PLoS ONE: Eksklusiv Foreningen af ​​p53 mutation med Super-High Methylering af tumorsuppressorgener i p53 Pathway i en unik Gastric Cancer Phenotype

Abstrakt

Baggrund

En omfattende søgning for DNA methylerede gener identificeret kandidat tumorsuppressorgener der har vist sig at være involveret i den apoptotiske proces af

p53

vej. I denne undersøgelse undersøgte vi

p53

mutation i relation til en sådan epigenetisk ændring i primær mavekræft

Metoder

De methylering profiler af de 3 gener:.

PGP9

.

5

,

NMDAR2B

, og

CCNA1

, som er involveret i p53 tumor suppressor pathway i kombination med

p53

mutation var undersøgt i 163 primære gastriske cancere. Effekten af ​​epigenetisk reversion i kombination med kemoterapeutiske lægemidler på apoptose blev også vurderet i henhold til tumoren

p53

mutation status.

Resultater

p53

gen mutationer blev fundet i 44 primære gastriske tumorer (27%), og super-high methylering af nogen af ​​de 3 gener blev kun fundet i tilfælde med vildtype

p53

. Højere

p53

pathway aberration blev fundet i tilfælde med mandligt køn (p = 0,003), intestinal type (p = 0,005), og ikke-infiltrerende type (p = 0,001).

p53

pathway aberration gruppe udviste mindre tilbagefald i lymfeknuder, fjerntliggende organer, og bughinden end den

p53

non-aberration gruppe. I NUGC4 mavekræft cellelinje (

p53

vildtype), epigenetisk behandling augmented apoptose ved kemoterapeutiske stoffer, delvist gennem

p53

transskription aktivitet. På den anden side, i KATO III cancercellelinie (

p53

mutant), epigenetisk behandling alene inducerede robust apoptose, med ingen trans-aktivering af

p53

.

Konklusion

I mavekræft,

p53

findes relevante og ikke-relevante veje, og tumorer med enten sti typen udstillet unikke kliniske funktioner. Epigenetiske behandlinger kan inducere apoptose delvist gennem

p53

aktivering, men deres apoptotiske virkninger kan forklares i høj grad af andre end gennem

p53

veje

Henvisning mekanisme:. Waraya M, Yamashita K, Ema a, Katada N, Kikuchi S, Watanabe M (2015) Eksklusiv Sammenslutningen af ​​

p53

Mutation med Super-High Methylering af tumorsuppressorgener i

p53

Pathway i en unik Gastric cancer fænotype. PLoS ONE 10 (10): e0139902. doi: 10,1371 /journal.pone.0139902

Redaktør: Qian Tao, Den kinesiske University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: 31 marts 2015; Accepteret: September 18, 2015; Udgivet: 8 oktober 2015

Copyright: © 2015 Waraya et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet delvist af Grant-in Aid for Cancer Research fra Sundhedsministeriet, Labor og dyrevelfærd Japan og af den japanske Foundation for tværfaglig Behandling af kræft. De finansieringsorganer havde ingen rolle i udformningen af ​​undersøgelsen, dataindsamling, eller analyse ved fortolkningen af ​​resultaterne; i udarbejdelsen af ​​manuskriptet; eller i beslutningen om at indsende manuskriptet til offentliggørelse

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

DNA methylering spiller en central rolle i. gendæmpning af tumorsuppressorgener i human cancer. En kræft-specifik methylering gen er en sjælden enhed, og hyppig aberration af methylering i primære tumorvæv er endnu mere sjælden [1, 2]. Vi identificerede cancerspecifikke methylerede gener i hvert organ under anvendelse af en farmakologisk demaskering microarray (PUM) [1, 2] og en modificeret PUM [3-5]. Vi identificerede mange kandidat tumorsuppressorgener (GTS), såsom

PGP9

.

