 tilfælde (-70%) udtryk for
miR-205
var stærkt forøget i tumorprøver i forhold til deres normale modstykker; mens der i de resterende 8 sager, kræft og normale prøver udviste lave, men sammenlignelige ekspressionsniveauer af
miR-205 Hotel (figur 1B).
(A)
miR-205
udtryk var signifikant højere i tumorerne end de normale prøver (
P
0,001; parret t-test). (B) relativt højere ekspression af
MIR-205
blev fundet i et flertal af tumorprøver i sammenligning med deres normale modstykker. (C) Høj udtryk for
miR-205
blev påvist i ME-180, blev C4I og CaSki celler og lav eller målbart udtryk niveau findes i HeLa, SW756, SiHa og C33A celler. Data præsenteret repræsenterer gennemsnit af tre uafhængige forsøg med triplikater. Fejl søjler repræsenterer standardafvigelser fra middelværdien.
Funktionelle konsekvenser af
miR-205
forordning i Human livmoderhalskræft celler
De funktionelle konsekvenser af ændrede
miR-205
udtryk blev undersøgt i livmoderhalskræft cellelinjer med høje eller lave niveauer af endogene
miR-205
. Til dette formål
miR-205
blev kvantificeret i humane livmoderhalskræft cellelinier ved QRT-PCR. Blandt de 7 cellelinjer analyseret,
miR-205
blev fundet stærkt udtrykt i ME-180, C4I og CaSki, mens lav udtryk /knap påviselige niveauer blev fundet i HeLa, SW756, SiHa og C33A (figur 1C) . Næste vi transficerede CaSki celler med et miRNA-hæmmer (Anti-mir-205), og HeLa og SW756 celler med en miRNA mimic (Pre-miR-205), og bestemmes effekten af
miR-205
lyddæmpning eller overekspression på celleproliferation, apoptose og migration. Som negative kontroller brugte vi en miRNA forløber eller inhibitor uden sekvenshomologi til eventuelle menneskelige udskrifter.
Vi observerede, at hæmning af
miR-205
udtryk i CaSki celler førte til et betydeligt fald i celle vækst (-15%;
P
0,001), mens overekspression af
MIR-205
i HeLa og SW756 celler resulterede i markante celledeling (ca. 20% og ~11% henholdsvis
P
0,05), sammenlignet med de respektive negative kontroller (figur 2A). Tilsammen både GAIN- og tab af funktion eksperimenter konsekvent støttet effekter på celleproliferation.
Virkninger på celle migration blev påvist ved hjælp af Transwell og sårheling migration assays. Brug af Transwell assay, viste vi, at celle migration blev forbedret betydeligt ved
miR-205
overekspression i både HeLa og SW756 cellelinjer (ca. 20% og -30%, henholdsvis;
P
100-fold,
P
0,01) og
miR-30a-5p
( 10 fold,
P
. 0,01) i anti-Ago2 IP i forhold til anti-IgG IP eller input kontrol (Figur S2)
i vores CLIP-Chip-analyse, vi udelukket en af de replikere mikroarrays fra
miR-205
overekspression eksperimenter på grund af dårlig hybridiseringssignaler. Efter filtrering af baggrundssignaler, vi udførte ukontrollerede hierarkisk gruppering af de fem mikroarrays baseret på deres mRNA ekspressionsmønstre. Vi fokuserede på de seks klynger (herunder 270 udskrifter /252 kommenterede gener), hvor ekspressionsmønstre viste berigelse i
miR-205
overekspression og udtynding i
MIR-205
undertrykkelse eksperimenter (figur S3 og tabel S1). Vi udførte funktionel annotation på CLIP-Chip mål ved hjælp GENECODIS program. Flere funktionelle grupper var signifikant beriget (
P
0,05), herunder cellecyklus, viral reproduktion, DNA-reparation, apoptose, celleproliferation og migration (tabel 1). En detaljeret liste over funktionelle anmærkninger er givet i tabel S2. Blandt de 75 kandidatlande mål, der er anført i tabel 1, blev 71 også forudsagt som
miR-205
mål i mindst en forudsigelse program (tabel S3), og fire mål (
BOD1
,
SEPT2
,
AAGAB
DCAF13
) blev ikke forudsagt af nogen af de programmer, der anvendes i denne undersøgelse.
