PLoS ONE: opregulering af miR-21 i cisplatin Resistant Kræft i æggestokkene via JNK-1 /c-Jun Pathway

Abstrakt

Cisplatin har været den mest accepterede lægemiddel til behandling af kræft i æggestokkene i næsten 40 år. Selvom de fleste patienter med ovariecancer reagere på front-line platin kombinationskemoterapi, vil mange patienter udvikler cisplatin-resistens sygdom, som er yderst hurtig og fatale. Selv om forskellige mekanismer cisplatin resistens er blevet postuleret, har de centrale molekyler involveret i en sådan modstand ikke blevet identificeret. MiRNA er endogent udtrykte små ikke-kodende RNA’er, som er evolutionært bevaret og fungerer som post-transkriptionelle regulatorer af genekspression. Dysregulering af miRNA er blevet forbundet med cancer initiering, progression og medikamentresistens. De onkogene miRNA-21, en af ​​de bedst undersøgte miRNA, opreguleres i næsten alle menneskelige kræftformer. Men reguleringen af ​​miR-21 i cisplatin resistente ovariecancerceller ikke er vurderet,. I denne undersøgelse målt vi MIR-21 ekspression ved real-time PCR og fundet opregulering af MIR-21 i cisplatin resistente sammenlignet med cisplatin sensitive ovariecancerceller. Chromatin immunopræcipitationsundersøgelser demonstrerede associering af c-Jun-transskriptionsfaktor til pri-mir-21 DNA promotorregioner. Blokering JNK-1, de store aktivator af c-Jun-phosphorylering, reduceret ekspression af præ-mir-21 og forøgede ekspression af dets velkendte målgen, PDCD4. Overekspression af miR-21 i cisplatin sensitive celler faldt PDCD4 niveauer og øget celleproliferation. Endelig målrettet miR-21 reduceret cellevækst, proliferation og invasion af cisplatin resistente æggestokkene cancerceller. Disse resultater antyder, at JNK-1 /c-Jun /MIR-21 pathway bidrager til cisplatin modstand ovariecancerceller og viste, at MIR-21 er et plausibelt mål at overvinde cisplatin modstand

Henvisning:. Echevarría -Vargas IM, Valiyeva F, Vivas-Mejía PE (2014) opregulering af miR-21 i cisplatin Resistant Kræft i æggestokkene via JNK-1 /c-Jun Pathway. PLoS ONE 9 (5): e97094. doi: 10,1371 /journal.pone.0097094

Redaktør: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Spanien

Modtaget: Januar 2, 2014 Accepteret: 14. april, 2014 Udgivet: May 27, 2014

Copyright: © 2014 Echevarría-Vargas et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette projekt blev delvist støttet af NIH /NCI (1K22CA166226-01A1) til PEVM, institutionelle seed-kapitalfonde fra University of Puerto Rico Comprehensive Cancer center (PEVM), National Institute of Health, og Minority Biomedical Research Support (MBRs) RISE Grant Number R25- GM061838 (IEV). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at ingen konkurrerende interesse eksisterer

Introduktion

kræft i æggestokkene (OvCa) tegner sig for tæt på 3% af alle kræfttilfælde i den vestlige verden [1]. Typisk behandling for kvinder med OvCa er cytoreduktion efterfulgt af kemoterapi [2]. På trods af den høje indledende svarprocent på cisplatin-baserede forbindelser som den første linje kemoterapi, mest ovariecarcinomer tilbagefald [2], [3]. Postulerede mekanismer cisplatin resistens omfatter nedsat intracellulær akkumulering af cisplatin, forøgede intracellulære niveauer af visse svovlholdige makromolekyler og forøget DNA-reparation [4]. Tyder på, at inaktivering af iboende celledødsveje, aktivering af celleoverlevelsesforløb og dysregulering af onkogener, tumorsuppressorgener og microRNA’er, bidrager til cisplatin modstand ovariecancerceller [3], [5], [6]. Men den nøjagtige mekanisme, hvormed ovariecancerceller bliver resistente over for cisplatin behandling er i øjeblikket ukendt.