5 fotos i hoved og hals pladecellekræft (HNSCC) [2], esophageal SCC (ESCC) [6] , gastrisk kræft [4], og andre kræftformer [7],

NMDAR2B

i ESCC [3] og gastrisk kræft [8], og

CCNA1

i HNSCC [2]. De methylering profiler af disse gener er blevet valideret af andre grupper og /eller endda i andre kræftformer [9-14]. Gener, der viste over 60% methylering i tumorvæv blev betegnet som yderst relevante denatureret gener (HRMGs) [15]. Desuden har vi yderligere i forhold hyppigheden af ​​en sådan afvigende methylering af kandidat HRMGs med andre rapporter om mavekræft [16], og gen kandidater blev indsnævret til specifikke gener.

Vigtigst disse kandidat tumorsuppressorgener havde været rapporteret at være i

p53

tumor suppressor pathway (figur 1). For eksempel,

PGP9

.

5 fotos direkte interagerer med

p53

og stabiliserer

p53

ved at hæmme dets nedbrydning gennem ubiquitinering vej hos hepatocellulært [17] , bryst [18], og nasopharyngeal cancer [19].

NMDAR2B

inducerer apoptose gennem sin direkte interaktion med

DAPK

[20], som til gengæld har vist sig at modvirke onkogen-induceret transformation ved at aktivere en

p19ARF

/

p53

-afhængige apoptotisk checkpoint [21].

CCNA1

er en

p53

induceret gen, der medierer apoptose, G2 /M anholdelse, og mitotisk katastrofe i human renal, ovarie og lunge kræftceller [22]. Derfor er det

p53

pathway er poleres i tumorvæv af primære kræftformer i en epigenetisk måde sammen med vildtype

p53

, men der har ikke været nogen rapport om sammenslutning af

p53

mutation og epigenetiske ændringer i de primære tumorvæv.

i denne undersøgelse undersøgte vi status DNA methylering af gener i

p53

vej, der er unormalt reguleret i en epigenetisk måde i primær gastrisk kræft, og sammenlignet deres methylering mønster med

p53

mutation status, for at bestemme den kliniske betydning af

p53

aberration fænotyper.

Metoder

cellelinjer og vævsprøver

de gastrisk cancer cellelinjer, KatoIII, NUGC4, AZ521, og SH10 blev købt fra Riken Bioresource center (Ibaraki, Japan). Og hepatocellulært carcinom HepG2 blev erhvervet fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Disse cellelinier undtagen AZ521 og HepG2 blev dyrket i RPMI 1640 medium (GIBCO, Carlsbad, CA) suppleret med 10% føtalt bovint serum. AZ521 og HepG2 blev dyrket i DMEM-medium (GIBCO), suppleret med 10% FBS.

Par (n = 163) af formalin-fikseret, paraffin-indstøbt (FFPE) tumorvæv og tilsvarende normale slimhinder prøver opnået ved mindst 5 cm fra tumoren kant blev opnået fra patienter, der gennemgår kirurgi mellem den 1. januar 2000, og 31. december 2010. Alle patienterne med trin II /III GC havde undergået en potentiel kurativ resektion for den primære GC, og gennemgik adjuvans S -1 kemoterapi efter kirurgi (S-1 standard behandling). Neo-adjuverende behandling blev ikke foretaget i denne patient kohorte. Tumorer blev klassificeret ved hjælp af TNM klassifikationen efter 7

th udgave af Union for International Cancer Control (UICC) og 14

th udgave af den japanske Klassificering af gastrisk karcinom (JCGC). Patienternes egenskaber er afbildet i tabel 1. Alle vævsprøver blev indsamlet ved Kitasato Universitetshospital, og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter og raske donorer før prøvetagning. Den foreliggende undersøgelse blev godkendt af den etiske komité i Kitasato University.

Analyse af muterede

p53

gener ved hjælp af single-konformationspolymorfisme (SSCP)