Blandt kandidat målgener, vi fandt
Cyr61
og
CTGF
var forbundet med både celleproliferation og migration (tabel 1), og det er i overensstemmelse med vores funktionelle konsekvenser observeret i denne undersøgelse. For yderligere at forstå udtrykket forholdet mellem
MIR-205
og
Cyr61
eller
CTGF
, vi bestemt udtryk for
Cyr61
og
CTGF
i 28 matchede par af livmoderhalskræft og normale væv ved hjælp af QRT-PCR. Vores resultater viste signifikant lavere udtryk for både
Cyr61
og
CTGF
i humane livmoderhalskræft prøver i forhold til deres normale modparter (
P
= 0,002 og
P
0,001, henholdsvis, figur 3A-C). Interessant, blev udtrykket mønstre af disse to udvalgte gener omvendt korreleret med
miR-205
udtryk (
Cyr61
,
Corr
= -0,241,
P
= 0,091;
CTGF
,
Corr
= -0,304,
P
= 0,032, figur 3D). De observerede inverse ekspressionsmønstre sammen med den forudsagte
miR-205
bindingssteder (tabel S3, figur S4), giver yderligere bevis for
Cyr61
og
CTGF
som
miR-205
mål.
(a) Cell proliferation blev vurderet i humane livmoderhalskræft cellelinjer transficeret med en
miR-205
efterligner (Pre-miR-205), inhibitor (Anti-miR-205) eller tilsvarende negativ kontrol (Anti-miR Neg kontrol eller Pre-miR Neg kontrol) ved brug WST-1 analysen. Relativ cellevækst blev normaliseret med sine respektive kontrol-behandlede celler. (B) grafer, der viser relativ cellemigrering i både
MIR-205
inhibering og overekspression eksperimenter som evalueret af Transwell migration assay. (C) Repræsentative billeder af cellemigrering evalueret ved sårheling assay. Scratch sår blev foretaget på sammenflydende monolag kulturer efter 48 timers transfektion. Billeder af sårheling blev taget ved 0, 18 og 24 timer efter sår (venstre panel). Procentdelen af sårlukning blev normaliseret ved sårområde på 0 timer (højre panel). Data præsenteret repræsenterer gennemsnit af tre uafhængige forsøg. Fejl søjler repræsenterer standardafvigelser fra middelværdien. Alle sammenligninger blev evalueret under anvendelse af t-test. *
P
0,05; **
P
0,01; ***
P
0,001;
ns
= ikke signifikant.
Relativt lavere udtryk for
Cyr61 Hotel (A) og
CTGF
(B) blev fundet i et flertal af tumorprøver i sammenligning med deres normale modstykker (n = 28). (C) Udtrykket af
Cyr61
og
CTGF
var signifikant lavere i tumorerne end de normale prøver (
P
= 0,002 og
P
parret t-test). (D) Invers korrelation mellem ekspressionsniveauet af
miR-205
Cyr61
(øvre) eller
CTGF
(lavere). Udtrykket forholdet blev bedømt ved Pearsons korrelationsanalyse.
P
. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant
Validering af
Cyr61
og
CTGF
som
miR-205
målgener
for at afgøre, om
Cyr61
og
CTGF
kunne være mål for
MIR-205
i humane livmoderhalskræft celler, vi anvendt to forskellige tilgange. Først, vi vurderet de protein ekspressionsniveauerne af Cyr61 og CTGF i både
miR-205
-overexpressing og -depleted livmoderhalskræft celler ved hjælp af Western blot-analyse. Som vist i figur 4 (A og B),
MIR-205
over-ekspression i HeLa-celler resulterede i et signifikant fald i cyr61-proteinekspression (-30%,
P
= 0,045) . Hæmning af endogen
miR-205
udtryk i CaSki celler signifikant forøget Cyr61 protein niveau (-15%,
P
= 0,016). For CTGF, observerede vi et mindre fald eller stigning (men ikke statistisk signifikant) proteinekspression i
MIR-205
-overexpressing eller -depleted celler. En plausibel forklaring er, at CTGF kan reguleres af flere miRNA eller faktorer, og modulerende
miR-205
udtryk alene ikke var tilstrækkeligt til at give væsentlige ændringer på CTGF proteinekspression niveau.
