PLoS ONE: Withaferin A fremkalder celledød Selektivt i Androgen-prostatacancer celler, men ikke i Normal fibroblast Cells

Abstrakt

Withaferin A (WA), en vigtig bioaktiv komponent i den indiske urt

withania somnifera

, inducerer celledød (apoptose /nekrose) i flere typer af tumorceller, men den molekylære mekanisme bag denne cytotoksicitet forbliver undvigende. Vi rapporterer her, at 2 pM WA celledød selektivt i androgen-ufølsom PC-3 og DU-145 prostataadenokarcinomceller, hvorimod dets toksicitet var mindre alvorlig i androgen-sensitive LNCaP prostataadenokarcinomceller og normale humane fibroblaster (TIG-1 og KD ). WA også dræbt PC-3-celler i sfæroid-dannende medium. DNA microarray analyse afslørede, at WA steg betydeligt mRNA-niveauer af c-Fos og 11 varmechokproteiner (HSP’er) i PC-3 og DU-145, men ikke i LNCaP og TIG-1. Western-analyse viste forøget ekspression af c-Fos og reduceret ekspression af det anti-apoptotiske protein C-flip (L). Ekspression af HSP’er såsom HSPA6 og Hsp70 blev synligt forhøjet; men fordi siRNA-medieret depletion af HSF-1, et HSP-inducerende transkriptionsfaktor, nedsat levedygtighed PC-3 cell, er det sandsynligt, at disse varmechok-generne blev involveret i beskyttelsen mod celledød. Desuden WA inducerede generering af reaktive oxygenarter (ROS) i PC-3 og DU-145, men ikke i normale fibroblaster. Immuncytokemi og immuno-elektronmikroskopi afslørede, at WA forstyrret vimentin cytoskelettet, eventuelt inducere ROS generation, c-Fos udtryk og c-flip (L) undertrykkelse. Disse observationer tyder på, at flere begivenheder efterfulgt af afbrydelse af vimentin cytoskeleton spiller afgørende roller i WA-medieret celledød

Henvisning:. Nishikawa Y, Okuzaki D, Fukushima K, Mukai S, Ohno S, Ozaki Y, et al. (2015) Withaferin A fremkalder celledød Selektivt i Androgen-prostatacancer celler, men ikke i Normal fibroblastceller. PLoS ONE 10 (7): e0134137. doi: 10,1371 /journal.pone.0134137

Redaktør: Hiroyasu Nakano, Toho University School of Medicine, JAPAN

Modtaget: Februar 13, 2015; Accepteret: 6 jul 2015; Udgivet: 31 Juli 2015

Copyright: © 2015 Nishikawa et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet delvist af tilskud-in-støtte til Videnskabelig Forskning S (nr 15.101.006), Videnskabelig Forskning B (nr 20.370.081 og 23.370.086) og sonderende forskning (nr 21.651.085) til HN og videnskabelig forskning C (nr 22.570.185) til NY fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi i Japan (https://www.mext.go.jp/engelsk /)

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Withaferin a (WA), en stor bioaktive bestanddel af ayurvedisk lægemiddel plante

withania somnifera

, inducerer celledød i mange tumorceller [1-3]. Specifikt WA dosisafhængigt inducerer apoptotisk celledød medieret af det udfoldede protein respons (UPR), som er udløst af ophobning af fejlfoldede proteiner i det endoplasmatiske reticulum (ER), og det medfører også apoptose medieret af reaktive oxygenarter (ROS) i humane nyrecancer (Caki) -celler [4], [5]. WA udøver potente antiproliferative effekter ved at hæmme Hsp90 chaperone aktivitet, hvorved der induceres nedbrydning af Hsp90 klient proteiner i bugspytkirtelkræft cellelinjer Panc-1, MiaPaCa2, og BxPc3; denne virkning reverseres af proteasominhibitor MG132 [6]. WA undertrykker ekspression af human papillomavirus E6 /E7 oncogener, gendanner p53 pathway aktivitet, og inducerer apoptose i livmoderhalskræft CaSki-celler [7]. WA forårsager celle-cellecyklusstandsnings ved G2 /M-fasen i prostatacancer-cellelinier [8], og inducerer apoptose i humane melanomceller ved at generere ROS og nedregulering Bcl-2 [9].