Mutationer i exonerne 5, 6, 7 og 8 i

p53

genet, blev screenet ved ikke-radioaktivt enkeltstrenget konformation polymorfisme (SSCP) -analyse, som blev udført under anvendelse af vores tidligere etablerede fremgangsmåder [23]. PCR-produkt prøver af 10 pi blev fortyndet tre gange med gel-ladningsbuffer (95% deioniseret formamid, 20 mmol /l EDTA, 0,01% bromphenolblåt og 0,01% xylencyanol) og opvarmet til 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af bratkøling på is. Alikvoter på 3 pi blev påført modificerede polyacrylamidgeler (PAFG: 18% polyacrylamid-bis (49: 1), 0,5x TBE, 10% glycerol, 10% formamid, 0,05% ammoniumpersulfat og 30 ml TEMED) med dimensioner 120 mm x 150 mm x 0,35 mm. Elektroforese blev udført med 1,5 x TBE løbende buffer ved 500 V og 30 mA i 1 time ved stuetemperatur. Bånd blev detekteret ved farvning geler under anvendelse af en sølvfarve plus kit (Bio-Rad, Hercules, CA), efterfulgt af fiksering, skylning, udvikling, og standsning af reaktionen. Muterede bånd detekteret med PCR-SSCP var tydelige ved 1:64 fortynding af muterede alleler.

bisulfitbehandling af ekstraheret DNA

Genomisk DNA fra FFPE væv og cellelinier blev ekstraheret ved hjælp af QIAamp DNA FFPE tissue (Qiagen Sciences, Maryland, MD) og QIAamp DNA Mini kit (QIAGEN) i overensstemmelse med producentens protokoller. For DNA denaturering blev 2 ug genomisk DNA inkuberet med 5 ug laksesperma-DNA i 0,3 mol /l NaOH i 20 minutter ved 50 ° C. DNA-prøven blev derefter fortyndet med 500 pi af en opløsning indeholdende 2,5 mol /l natriummetabisulfit (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO) /125 mmol /l hydroquinon (Sigma) /0,4 mol /l natriumhydroxidopløsning, og blev inkuberet ved 70 ° C i 1,5 timer. Prøven blev derefter sat på en søjle (Wizard DNA Clean-UP system, Promega Inc., Madison, WI), inkuberet med 0,3 mol /l NaOH i 10 minutter, og derefter behandlet med 3 mol /l ammoniumacetat i 5 minutter. Prøven blev udfældet i 100% ethanol, og DNA’et blev resuspenderet i 50 pi Lote indeholdende 10 uM Tris-HCI, pH 8 og 2,5 uM ethylendiamin tetraeddikesyre (EDTA), pH 8, og blev efterfølgende amplificeret ved en polymerasekædereaktion (PCR). Bisulfit behandling resulterer i kemisk modifikation af ikke-methylerede, men ikke methylerede, cytosiner til uraciler, tillader skelnen mellem methyleret og umethyleret genomisk DNA.

Quantitative-methylering-specifik PCR (Q-MSP)

til kvantitativ methylering analyse blev TaqMan methylering specifik PCR (Q-MSP), gennemføres med iQ ™ Multiplex Powermix (Bio-Rad) i tre eksemplarer på iCycler iQ ™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad). PCR-betingelser og sekvenser er tilvejebragt i S1 tabel. Seriefortyndinger af bisulfit modificerede CpGenome universal methyleret DNA (Chemicon International, Temecula, CA) blev anvendt til fremstilling af kalibreringskurven på hver plade som methylering positive kontroller og CpGenome universal umethyleret DNA (Chemicon International) blev anvendt som negativ kontrol. Den methylering værdi (TaqMeth værdi) blev defineret som forholdet mellem methylerede

PGP9

.

5

,

NMDAR2B

,

CCNA1

, eller

DAPK

normaliseret til methylerede

β-actin

, som derefter blev ganget med 100.

immunhistokemisk farvning af PGP9.5, NMDAR2B, og CCNA1

for immunfarvning, antigen demaskering blev udført med autoklav iblødsætning, blev endogen peroxidaseaktivitet blokeret ved inkubering i 3% H

2O

2 /methanol i 5 minutter, og ikke-specifik antistofbinding blev blokeret ved inkubering med 1% fortyndet normalt hesteserum i 30 minutter. Snit blev derefter inkuberet ved 4 ° C natten over med følgende antistoffer: kanin PGP9.5 polyklonalt antistof (fortynding på 1:. 200, Nonus Biogenesis), kanin NMDAR2B polyklonalt antistof (fortynding på 1: 100, Millipore), eller mus Cyclin A monoklonalt antistof (6E6, fortynding af 1:50, Leica Biosystems Newcastle. Ltd). Immune komplekser blev detekteret med Vectastain Elite ABC-kittet (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) ifølge producentens instruktioner. Disse immunkomplekser blev påvist under anvendelse af 3,3′-diaminobenzidin-substrat (Vector) som et chromogen (PGP9.5 1,5 minutter, NMDAR2B 6 minutter, CCNA1 10 minutter). Sektioner blev modfarvet med hæmatoxylin.