(A) repræsentative Western blot, der viser protein ekspressionsniveauer af cyr61 og CTGF i celler transficeret med en
mIR-205
mimic,
mIR-205
inhibitor eller tilsvarende scramble og mock transfektions- kontroller. (B) Cyr61 proteinekspression var signifikant undertrykt i
MIR-205
-overexpressing (behandlet med Pre-miR-205) celler og steget betydeligt i
MIR-205
-depleting (behandlet med anti -miR-205) celler i sammenligning med deres respektive negative kontroller. CTGF-proteinekspression blev lidt fortrængt i HeLa-celler behandlet med Pre-MIR-205, og steg svagt i CaSki-celler behandlet med anti-MIR-205, men effekten var ikke statistisk signifikant. Data præsenteret repræsenterer gennemsnittet af mindst fire uafhængige forsøg. QRT-PCR-analyse af
Cyr61
(C) og
CTGF
(D) mRNA i Ago2-immunpræcipiteret RNA’er af
MIR-205
-overexpressing eller -depleted celler som sammenlignet med mock-transfektion kontrol. Relativ udtryk for individuelle mRNA blev normaliseret til
miR-21
udtryk (som endogen kontrol for Ago2 IP-RNA). Fold ændring blev beregnet ved at dividere de normaliserede ekspressionsniveauer værdier Ago2-immunoprecipiated prøver ved de normaliserede ekspressionsniveauer værdi af dets respektive indgangseksempleringer. Data præsenteret repræsenterer middelværdien af mindst tre uafhængige forsøg. Fejl søjler repræsenterer standardafvigelser fra middelværdien. Alle sammenligninger blev vurderet ved hjælp af
t
-test. *
P
0,05; **
P
0,01; ***
P
0,001;
ns
= ikke signifikant.
I den anden tilgang, vi kvantificeret
Cyr61
og
CTGF
mRNA i Ago2-immunopræcipiterede mRNA i både
miR-205
-overexpressing og udtømte celler ved hjælp QRT-PCR, og sammenlignet deres niveauer med mocktransfekterede kontroller. Dette forsøg er baseret på den antagelse, at miRNA og deres mRNA-mål er fysisk forbundet med Ago2-holdige protein-kompleks. Derfor forventede vi berigelse af target mRNA i
miR-205
over-udtrykkende celler, eller udtømning af målene i celler med
miR-205
hæmning. Faktisk vi observeret signifikante berigelser af
Cyr61
(
P
= 0,050) og
CTGF Hotel (
P
= 0,007) mRNA i HeLa celler med overekspression af
MIR-205
og udtynding af begge udskrifter i CaSki celler med
miR-205
hæmning (
P
0,001 for begge mål, 4C og 4D) . Disse resultater tyder på, at både
Cyr61
og
CTGF
er mål for
MIR-205
i humane livmoderhalskræft celler.
Diskussion
Observationer af forøget eller formindsket ekspression af
mIR-205
i forskellige tumortyper antyder, at
mIR-205
kan have forskellige funktioner i udvikling af kræft afhængigt af celletype involveret. I overensstemmelse med dette begreb har tidligere undersøgelser vist sin tumorsuppressionsfunktion i både bryst- og prostatacancerceller [22] – [24], og dets tumorpromotion funktion i hoved og hals pladecellecarcinom celler [14]. I dette arbejde, vi yderligere undersøgt dets funktionelle konsekvenser og mål i humane livmoderhalskræft celler.
miR-205
Regulerer Cell Proliferation og migration i Human livmoderhalskræft celler
Her , vi først bekræftet ved QRT-PCR at
miR-205
væsentligt overudtrykt i livmoderhalskræft prøver i forhold til deres normale modstykker. Resultatet er i overensstemmelse med vores tidligere sekventering baserede resultater [9], og med de microarray data indberettet af Wang et al. [8]. I betragtning af den observerede øget ekspression af
miR-205
i livmoderhalskræft væv, vi yderligere undersøgt de funktionelle konsekvenser af
miR-205
regulering i humane livmoderhalskræft celler. I begge
miR-205
-overexpressing celler (HeLa og SW756), vi observerede signifikante virkninger på celleproliferation og migration. Følgende
MIR-205
inhibering i CaSki-celler, proliferation blev signifikant reduceret, men virkningen på cellemigrering blev først afsløret i sårheling assayet, men ikke i Transwell migration assay. En mulig årsag til denne forskel er, at celle migration afhænger af forskellige faktorer i de respektive analyser. Den cellemigrering som optræder under sårheling er afhængig celle-matrix-interaktion. Men i Transwell assay celler først fremstilles i enkeltceller suspensionen, som vil forstyrre celle-celle- og celle-matrix-interaktioner. Endvidere kan cellemigration i Transwell assay afhænger den kemotaktiske gradient, som ikke er tilgængelig i sårhelende assay.