WA binder direkte til vimentin ved kovalent modifikation af en cysteinrest (Cys328), forårsager vimentin filamenter til at aggregere og colocalize med F-actin og derved forstyrre vimentin cytoskelettet [10], [11]. WA-induceret vimentin aggregering er ledsaget af ændringer i celleform, nedsat motilitet, og forhøjede vimentin phosphorylering ved Ser38 [12]. Disse observationer antyder, at WA kunne anvendes til at målrette metastatiske tumorceller [12], [13]. Selv WA hæmmer epitel-mesenkymale overgang (EMT) ved at undertrykke vimentin funktion [14], kan effekten på vimentin alene ikke højde for alle de WA-medierede subcellulære begivenheder, der fører til celledød. Faktisk WA også binder β-tubulin, overtalelse alvorlig forstyrrelse af normal spindel morfologi [15], og også forstyrrer den cellulære organisation af flere andre mellemliggende glødetråd (IF) netværk, herunder peripherin, neurofilament-triplet protein, og keratin [12]. Derfor fuldt ud at forstå den molekylære mekanisme af WA-induceret celledød, må vi identificere yderligere molekylære mål i WA.

onkogen transkriptionsfaktor c-Fos regulerer genekspression i samarbejde med juni eller andre grundlæggende leucin zipper proteiner, som en komponent af aktivatoren protein 1 (AP-1) dimer-kompleks. Selvom c-Fos udøver anti-apoptotiske funktioner, seneste rapporter tyder på, at det også kan fremme apoptose [16], [17]. Aktiveret c-Fos /AP-1 primer PC-3 og LNCaP prostatacancer (PCA) celler til at undergå apoptose ved direkte bindende promotorregionen af ​​det anti-apoptotiske gen c-flip (L), hvorved undertrykke transkription [18]. Apoptose kræver også aktivering af tumornekrosefaktor (TNF) relateret apoptoseinducerende ligand (TRAIL) /Apo-2L; denne TRAIL-induceret apoptose er næppe påviselig i normale celler [18]

Patogenesen af ​​prostatatumorer indledningsvis androgen-afhængige.; imidlertid mange patienter videre til metastatisk kastrationsresistent (androgenuafhængig) PCa (mCRPC) [19]. Androgen-uafhængige PCA celler (fx PC-3 og DU-145) udviser stamceller-lignende egenskaber, mens androgen-responsive PCA celler (fx LNCaP) ikke [20-22]. Annexin A1, et phospholipid-bindende protein og regulator af glucocorticoid-inducere [23]. NANOGP8, en retrogene koder for et NANOG1-lignende protein, spiller også en rolle i reguleringen af ​​stamceller-lignende PCA-celler [24]. Side-population celler fra humane PCA cellelinjer og xenograft væv undergår mere komplet EMT og er mere aggressive end homologe hovedparten-population celler [25]. Synes således EMT at være tæt forbundet med udviklingen af ​​mCPRC. Til dato har ingen medicin blevet udviklet, som effektivt og potent dræbe mCRPCs men ikke normale celler.

I denne undersøgelse, søgte vi at undersøge, om WA kan dræbe mCRPCs men ikke normale celler, og i så fald, at identificere afgørende molekylære mål af WA. Vi fandt, at WA (2 uM) selektivt induceret celledød i androgen-uafhængig PC-3 og DU-145 PCA-celler, men ikke i LNCaP androgen-responsive PCA celler eller TIG-1 normale fibroblaster. Mikromatrice og vestlige analyser afslørede nye molekylære mål af WA, der kan definere forskellige reaktioner af disse cellelinjer til WA. Fordi WA dræbt PC-3 celler i sfæroid-dannende kulturer, foreslår vi, at WA kan tjene som udgangsmateriale molekyle for udvikling af lægemidler, der inducerer celledød i cancer stamceller (CSCS).

Resultater

TIG-1 og LNCaP er mindre følsomme over WA end PC-3 og DU-145

Vi først fundet, at WA effektivt induceret celledød i PC-3 og DU-145, men LNCaP var mindre følsomme til WA behandling (fig 1). For at bestemme om normale humane fibroblaster (TIG-1) viser også ændret modstand mod WA, sammenlignede vi levedygtighed TIG-1 udsat for 2 uM eller 4 uM WA til levedygtigheder af LNCaP, PC-3 og DU-145. Levedygtighed PC-3 og DU-145 faldt signifikant 8 timer efter 4 pM WA behandling (lyserøde pile i figur 1A). Derimod levedygtighed TIG-1 fortsat høj, på et niveau, der svarer til LNCaP, op til 8 timer efter 4 uM WA behandling, når mere end halvdelen af ​​PC-3 og DU-145 døde (grønne pile i fig 1A ). Cellelevedygtighed af DU-145 var højere end for PC-3 ved 4, 8, og 24 timer.