Epigenetisk behandling med 5-Aza-dC og TSA, og kemoterapeutisk behandling med CDDP

Celler blev delt og podet ved en lav densitet (1×10

6 /T-75-kolbe) 24 timer før behandling. Celler blev derefter behandlet hver 24. time i 4 dage med enten 1 eller 5 pM 5-aza-2′-deoxycytidin (5-aza-dC; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) opløst i 50% eddikesyre eller var mock behandlet med PBS herunder den samme mængde eddikesyre. Som anført, 100 nM trichostatinA (TSA; Sigma-Aldrich). Og /eller 12,5 uM Cis-diamindichlorplatin (CDDP) (Nichi-Iko Pharmaceutical Co., Ltd., Japan) tilsat for de sidste 24 timer

Western blotting-analyse

Totalt protein blev ekstraheret fra cellelinier, som blev epigenetisk behandlet med /uden kemoterapeutisk behandling, og blev underkastet Western blotting-analyse under anvendelse af følgende antistoffer: muse-anti-p53 monoklonalt antistof (1C12, fortynding på 1: 1000, Cell Signaling Technology, Inc.) eller muse-anti-β-actin-IgG

2a monoklonalt antistof (fortynding på 1: 10000, Sigma-Aldrich)

p53 reporter assay

celler (2x 10

4 celler /plade med 96 brønde), der blev epigenetisk behandlet med /uden kemoterapeutisk behandling blev transficeret med en

p53

reporter vektor (QIAGEN) ved hjælp af Signal ™ Pathway reporter Kits ( QIAGEN) og lipofectamin 2000-reagens (Invitrogen). Efter 24 timers inkubation blev reporter-aktivitet målt ved anvendelse af Dual-luciferase Reporter Assay System (Promega). Transfektioner blev udført tre gange og analyseret under anvendelse SoftMax Pro software (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Apoptose assay

Behandlede celler (1x 10

5 celler /prøve) blev farvet med annexin V og 7-AAD (Guava nexin reagens, Guava Technologies, Hayward, CA) for diskrimination af tidlige og sene apoptotiske celler. Eksperimentet blev udført under anvendelse af Guava PCA System, udført tre gange og analyseret under anvendelse CytoSoft 2.1.5 software (Guava Technologies).

Statistisk analyse

Fishers eksakte test eller Mann-Whitney U test blev anvendt til kategoriske variabler, og Students

t

-test blev brugt til kontinuerte variabler. Data er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse (SD). Kaplan-Meier-metoden blev anvendt til at estimere kumulative overlevelsesrater, og forskelle i overlevelsesrater blev vurderet ved anvendelse af log-rank test. Relapse overlevelse (RFS) og samlede overlevelse (OS) blev målt fra det tidspunkt, operation på dato recidiv og dødsfald eller sidste opfølgning. Med hensyn til RFS eller OS, blev patienter, som overlevede i mere end 60 måneder (5 år) analyseres som overlevende. P 0,05 blev anset for at indikere statistisk signifikans. Alle statistiske analyser blev udført med SAS softwarepakker (SAS Institute, Cary, NC).

Resultater

p53

gen status og methylering profiler af

PGP9

.

5

,

NMDAR2B

,

CCNA1

, og

DAPK

i pStage II-III mavekræft

p53 Salg mutationer blev identificeret i 44 ud af 163 primære mavecancerpatienter (27%) af SspC-analyse.

p53

genmutation ikke havde prognostisk relevans (Fig 2A). Vi analyserede derefter methylering profiler af

PGP9

.

5

,

NMDAR2B

,

CCNA1

, og

DAPK

i disse væv ved hjælp af Q-MFP. Den TaqMeth Værdien af ​​alle gener var højere i primære tumorer i mavekræft med vildtype

p53

end hos dem med mutant

p53

(gen methylering rækkefølge:.