Virkninger på celleproliferation og migration ligner dem observeret her i human livmoderhalskræft er også blevet rapporteret i andre celletyper. F.eks
MIR-205
overekspression ført til et øget celleproliferation i muse brystepitelceller-stamceller [25] og cellemigration i humane keratinocytter [26]. Derimod forøget ekspression af
MIR-205
blev fundet at undertrykke celleproliferation i melanom [17] og brystcancerceller [27], samt cellemigrering i forskellige cancercellelinier, herunder SK- LU-1 småcellet lungecancer [28], U87 glioblastom [28] og A498 nyrecancer [19]. Tilsammen disse resultater yderligere at understøtte den dobbelte funktion af
MIR-205
som en tumor suppressor eller et onkogen.
Cyr61
og
CTGF
som nye mål af
miR-205
på grund af sin funktionelle kompleksitet, vi anvendte en biokemisk tilgang (CLIP-Chip) til at identificere den
miR-205-
target interaktioner
in vivo
. Ved hjælp af denne metode, vi identificeret et sæt
miR-205
mål fra både GAIN- og tab af funktion eksperimenter. Blandt disse, flere er funktionelt relateret til celleproliferation og migration; hvilket er i overensstemmelse med de funktionelle konsekvenser observeret i denne undersøgelse. To af målgener,
Cyr61
og
CTGF
, blev yderligere valideret på protein og /eller RNA-niveauer. Men deres præcise interaktion site (s) behov, der fastlægges yderligere ved luciferase reporter assays. I denne undersøgelse har vi ikke udføre Cyr61 og CTGF hæmning livmoderhalskræft celler, er det muligt, at andre direkte mål (e) bidrager til
miR-205
medieret virkninger på cellulær proliferation og migration. Men disse gener havde betydeligt lavere udtryk i livmoderhalskræft prøver end deres normale modparter, hvilket tyder på, at de kan spille en vigtig rolle i livmoderhalsen carcinogenese.
Cyr61 og CTGF proteiner er medlemmer af cystein rige 61 /binde- væv vækst faktor /nefroblastom (CCN) familie af vækstreguleringsmidler. Disse proteiner spiller forskellige roller i mange cellulære processer, herunder udvikling, celleproliferation, adhæsion, migration, angiogenese og tumorigenese [29]. CCNS er aberrerende udtrykt i en lang række tumortyper [29]. Interessant, kan både Cyr61 og CTGF fungere som tumor undertrykkere eller onkogener afhængig af den cellulære kontekst (se eksempler nedenfor); som er magen til den dobbelte funktion
MIR-205
.
I konkordans vores observationer, deregulering af Cyr61 og CTGF er også blevet påvist i adskillige andre undersøgelser. For eksempel,
cyr61
udtryk nedreguleret i livmoderhalskræft [30], lungecancer [31] – [33], endometriecancer [34] og hepatocellulært carcinom [35]; imidlertid har sin opregulering blevet rapporteret i flere forskellige tumortyper, herunder osteosarcom [36], gliom [37], [38] og brystcancer [39], [40]. Svarende til Cyr61 har tidligere undersøgelser afsløret modstridende ekspressionsmønstre for CTGF i forskellige tumortyper. For eksempel faldt CTGF ekspression er blevet rapporteret i lungekræft [31], brystcancer [40], Wilms tumor [41] og ovariecancer [42]; mens øget ekspression blev fundet i papillær kræft i skjoldbruskkirtlen [43], kolorektal cancer [44], hoved og hals pladecellekræft [45], [46] og glioblastom [47].
Det er interessant,
miR -205
, Cyr61 og CTGF er involveret i fælles funktionelle processer og veje. Svarende til de funktionelle konsekvenser af
MIR-205
observeret i denne undersøgelse, Cyr61 har vist sig at undertrykke cellevækst i lungecancer [32] og hepatocellulær cancer [35]. På den anden side, nedregulering af cyr61 undertrykker celleproliferation og migration i gliomer [37] og bugspytkirtelkræftceller [48]. Tab af
miR-205
udtryk fører til induktion af epitelial-til-mesenkymale overgang (EMT) [23], [24], mens tavshed af cyr61 udtryk hæmmer EMT [48]. Udtømning af
miR-205
Cyr61 udtryk hæmmer Akt signalering i keratinocytter, orale pladecellekræft celler [14] og gliom celler [37]. Ligesom Cyr61 og
MIR-205
, CTGF er også blevet påvist at spille både onkogene og suppressor roller i en lang række cancer celletyper [45], [47], [49] – [51], og det er også involveret i både EMT [52], [53] og Akt vej [54] – [56]. På trods af de mange undersøgelser, der er nævnt ovenfor, roller Cyr61 og CTGF i human livmoderhalskræft fortsat uklare. Det vil være af interesse at bestemme de funktionelle roller disse faktorer i livmoderhalskræft og vurdere deres samspil med
miR-205
i forskellige typer kræft.