(A, B) Cellelevedygtighed blev målt ved 4, 8, og 24 timer efter 2 uM ( A) eller 4 uM (B) WA behandling. NT, ikke-behandlede. Grønne og blå pile angiver stænger til overlevende celler, mens pink og røde pile viser barer for celler, der døde under de samme betingelser. Gule pile angiver de anvendte prøver til DNA microarray analyse. Søjler repræsenterer middelværdier ± SEM for tre uafhængige forsøg. Lilla pile angiver signifikante reduktioner i celle levedygtighed (*,

P

0,05, **,

P

0,01).

Efter behandling med 2 uM WA, levedygtighed PC-3 blev reduceret ved 4, 8, og 24 timer, hvorimod DU-145 blev levedygtige, kun på 24 timer (røde pile i fig 1B). Derimod TIG-1 og LNCaP forblev levedygtige ved 24 timer (blå pile i fig 1B). Inkubation af disse celler i længere perioder viste, at TIG-1 forblev levedygtige selv på 96 timer, mens LNCaP blev levedygtige, på 72 timer (S1A og S1c Fig), hvilket tyder på, at 2 pM WA behandling ikke inducerer død TIG-1, men den død LNCaP blot var forsinket. Et andet humant normalt fibroblast linie (KD) viste også resistens over for 2 pM WA behandling (S1B Fig). Taget sammen antyder disse resultater, at TIG-1 og LNCaP-celler er mere resistente over for WA end PC-3 og DU-145-celler.

opregulering af c-Fos efter WA behandling korrelerer med cellelevedygtighed

for at identificere gener, der var op- eller nedreguleret i disse cellelinjer efter WA behandling, vi undersøgte transcriptomes af TIG-1, LNCaP, PC-3, og DU-145 ved hjælp af Agilent SurePrint G3 Menneskelige Microarrays. Vi undersøgte mRNA niveauer for PC-3 og TIG-1 ved 4 timer og 24 timer, henholdsvis efter 2 pM WA-behandling og LNCaP og DU-145 ved 4 timer og 8 timer, henholdsvis efter 4 uM WA behandling (gul pile i fig 1A og 1B). Fold ændringer i genekspression blev bestemt ved at sammenligne hybridisering signalintensiteter mellem prøver behandlet med WA og dem behandlet med dimethylsulfoxid (opløsningsmiddel). S1 Tabel viser en liste over differentielt udtrykte gener, arrangeret i faldende rækkefølge af fold ændring i PC-3; alle angivne gener blev også opreguleret med mere end 4 gange i DU-145. Scatterplots indikerer, at mRNA-niveauer af analyserede gener var høj nok (rå signal intensitet 10). At tillade fysiologisk signifikante sammenligninger (S2 Fig)

Da overekspression af c-Fos inducerer apoptose i humane colorektale carcinomaceller [ ,,,0],17], vi fokuseret på de c-Fos og fosB gener, som var påfaldende opreguleret i PC-3 og DU-145, men var svagt opreguleret i TIG-1 og endnu mindre i LNCaP (S1 Table; lyserød og turkis pile i S2 fig). I PC-3, disse proteiner var betydeligt opreguleret på 4 timer efter 4 pM WA behandling, efterfulgt af en gradvis stigning derefter (figur 2A). I DU-145, c-Fos var iøjnefaldende opreguleret på 4 timer, men dens udtryk faldt gradvist bagefter; et lignende mønster blev observeret i TIG-1, selvom opreguleringen var mindre iøjnefaldende end i DU-145 (Fig 2A). I LNCaP, c-Fos niveauet meget lavt, og var påviselig kun ved 24 timer. Især den rangeret rækkefølge cellernes levedygtighed (se figur 1A) var identisk med rækkefølgen af ​​c-Fos ekspressionsniveauet på 8 timer efter 4 pM WA behandling (LNCaP TIG-1 DU-145 PC-3 ). Desuden efter 2 pM WA behandling, et lignende mønster af c-Fos opregulering blev observeret i både PC-3 og DU-145; dog var meget lille c-Fos-ekspression observeret i TIG-1 og LNCaP (figur 2B); Således blev WA-induceret c-fos-ekspression korrelerede med cellelevedygtighed. Derimod FosB og FosB2 var ikke signifikant opreguleret, og deres ekspressionsniveauer blev ikke korreleret med cellelevedygtighed (figur 2A).