PGP9

5

NMDAR2B

CCNA1

DAPK

) (fig 3A og S1 og S2 fig). Methylering af promotoren DNA var signifikant højere for

CCNA1

(p 0,0001) og

PGP9

5 fotos (p = 0,03), og marginalt signifikant højere for

NMDAR2B

(p = 0,10) og

DAPK

(p = 0,05) i primær gastrisk cancer sammenlignet med det tilsvarende normale slimhinde. Vigtigere er det, en super-high methylering niveau af

PGP9

.

5

,

NMDAR2B

, og

CCNA1

blev udelukkende fundet i primære tumorer uden

p53

mutation, skæringskurserne TaqMeth værdier var 50, 163, og 133, henholdsvis (figur 3A). Sådanne super-high methylering af

PGP9

.

5

,

NMDAR2B

og

CCNA1

blev fundet i 14, 19, og 8 prøver henholdsvis og nogle af disse prøver blev overlappende (figur 3B).

DAPK

ikke vise denne tendens, fordi det

DAPK

methylering niveau var forholdsvis høj i de tilsvarende normale slimhinde væv af en betydelig del af tilfældene (S2 Fig).

(A) i henhold til

p53

genmutation status og (B) i henhold til

p53

aberration gruppe.

(A) Methylering af de angivne gener blev analyseret ved hjælp af Q-MSP og TAqMeth værdierne i tumorer med

p53

vildtype blev sammenlignet med dem med

p53

mutation. Grænseværdien for bestemmelse, at et gen blev methyleret blev bestemt som den maksimale TaqMeth værdien af ​​

p53

vildtype. (B) tumorer med

p53

vildtype eller

p53

mutation blev sammenlignet med hensyn til tilstedeværelsen af ​​super-high methylering af de angivne gener. Super-high methylering blev defineret, at mindst et gen viste højere TaqMeth værdi end hver tærskelværdierne blandt tre gener.

immunhistokemisk analyse af PGP9.5, NMDAR2N, og CCNA1 proteinekspression i primær gastrisk kræft

Immunohistokemisk farvning for PGP9.5, NAMDR2B og CCNA1 proteinekspression blev derefter udført både i tilfælde med super-high methylering og dem med lav methylering af disse gener. En stærk reduktion i ekspressionen af ​​PGP9.5, NMDAR2B, og CCNA1 blev observeret i primære gastrisk cancer væv, når promotor-DNA methylering var super-høj (figur 3). På den anden side blev intet fald i proteinet ekspression af PGP9.5, NMDAR2B eller CCNA1 fundet, når promotoren DNA-methylering var lav (figur 4).

Immunhistokemisk farvning af PGP9.5, NMADR2B, og CCNA1 i primær tumor med eller uden hypermethylering af promotorregionen af ​​det tilsvarende gen (oprindelig forstørrelse, X100, målestokke 100 um).

klinisk-patologisk analyse i primær gastrisk cancer med patologisk stadium II /III mavekræft med standardbehandling

klinisk-patologisk funktioner og prognose (5-års RFS og OS) blev derefter analyseret i en univariable måde mavekræft med patologisk stadie II /III mavekræft med standard behandling (kirurgi plus postoperativ S- 1 indgivelse) (tabel 1). Vi klassificeret mavens kræftpatienter i 3 kategorier baseret på den

p53

mutation status samt status DNA methylering af

PGP9

.

5

,

NMDAR2B

og

CCNA1

, som vi er udpeget som genomiske og epigenetiske kategorier, henholdsvis (GEC). Disse tre kategorier var

p53

mutant,

p53

vildtype med super-høj methylering (SHM) af de ovennævnte 3

p53

pathway gener (

p53

WT /SHM), og

p53

vildtype uden (w /o) SHM (

p53

WT w /o SHM).