Sammenfattende vi rapporterer funktionelle virkninger på tumor fænotyper og nye mål for
miR-205
i humane livmoderhalskræft celler. Vi viser, at
miR-205
spiller en onkogen rolle i human livmoderhalskræft ved at fremme celleproliferation og migration. Derudover har vi identificeret et sæt roman
miR-205
mål ved hjælp af en kombination af biokemiske og microarray tilgang. Blandt dem,
Cyr61
og
CTGF
blev yderligere bekræftet ved protein og /eller RNA-niveauer. Vigtigere, blev disse to gener nedreguleret i humane livmoderhalskræft prøver. Vores resultater tyder på, at
miR-205
og dens mål (
f.eks
Cyr61 og CTGF), kan spille en vigtig rolle i patogenesen af livmoderhalskræft, og at
miR-205
(og dens mål), kan give potentielle diagnostiske værdier for cervikal patologi.
Materialer og metoder
vævsprøver og etiske retningslinjer
Tredive par snap-frosne cervikal tumor og matches normale væv fra tilstødende områder af 30 patienter blev tilvejebragt af Gynecologic Oncology Group Tissue Bank (Columbus, Ohio). Tumor og normale vævsprøver var blevet bekræftet som tumor eller ikke-tumor ved histopatologisk undersøgelse af hematoxylin og eosin-farvede paraffinsnit. Ni og tyve par af prøverne blev inkluderet i vores tidligere lille RNA profilering af dyb sekventering teknologi [9]. Undersøgelsen blev godkendt af Karolinska Institutet Ethics Committee. Ingen skriftligt informeret samtykke blev nødvendig, fordi alle kliniske materialer blev deidentified. Den etik udvalg Bestyrelsen for Karolinska Institutet specifikt frafaldes behovet for samtykke
Cervikal kræftceller
Syv humane livmoderhalskræft cellelinjer blev anvendt:. CaSki, HeLa, SW756, ME-180, SiHa, C4I og C33A. CaSki og ME-180 celler blev oprindeligt etableret fra metastatiske steder af livmoderhalskræft, og de andre cellelinjer blev afledt fra primære cervikale tumorer [57] – [61]. Disse linjer blev venligst stillet til rådighed af Dr. Keng-Ling Wallin (Karolinska Universitetshospital, Sverige), og var blevet købt fra American Type Tissue Culture (ATCC). CaSki og ME-180-celler blev dyrket i RPMI 1640, mens HeLa, SW756, SiHa, C4I og C33A celler blev dyrket i DMEM-medium. Alle celler blev suppleret med 10% FBS og 1% penicillin /streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA) og dyrket ved 37 ° C og 5% CO
2 i en fugtig inkubator.
TaqMan Kvantitativ Reverse Transcription -PCR (QRT-PCR)
Ekspression af modne miRNA og mRNA’er blev kvantificeret ved QRT-PCR under anvendelse af et Applied Biosystems 7500 Hurtig Real-time PCR-system (Applied Biosystems). RNA blev ekstraheret under anvendelse Mirvana miRNA isolation kit (Applied Biosystems /Ambion, Austin, TX) under anvendelse lille RNA berigelse fra vævsprøver og totalt RNA isoleret fra cellelinier. RNA-koncentrationer blev målt ved anvendelse af et NanoDrop ND-1000 spektrofotometer (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE).
I modne miRNA, blev cDNA syntetiseret fra 25 ng små RNA-beriget RNA til vævsprøver, 120 ng total RNA til cellelinier eller 15 ng Ago2-immunpræcipiteret RNA’er under anvendelse Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). Forhåndsudformede TaqMan miRNA tests for
miR-205 Hotel (ID 000.509),
miR-21 Hotel (ID 000.397) og
miR-30a-5p
(ID 000.417) blev købt fra Applied Biosystems. Alle reaktioner blev udført i tre eksemplarer på tre uafhængige lejligheder, og relative ekspressionsniveauer blev normaliseret til det geometriske gennemsnit af
RNU6B
(ID 001.093) og
RNU43
(ID 001.095), og rapporteret som to
-ΔCT.
for mRNA kvantificering, blev cDNA syntetiseret fra 200 ng store RNA fraktion (
dvs
RNA fraktion tilbage efter små RNA berigelse) for vævsprøver eller 50 ng Ago2-immunopræcipiteret RNA ved hjælp af High Capacity cDNA Reverse Transcription kit (Applied Biosystems).
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.