(A, B) Western blot-analyse til påvisning af c-Fos (FosB) i TIG-1, LNCaP, DU-145, PC-3-celler ved 4, 8, og 24 timer efter behandling med 4 pM (A) eller 2 uM (B) WA. NT, ikke-behandlede. (C) Western blot-analyse til påvisning af c-Fos, PARP, FLIP og GAPDH i PC-3-celler ved 12 timer efter 4 pM WA behandling i nærvær (+) eller fravær (-) af tre forskellige siRNAs (X-Z) fra OriGene. (D) levedygtighed PC-3 celler efter siFos behandling. Data er repræsenteret som middelværdi ± SEM for tre uafhængige forsøg; lyserøde pile angiver en statistisk signifikant reduktion i celle nummer efter siFos behandling (**,

P

0,01). (E) Befolkning i apoptotiske, nekrotiske og levende celler tydeligt farvet med Annexin V-EnzoGold, 7-AAD-rød, og GFP. Data er repræsenteret som middelværdi ± SEM for tre uafhængige forsøg; rød, blå og grønne pile angiver statistisk signifikante ændringer (**,

P

0,01). (F) Western blot-analyse af c-Fos, PARP, FLIP, og GAPDH i DU-145 ved 12 timer efter 4 pM WA behandling i nærvær (+) eller fravær (-) af siRNA’er; siFos eller siGL2 (siControl). (G) levedygtighed DU-145-celler efter exogent overekspression af pcDNA3-FLIP eller vektor alene i nærværelse af DMSO (opløsningsmiddel) eller 4 uM WA.

siRNA-medieret knockdown af c-Fos ( siFos) redder celledød i PC-3 [18]. Derfor undersøgte vi, hvilken type af celledød (dvs. apoptose eller nekrose) er reddet af siFos. Til disse eksperimenter anvendte vi siFos_Z (fig 2C). Først, vi bekræftet i PC-3, at levedygtigheden faldt betydeligt ved 48 h og 72 timer efter WA behandling (Fig 2D). FACS-analyse (S3 Fig) afslørede, at hastigheden for nekrose var lavere i siFos-behandlede celler end i celler behandlet med siGL2 (negativ kontrol) 8 timer efter behandling med enten DMSO alene eller WA (2 uM eller 4 uM), hvilket antyder, at overekspression af c-Fos induceret af WA spiller en rolle i induktion af nekrotisk celledød (røde pile i fig 2E-i). Derimod under de samme betingelser, levedygtighed faldt (blå pile i fig 2E-II) og procentdelen af ​​apoptotiske celler forøget (grønne pile i fig 2E-III og 2E-IV). Således overekspression af c-Fos korrelerer med WA-induceret celledød i PC-3. Det er fortsat undvigende hvis c-Fos er involveret i bestemmelse af cellelevedygtighed eller blot konverterer celledød tilstand fra apoptose til nekrose uden at påvirke induktionen af ​​celledød. Vi kunne ikke undersøge dette i DU-145, fordi både siGL2 og siFos forårsagede celledød på et tilsvarende niveau.

c-Fos udøver sin proapoptotiske funktion i PC-3 og LNCaP celler dels ved at undertrykke ekspressionen af ​​c- FLIP (L), som vi vil henvise til som “FLIP” herefter [18]. FLIP-niveauet blev reduceret efter WA behandling i alle testede celler (figur 2B); reduktion af FLIP var især bemærkelsesværdig i DU-145, især ved 24 timer efter 2 pM WA behandling (fig 2B, bane 16), i forhold til de reduktioner i TIG-1, LNCaP, og PC-3 (fig 2B, bane 4 , 8 og 12). Denne observation antyder, at WA-medieret celledød forekommer delvis skyldes reduceret ekspression af klappen. Western blot-analyse indikerede, at niveauet af FLIP ikke blev reduceret med siFos_Z behandling i PC-3 (fig 2C, bane 6), hvorimod siFos_X eller siFos_Y behandling svagt reducerede FLIP niveau (fig 2C, bane 4 og 5). I DU-145, blev FLIP niveau ligeledes reduceres ved behandling med siControl eller siFos_Z (fig 2F, bane 3 og 4). Disse resultater antyder, at modulering af c-Fos niveau anden måde relateret til, men påvirker ikke direkte det reducerede FLIP niveau. Ikke desto mindre exogen ekspression af FLIP i DU-145 reddet WA-induceret celledød (figur 2G). Taget sammen antyder disse resultater, at WA forårsagede to uafhængige begivenheder, nemlig en stigning i c-Fos-niveau og en reduktion i FLIP niveau, til at inducere celledød.