Interessant patientgrupper klassificeret baseret på GECs var signifikant korreleret med køn (p = 0,0003), alder (p = 0,08), Laurens histologi (p = 0,005) og infiltration mønster (p = 0,001), men ikke med prognostiske faktorer såsom mellemstationer faktorer. Patientgrupper klassificeret baseret på GECs viste også, at

p53

mutant og

p53

WT /SHM grupper var ens med hensyn til patientens tal for hver klinisk karakteristisk men adskilte sig i denne henseende i forhold til den

p53

WT w /o SHM gruppe. Således har vi nyudpegede de tidligere grupper (

p53

mutant plus

p53

WT /SHM grupper), som

p53

aberration gruppe, og den sidstnævnte gruppe (

p53

WT w /o SHM) blev udpeget som

p53

ikke-aberration gruppe.

Selvom prognosen var ikke signifikant forskellig mellem grupperne kategoriseret i henhold til GEC (fig 2B ), blev flere gentagelser fundet i

p53

aberration gruppe sammenlignet med

p53

ikke-aberration gruppe (tabel 1, ingen statistisk signifikant forskel). Denne tendens blev bevaret i form af gentagelse mønster af hver af de lymfeknuder, bughinden, og fjerntliggende organer (tabel 2), hvilket antyder, at

p53

aberration gruppe sandsynligvis vil udvise en klinisk unik fænotype selv fra en prognostisk synspunkt. Når der kun tilfælde med tilbagefald blev analyseret,

p53

aberration gruppe var igen signifikant associeret med Laurens histologi (tabel 2, P = 0,01), men der var ingen tilbagefald mønstre, der var unikke for

p53

aberration.

på den anden side, den diffuse type mavekræft viste signifikant bedre prognose end den intestinale type mavekræft i

p53

aberration gruppe (figur 5A). Da sådanne patienter tendens til at blive distribueret til en mere fremskredent stadium, disse overlevelsesdata foreslog, at S1 postoperativ adjuverende kemoterapi er mere effektiv for diffus form mavekræft end for tarm form mavekræft i sager med

p53

pathway aberration (Fig 5B).

(A) Overlevelse kurver for intestinal type blev sammenlignet med dem af diffus form mavekræft med pStage II /III. (B) Cancer fase fordeling i henhold til de

p53

aberration gruppe og histologiske fund.

Endelig, som referencedata (tabel 1), univariable prognostisk analyse for RFS og OS for alle patienter identificeret klinisk signifikante potentielle prognostiske faktorer repræsenterer dårlig overlevelse såsom køn (P = 0,03, P = 0,1), alder ≥67 år (p = 0,009, P = 0,001), øvre tumor placering (P = 0,06, P = 0,1), 14

th JGCA /7

th UICC pT (P = 0,08, P = 0,4), en 14

th JGCA pN (P = 0,001, P = 0,06), og en 14

th JGCA /7

th UICC stadium (P 0,0001, P = 0,03).

Epigenetisk behandling induceret p53 protein udtryk, samstemmende med p53 transkriptionel aktivitet

Epigenetisk behandling af NUGC4 gastrisk kræft celle linjer (vildtype

p53 Salg) med 5 uM 5-aza-2′-deoxycytidin eller 5 pM 5-aza-2′-deoxycytidin plus trichostatin A robust induceret apoptose i fravær af det kemoterapeutiske middel CDDP. Yderligere behandling med CDDP yderligere signifikant forøgede disse apoptotiske virkninger (Fig 6C). Interessant CDDP i kombination med epigenetiske behandlinger robust forøget p53-proteinet niveau, som delvis, men ikke fuldstændigt, afspejles

p53

transkriptionel aktivitet af et luciferasereportergen (Fig 6A og 6B). Disse resultater antydede, at

p53

transskription aktivitet kan reaktiveres ved epigenetiske behandlinger, men det tyder også på, at apoptose kun er delvist induceret gennem

p53

vej.