Ekspression af HSP-gener opreguleres efter WA behandling

Næste, bemærkede vi, at 11 varme-shock protein (HSP) gener (

HSPA6

,

DNAJA4

,

HMOX1

,

HSPA1B

,

HSPA1L

,

HSPA1A

,

DNAJB1

,

DNAJB4

,

HSPH1

, og

SERPINH1

) var blandt de 45 mest up-regulerede gener i PC-3 (S1 tabel). HSP’er er molekylære chaperoner, der udsættes for en hurtig og stærk induktion af stress. I PC-3 og DU-145, HSPA6 var brat opreguleres 4 timer efter WA behandling, mens der i TIG-1 og LNCaP, niveauet af HSPA6 protein var meget lav (Fig 3A). Derimod ekspressionsniveauer af DNAJA4 (Hsp40 følgende) og HSPA1B (HSP70 følgende) udviste lignende gradvise stigning i disse celler (Fig 3A).

(A) Western blot-analyse til påvisning HSPA6, Hsp40, HSPA70, EGR -1, PAR-4, og GAPDH (lastning kontrol) i TIG-1, LNCaP, DU-145, PC-3 celler ved 0, 4, 8 og 24 timer efter 4 uM WA behandling. Pil viser bandet for bona fide EGR-1. (B) Indflydelse af siHSPA6 udtryk på PC-3 cellevækst. (I) Skematisk til dette eksperiment. (Ii) Western blot-analyse for at bekræfte knockdown af HSPA6 protein ved siHSPA6, i forhold til celler behandlet med siGL2 (negativ kontrol). (Iii) Indflydelse af siHSPA6 og siGL2 på PC-3 cellevækst, med eller uden WA behandling. Arrow fremhæver reduktionen i PC-3-cellevækst. (C) Indflydelse af siHSF-1-ekspression på PC-3 cellevækst. (i) skemaer for dette eksperiment. (Ii) Western blot-analyse for at bekræfte knockdown af HSP protein ved siHSF-1, i forhold til celler behandlet med siGL2 (negativ kontrol), og at bestemme, om HSF-1 knockdown påvirket HSP proteinniveauer ved påvisning af HSPA6, Hsp40, HSPA70, og GAPDH i PC-3-celler. (Iii) Indflydelse af siHSF-1 og siGL2 på PC-3 cellevækst, med eller uden WA behandling. Arrow fremhæver reduktionen i PC-3-cellevækst. Data er repræsenteret som middelværdi ± SEM for tre uafhængige forsøg; pink, grøn og blå pile angiver signifikante fald i celle levedygtighed (*,

P

0,05, **,

P

0,01).

for at reducere niveauet af HSPA6 protein i WA-behandlede celler, udførte vi siRNA-medieret knockdown i PC-3 (fig 3B-i). Vi bekræftede vellykket knockdown ved Western blotting (Fig 3B-ii). Men vi observeret en lille ændring i cellelevedygtighed i siHSPA6-behandlede celler i forhold til celler behandlet med en negativ kontrol-RNA (siGL2) (røde pile i fig 3B-iii), hvilket antyder, at overekspression af HSPA6 er ikke årsag til celledød efter WA behandling.

Vi næste udført siRNA-medieret knockdown af varme-shock faktor protein 1 (HSF1), de store transskriptionsfaktor involveret i opregulering af HSF-gener [26], under anvendelse af en tilsvarende eksperimentel design (fig 3C-i). Western-analyse bekræftede, at HSF1 knockdown hjælp siHSF1 nedsat ekspression af både HSF1 og HSPA6 (fig 3C-ii). Derimod niveauerne af Hsp40 og HSP70 var uændret (fig 3C-ii), sandsynligvis på grund af de høje baseline niveauer af endogent Hsp40 og HSP70 (se fig 3A). Ikke desto mindre, behandling af PC-3-celler med siHSF1 forøget celledød (grøn og blå pile i fig 3C-iii), selvom stigningen ikke var iøjnefaldende. Disse resultater antyder, at ukendte proteiner opreguleres ved HSF1 beskytte PC-3-celler mod celledød.

Fire af tidlige vækstfase respons (EGR) gener blev rangeret blandt top 40 WA-inducerede gener (S1 tabel) . Niveauerne af EGR-1 og EGR-3 forblev konstant efter WA behandling (S3 Fig); derfor, vi ignoreret disse proteiner i efterfølgende analyser. I modsætning til en tidligere rapport [27], prostata apoptose respons-4 (PAR-4) var ikke opreguleret efter WA behandling på enten mRNA (grønne pile i S1 Fig) eller protein niveau (S3 Fig). Derfor kan disse gener ikke være involveret i fastlæggelsen cellernes levedygtighed (se figur 1).

WA inducerer stress respons indledt på ER og mitokondrier i prostatacancerceller

WA inducerer apoptose medieret af ER stress i humane nyre-carcinomceller [4] og

Xenopus laevis

A6 nyre epitelceller [28]. Gene ontologi analyse af DNA microarray data (S5 Fig) ved hjælp af NextBio systemet bekræftede, at de top-rangerede berigede gen sæt indeholdt ER stress-relaterede UPR gener (ID, GO: 0.006.986; S4 Fig). For at bestemme om ER stress blev induceret i forskellig grad i TIG-1 og PC-3 efter WA behandling, udførte vi western-analyse ved 2, 4 og 8 timer efter 4 pM WA behandling. I PC-3, blev der observeret induktion af CHOP ekspression og aktivering af caspase 3 og PARP-spaltning, hvilket tyder på, at ER stress respons via aktivering af CHOP er vigtig (figur 4). , SiRNA-medieret knockdown af CHOP tyder imidlertid, at CHOP ikke spiller en rolle i aktiveringen af ​​caspase 3 (S6 Fig). Derimod phosphorylering af eIF2α på Ser51 var ineffektiv, muligvis på grund af svag aktivering af PERK; følgelig nedstrøms begivenheder såsom caspase 3 aktivering og PARP spaltning var knap påviselige i TIG-1 (længst til venstre paneler i figur 4). Denne svage respons til ER stress kan forklare, hvorfor TIG-1 er resistent over for WA behandling (se figur 1B). I LNCaP blev caspase 3-aktivering og PARP-spaltning ikke observeret ved 8 timer; Således i denne cellelinie ER stress respons blev aktiveret ved et niveau midt imellem dem i TIG-1 og PC-3; modstand LNCaP til WA kan skyldes denne forsinkelse i downstream begivenheder. Men selv om niveauet for CHOP blev induceret efter WA behandling i DU-145, blev lidt caspase 3-aktivering og PARP-spaltning observeret (længst til højre paneler i figur 4). Således kan apoptotisk celledød af DU-145 skyldes primært øget c-Fos-ekspression og reduceret FLIP ekspression snarere end ER stress respons (se figur 3).

(A) Western blot-analyse til påvisning af IRE -1α, PERK, PS51-eIF2α, CHOP, caspase 3, PARP, BiP, og GAPDH (lastning kontrol) i TIG-1, LNCaP, DU-145, PC-3 celler ved 4, 8, og 24 timer efter 4 pM WA behandling. NT: ikke-behandlede. (B) Skematisk fremstilling af de analyserede proteiner i apoptotiske vej induceret af ER stress. (C) Typiske fluorescensbilleder af TIG-1 (i), LNCaP (ii), PC-3 (iii), og DU-145 (iv), der blev behandlet med 4 pM WA i 24 timer og efterfølgende behandlet med ROS detektionsreagenser ved hjælp af Image-iT LIVE Green ROS Detection Kit. Flettede billeder vises af cytoplasmatiske ROS signaler (grøn) og nukleare DNA signaler farvet med Hoechst33342 (blå). Grøn bar, 100 pm. Sort søjle, 10 um.

Ashwagandha

blad ekstrakt indeholdende WA forårsager brystcancerceller at generere ROS, som er et stressrespons initieret ved mitokondrier [29]. Vi undersøgte, om behandling med WA også inducerer ROS-generering i prostatacancerceller og normale fibroblaster af en fluorescens-probe-metode. Vi bekræftede første påvisning af ROS signaler, når celler blev behandlet med

tert

butyl hydroperoxid (TBHP), en inducer af ROS-generering. Alle testede celler viste cytoplasmatiske signaler (grøn) afledt af ROS produktion (S7A Fig). Ved behandling med 4 pM WA i 24 timer, blev opdaget kun et lavt niveau af cytoplasmatisk ROS i TIG-1 (fig 4B-i) og KD (S7B Fig), som svarer til konstateringen af ​​en tidligere rapport, at TIG-3 generere små ROS efter WA behandling [29]. Derimod var stærke ROS signaler detekteres i LNCaP, PC-3 og DU-145 (Fig 4C-ii, -iii, og-iv). Disse resultater antyder, at TIG-1 og KD modsætning LNCaP, PC-3 og DU-145, frembragte ikke ROS efter WA behandling, hvilket kan forklare, hvorfor TIG-1 og KD er resistente over for WA.

WA inducerer BAG3-medieret autophagy i PC-3 celler

WA inducerer autophagy i brystkræftceller, men den detaljerede mekanisme stadig vanskeligt at definere [30]. Vore DNA microarray data (S1 tabel) viste, at mRNA-niveauet af Bcl-2-associeret athanogene 3 (BAG3), et medlem af BAG co-chaperone familie impliceret i autofagi [31], opreguleres efter WA behandling. Således har vi undersøgt, om WA induceret autophagy i PC-3 ved at udtrykke EGFP-mærkede mikrotubulus-associeret protein let kæde 3 (LC3), en autophagy markør der specifikt etiketter autophagosomal membraner [32]. Faktisk EGFP-LC3 puncta viste sig efter 2 uM eller 4 pM WA behandling (Fig 5A) ved en frekvens svarende til den i serum-udsultede celler (Fig 5B).