NUGC4 og KATOIII celler blev behandlet med demethyleringsmiddel, 5-aza-2′-deoxycytidin (5-aza-dC) i nærvær eller fravær af histon deacetylase (HDAC) -hæmmer, trichostatin A (TSA), og i nærvær eller fravær af det kemoterapeutiske reagens, CDDP. 1A og 5A, 1 og 5 uM 5-aza-dC; T, TSA. Efterfølgende blev cellerne analyseret for: (A) p53-protein-ekspression ved Western Blotting. (B) En dobbelt reporter assay for at bekræfte

p53

transskription aktivitet. Den stiplede linje viser den optimale afskæringsværdi (0,15) til bestemmelse af p53-aktivitet. (C) Cell apoptose blev analyseret ved anvendelse af en nexin Assay. Et repræsentativt billede vises. Data er vist som procentdelen af ​​tidlige og sene apoptotiske celler. * P 0,05, ** 0,001, ***. 0,0001

Desuden epigenetisk behandling af KATOIII gastrisk cancer cellelinier (

p53

null), med en pM 5-aza-2′-deoxycytidin eller 1 pM 5-aza-2′-deoxycytidin plus trichostatin A robust induceret apoptose i fravær af CDDP, men yderligere CDDP behandling ikke længere signifikant forøge de apoptotiske virkninger (fig 6C). CDDP i kombination med epigenetiske behandlinger forøgede ikke p53 proteinniveauet, hvilket blev afspejlet af manglen på

p53

transkriptionel aktivitet af et luciferasereportergen (Fig 6A og 6B). Disse resultater antydede, at

p53

transskription aktivitet er ikke nødvendig for apoptose ved epigenetiske behandlinger i KATOIII celler (

p53

null celler).

Diskussion

Dette aktuelle undersøgelse er den første rapport, at SHM af tumorsuppressorgener i

p53

pathway findes udelukkende i patologisk stadie II /III mavekræft med vildtype

p53 Hotel (figur 3). Vi valgte pStage II /III gastrisk kræftpatienter med standard behandlinger for

p53

pathway analyse, fordi tværfaglige behandlinger i sådanne patienter har det bedste potentiale for at opnå prognostiske forbedringer med komplet hærdelighed [24, 25]. Denne overvejelse bør være første prioritet, når man overvejer yderligere udvikling af nye terapeutiske strategier.

Næsten komplet methylering af promotor-DNA CpG øer er nødvendig for fuldstændig gendæmpning, og selv små mængder af methylerede alleler kan håndfast fremkalde genekspression [ ,,,0],1-5]. I de primære tumorvæv, skal SHM repræsenterer næsten fuldstændig methylering i cancerceller, og SHM i de primære tumorvæv var faktisk forbundet med reduceret protein ekspression af sådanne gener (figur 4). Dette resultat antydede, at SHM af gener i

p53

vej kunne være funktionelt svarer til

p53

funktionelle aberration, der opstår som et resultat af

p53

mutation, da disse 3 molekyler fungerer på samme

p53

vej.

i mavekræft,

p53

aberration gruppe var signifikant associeret med unikke klinisk-patologiske fænotyper såsom Laurens tarm histologi, mandlige køn, gamle alder, og mindre infiltrativ vækst (tabel 1). Vores nuværende observationer kan være relateret til tidligere rapporter, der påviste, at

p53

mutation er korreleret med tidlig fase af intestinal type, gastrisk kræft eller med sent tidspunkt i diffus form mavekræft [26, 27], eller ældre alder [ ,,,0],28], men vores klinisk-patologisk analyse omfattede hovedsagelig mellemste trin mavekræft. Interessant, pathway aberration er unik og vedvarende selv i tilbagevendende patienter (tabel 2).

Positiv prognostisk relevans af

p53

mutation i mavekræft er kontroversiel med både tilhængere [29] og afvigere [30 ] af denne mulighed. Ved første øjekast ville vores data synes at understøtte den sidstnævnte gruppe, dog skal det tages i betragtning, at er sandsynligvis blevet modificeret ved postoperativ adjuverende kemoterapi (standard terapi i Japan) vores overlevelse data. Betragtninger, i modsætning til den foreliggende undersøgelse, den diffuse type mavekræft viste dårligere prognose end den intestinale type mavekræft i vores hospital årtier siden [15, 31], de seneste opdaterede overlevelsesdata støtter de modsatte resultater (dvs. den intestinale type mavekræft viser dårligere prognose end den diffuse type mavekræft), som er formodentlig grundet S-1 postoperative adjuvansvirkninger [32]. Postoperativ adjuvans S-1 kemoterapi er blevet foreslået at være signifikant mere effektiv til peritoneal sygdom end for fjernt orgel metastase [24], og det er sandsynligt at være mere effektiv for diffus type, gastrisk cancer end for intestinal type, gastrisk cancer [32] . Af disse grunde viser den nyeste overlevelsesanalyse at prognosen for den diffuse type mavekræft er forbedret i forhold den for intestinal type mavekræft.