A) Observation af EGFP og EGFP-LC3 signaler ved immunfluorescens mikroskopi. Bar, 10 um. (B) Bar grafer, der viser procentdelen af ​​celler, der indeholder punktformig EGFP-LC3; pile viser, at værdierne steg gradvist under de angivne betingelser. Data er repræsenteret som middel ± SEM for tre uafhængige forsøg; grønne pile angiver statistisk signifikante stigninger (**,

P

0,01). (C) Western blot-analyse til påvisning af LC-3 og GAPDH (ladningskontrol) i PC-3 under de angivne betingelser. (D) Bar grafer, der viser cellelevedygtighed (%) under de angivne forhold. (E) Western blot-analyse til påvisning BAG3, LC-3, og GAPDH (loading kontrol) i PC-3-celler i nærværelse af de angivne betingelser for siBAG3 eller siGL2 (negativ kontrol). (F) Bar grafer, der viser cellelevedygtighed (%) i de angivne forhold. (D, F) Data er repræsenteret som betyder ± SEM af tre uafhængige forsøg; røde pile angiver statistisk signifikante reduktioner i cellelevedygtighed (**,

P

0,01). (A-F) Prøver blev indsamlet ved 4 timer efter WA behandling. (G) Expression profiler af de Autophagy-relaterede proteiner BAG3 og LC3 i PC-3-celler ved 4, 8 og 24 timer efter behandling med 4 pM WA. NT:. Ubehandlede

For at bestemme om WA-medieret autofagi påvirker cellernes levedygtighed, vi tilføjet farmakologiske hæmmere af klasse III-phosphatidylinositol 3-kinaser, 3-methyladenin (3-MA) ​​eller wortmannin, som undertrykker kanoniske autophagy, at PC-3-celler i nærvær (+) eller fravær (-) 4 pM WA behandling. Western-analyse viste, at WA induceret LC3 ekspression uanset tilstedeværelsen af ​​3-MA eller wortmannin (Fig 5C). Endvidere er hverken narkotika undertrykt reduktionen i cellernes levedygtighed (Fig 5D).

Fordi BAG3 aktiverer noncanonical autofagi fremkaldt af proteasominhibitorer såsom MG132 [33], undersøgte vi, om siRNA-medieret knockdown af BAG3 ville påvirke PC 3 cellelevedygtighed. siBAG3 held undertrykt BAG3 ekspression sammenlignet med siGL2, en negativ kontrol (øverste panel i fig 5E). Som forventet blev LC3 ekspression undertrykt af siBAG3 efter enten behandling med DMSO, 2 uM MG132, 20 uM MG132 eller 4 uM WA (midterste panel i fig 5E). Endvidere blev cellelevedygtighed reduceret med siBAG3 følgende WA behandling (Fig 5F), sandsynligvis på grund af hæmning af anti-apoptotiske aktivitet af BAG3. Taget sammen antyder disse resultater, at WA-induceret BAG3 medierer noncanonical autofagi, som beskytter PC-3-celler mod celledød.

Western blot-analyse viste, at intensiteten af ​​den ~ 70 kDa store bånd af BAG3 (pil i fig 5G) blev nedsat i TIG-1 ved 24 timer efter WA behandling (fig 5G, bane 4), mens niveauet allerede var høj (bane 9 og 13) og uændret efter WA behandling i PC-3 (bane 10-12) og DU-145 (bane 14-16). Endvidere blev ~ 62 kDa store bånd af BAG3 (en formodet forarbejdet form af BAG3) iøjnefaldende forøget i PC-3 og DU-145 (pilespids på figur 5G); det forbliver undvigende hvis 62 kDa BAG3 er mere aktiv end 70 kDa BAG3 eller er inaktiv. Disse resultater indikerer, at BAG3 proteinniveau er højere i PC-3 og DU-145 end i TIG-1 og LNCaP. Ikke desto mindre LC3 var lavt i PC-3 og DU-145 (midterste paneler i fig 5G), hvilket antyder, at en regulerende mekanisme, som forbinder BAG3 aktivitet og LC3-II produktion blev ændret i disse celler. Faktisk viste en nylig rapport, at DU-145 ikke kan producere LC3-II på grund af en genetisk forringelse af autophagy vej [34]. Derimod LC3 udtryk var høj i TIG-1 og LNCaP (midterste paneler i figur 5G). Det er fortsat skal analyseres, hvis disse resultater antyder, at disse celler eller anden måde er beskyttet mod WA-induceret celledød ligner beskyttelse af Caco-2-celler fra oxaliplatin-induceret celledød [35].

TIG-1 og PC-3 udviser distinkte mønstre af subcellulære vimentin lokalisering følgende WA behandling

WA forbinder med vimentin og forårsager hurtig reorganisering af vimentin intermediære filamenter (VIF) i perinukleære aggregater i BJ-5ta humane fibroblaster [12]. Selvom mRNA-niveauer af vimentin var høje og uændret efter WA behandling i TIG-1, LNCaP, PC-3 og DU-145 (sorte pile i S1 Fig), Western-analyse indikerede, at vimentin proteinniveauer var forhøjet efter WA behandling i PC- 3 (fig 6A). Derimod vimentin niveau var allerede højt før WA behandling, og fortsat høj, i DU-145 (Fig 6A). TIG-1 blev vimentin niveau reduceret, med spaltningsprodukter af vimentin [10] tydelig ved 24 timer (pilespidser Fig 6A), hvorimod der ikke vimentin bånd blev detekteret i LNCaP (Fig 6A). Disse observationer er konsistente med den kendsgerning, at PC-3, men ikke LNCaP, undergik EMT at erhverve vimentin ekspression.

(A) Western blot-analyse til påvisning af vimentin og actin i TIG-1, LNCaP, PC- 3, og DU-145 ved 4, 8, og 24 timer efter behandling med 2 pM eller 4 pM WA. NT: ikke-behandlede. (B) Typiske billeder af TIG-1 (i) og PC-3 (ii) farvet med anti-vimentin antistof, phalloidin (for F-actin), og Hoechst 33342 (for DNA) ved 2, 4 og 6 (h ) efter WA behandling. NT: ikke-behandlede. Pink og gule pile angivet colocalized vimentin og F-actin aggregater. Flettede billeder vises i den nederste række. Bar, 10 um. (C) Procentdel af alle observerede celler, der indeholder prikker af aggregeret eller ikke-aggregeret vimentin er vist for TIG-1 (i) og PC-3 (ii). Celler huser over 10 vimentin aggregater blev scoret som “aggregeret”, mens celler med ikke-aggregeret vimentin blev scoret som “ikke-aggregeret”. Data er repræsenteret som middelværdi ± SEM for tre uafhængige forsøg; Stjernerne viser statistisk signifikante ændringer i cellernes levedygtighed (**,

P

0,01, ***,

P

0,001). (D) Jasplakinoloide (JSP) ikke påvirke PC-3 cellelevedygtighed. (I) Skematisk af den eksperimentelle design. (Ii) Bar grafer, der viser cellelevedygtighed (%) i nærvær (+) eller fravær (-) 4 uM WA eller Jasp 8 timer efter tilsætningen af ​​WA. NT: ikke-behandlede. Søjlediagrammer repræsenterer middelværdier ± SEM for tre uafhængige forsøg. Pink, blå og grønne pile angiver statistisk signifikante reduktioner i cellelevedygtighed (*,

P

0,05, **,

P

0,01).

Immunfarvning ved 2, 4 og 8 timer efter 4 pM WA behandling forårsagede vimentin aggregering omkring plasmamembranen i TIG-1 (pink pile, fig 6B-i). Derimod PC-3 udviste en homogen fordeling af vimentin, med sådanne aggregater (Fig 6B-i og 6B-ii); dette tyder på, at vimentin udtrykt efter EMT i PC-3 tjener en anden funktion end den gør i mesenchymale celler. Især den cytoplasmatiske volumen af ​​PC-3 var mindre end den for TIG-1. Procentdelen af ​​celler, der huser disse aggregater steg synligt i TIG-1 (fig 6C-i) i forhold til PC-3 (fig 6C-ii).

Immuno-elektronmikroskopi afslørede vimentin signaler ved IF’er i cytoplasmaet i fravær af WA behandling (S8A fig), bekræfter mesenchymal oprindelse af TIG-1. Især mange vimentin signaler forskudt til det perifere område af cytoplasmaet tæt plasmamembranen, i et mønster, der afspejler tilstedeværelsen af ​​de førnævnte vimentin aggregater (se fig 6B-i), efter 4 timer på 4 uM WA behandling (S8B Fig) . Derimod blev der kun sparsomme vimentin signaler observeret i PC-3 i fravær af WA behandling (S8C Fig);