Der var ingen statistisk forskel i recidivraten eller i den unikke gentagelse sites mellem

p53

aberration gruppen og

p53

ikke-aberration gruppe, men flere gentagelser blev fundet i hver af tilbagefald steder i

p53

ikke-aberration gruppen sammenlignet med

p53

aberration gruppe. Disse resultater kunne tyde på, at den

p53

ikke-aberration gruppe har en mere aggressiv fænotype end den

p53

aberration koncernen som helhed. I vores undersøgelse, den diffuse type mavekræft viste signifikant bedre prognose end den intestinale type mavekræft i

p53

aberration gruppe. Da sådanne patienter tendens til at blive distribueret til en mere fremskredent stadium, disse overlevelsesdata foreslog, at S1 postoperativ adjuverende kemoterapi er mere effektiv for diffus form mavekræft end for tarm form mavekræft i sager med

p53

pathway aberration. Disse resultater var i overensstemmelse med tidligere rapporter, at mutant

p53

og /eller immunfarvning af p53 protein kunne være prædiktive biomarkører for positive effekter af højdosis neoadjuverende kemoterapi i gastrisk kræft [30].

Vi endelig vurderet epigenetiske behandlingseffekt i kombination med et kemoterapeutisk middel for at sammenligne betydningen af ​​

p53

pathway til den epigenetiske pathway i gastrisk cancer celler behandlet med CDDP. Uventet, viste det sig, at den

p53

vej var usandsynligt at spille en meget afgørende rolle i apoptose induktion ved CDDP (figur 6). Det blev for nylig vist, at epigenetisk carcinogenese faktisk er muligt. I dette system, systemiske iPS induceret ved omprogrammering faktorer resulterer i systemisk cancer forekomst med dynamiske epigenetiske ændringer, mens systemisk reversion af disse omprogrammering faktorer vender kræftceller i normale celler [33]. Mavekræft sandsynligvis harbor færre mutationer af driver gener [34] end kolorektal cancer [35], og, på samme måde, bortset fra

p53

gen er sjældne i brystkræft [35], hvilket tyder på, at epigenetisk carcinogenese mutationer er en mulig stor ætiologi gennem kronisk infektion af Helicobacter pylori [36-38]. Vi har for nylig demonstreret hyper-methylering af

Reprimo

[39], som igen er et gen i

p53

vej, men som ikke kunne medtages i denne undersøgelse, og

HOPX

[16] og

CDO1

[40], der er både involveret i apoptose, men formodentlig ikke gennem

p53

vej. Baseret på vores nuværende funktionelle eksperimenter,

p53

vej bidrag til epigenetiske behandlingseffekt vil sandsynligvis være meget mindre end i andre veje (figur 5). Vi brugte andre cellelinjer (2 gastrisk kræft cellelinjer og en hepatocellulær cancer cellelinje) til nøjagtigt at bestemme bidraget fra

p53

vej til apoptose induceret af CDDP i kombination med epigenetiske behandlinger. De yderligere eksperimenter udført, er vist i S3 Fig. AZ521 og HepG2 cellelinjer er

p53

vildtype, og SH10 cellelinie er

p53

mutant.

p53

aktivitet blev påvist i

p53

vildtypeceller dog dens aktivitet var afhængig af hver cellelinie. Således

p53

aktivitet blev påvist i NUGC4 celler med CDDP behandling og i AZ521 og HepG2 celler uden CDDP behandling. Stærk apoptose som vurderet af en apoptose assay (caspase 3 eller nexin Assay) ikke nødvendigvis afspejler graden af ​​

p53

transkriptionel aktivering. I

p53

mutant (SH10) eller

p53

nul-celler,

p53

transkriptionel aktivitet blev ikke induceret overhovedet, blev dog apoptose fundet at være den samme som i

p53

vildtypeceller.