MikroRNA’er (miRNA) er naturligt forekommende små (21-22 basepar) ikke-kodende RNA, der anerkender hovedsagelig 3 ‘-UTR region af messenger RNA (mRNA) og inhiberer proteinsyntese [7]. Nylige rapporter viser, at dysregulering af miRNA, og deres målgener, fremme kræft initiering, progression og resistens [6], [8], [9]. Af disse årsager har miRNA blevet foreslået som et diagnostisk, prognostisk og mål for cancerterapi [10]. En af de bedste undersøgelser miRNA er MIR-21, der er overudtrykt i de fleste cancere og displays onkogen aktivitet [11]. I HER2 (+) brystkræft overekspression af miR-21 tillægges resistens over for trastuzumab terapi [12]. . Nam et al, fundet MIR-21, MIR-203, og MIR-205 som overudtrykt i serøs ovariecarcinom versus normale ovarievæv; MIR-21 er til stede i 85% prøver [13]. Xie et al. observeret, at i de A2780 humane ovariecancerceller, MIR-21 modulerer hypoxi-inducerbare faktor-1α (HIF-1α), og modstanden af ​​paclitaxel [14]. MIR-21 udøver sin biologiske rolle ved at målrette vigtige gener, der kontrollerer cellevækst og proliferation. Men i solide tumorer, herunder kræft i æggestokkene, den tumorsuppressorgen programmeret celledød 4 (PDCD4) synes at være en af ​​de vigtigste funktionelle miR-21 mål [15], [16], [17]. Den centrale rolle PDCD4 i æggestokkræft er yderligere understøttet af observationer, lavere niveauer af denne tumor suppressor korrelerer direkte med dårlig prognose for patienter med ovariecancer [15]. For nylig Chan et al. viste, at miR-21 er overudtrykt i cisplatin følsomme i forhold til cisplatin resistente celler, og at miR-21 hæmning induceret apoptose og øger PDCD4 niveauer [18].

De opstrøms molekylære begivenheder, der tegner sig for den miR-21 overekspression i æggestokkene kræftceller har brug for yderligere undersøgelse. Rapporter viser, at PRI-mir-21 DNA promotorregioner indeholder genkendelseselementer for c-Jun og STAT3 transkriptionsfaktorer [19]. I colon cancerceller, curcumin reducerede MIR-21 via AP-1 (transkriptionsfaktor kompleks sammensat af c-Jun og c-Fos, hovedsagelig) regulering, og i den humane promyelocyt cellelinie HL-60, phorbol 12-myristat 13- acetat (PMA) inducerede mIR-21 ekspression af AP-1-aktivering [17], [20]. MIR-21 opregulering af AP-1 blev også observeret i visse kemoterapi bivirkninger populationer af cancer stamceller [21].

Da den anerkendte rolle miR-21 i kræft initiering, progression og resistens, vi undersøgte regulering af miR-21 i cisplatin resistente æggestokkene cancerceller. Vi anvendte tidstro polymerasekædereaktion (PCR) og fandt, at cisplatin-resistente ovariecancerceller udtrykker højere MIR-21 niveauer sammenlignet med cisplatin sensitive celler. Vi analyserede derefter mulig mekanisme af MIR-21 opreguleringen. Behandling af celler med SP600125, en inhibitor af c-Jun-phosphorylering, reduceret præ-mir-21 ekspression i cisplatin-resistente ovariecancerceller. Chromatin immunoprecipitation (chip) undersøgelser viste højere c-Jun-phosphorylering (p-c-Jun) proteinniveauer bundet til PRI-mir-21 DNA-promotorregion i cisplatin resistente sammenlignet med cisplatin sensitive ovariecancerceller. Overekspression af MIR-21 i cisplatin sensitive celler, øget celleproliferation, og reducerede PDCD4 proteinniveauer. Modsat, miR-21 oligonukleotid hæmmer (antagomir), signifikant hæmmet cellevækst, proliferation og invasionen evne A2780CP20 celler. Disse data viser, at opregulering af JNK-1 /c-Jun sti fører til afvigende stigende af miR-21, og foreslå miR-21 som et potentielt mål for at overvinde cisplatin modstand æggestokkene cancerceller.

materialer og metoder

Kemikalier og reagenser

Cisplatin blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) og rekonstitueret i 0,9% NaCl. SP600125 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) blev rekonstitueret i 100% DMSO indtil endelig koncentration på 10 mM. Ved tilsætning til cellerne, slutkoncentrationen af ​​DMSO på dyrkningsmediet var mindre end 0,1%.

Celler og dyrkningsbetingelser Salg

De humane ovarieepitelceller kræftceller SKOV3ip1, HEYA8 og A2780CP20 celler er blevet beskrevet andetsteds [22], [23], [24], [25], [26]. A2780 og A2780CIS celler blev købt fra European Collection of Cell Cultures (ECACC). Cellerne blev opformeret

in vitro

i RPMI-1640 medium (Thermo Scientific, Logan, UT, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Thermo Scientific) og 0,1% antibiotikum /antimykotisk opløsning (Thermo Scientific) og holdt ved 37 ° C i 5% CO

2/95,% luft. Alle tumorcellelinier blev screenet under anvendelse mykoplasma fjernelse middel som beskrevet af producenten (ABD Sertotec, NC, USA).

In vitro

analyser blev udført ved 70-85% celletæthed. A2780CP20 celler (5 x 10

5 celler /skål) blev behandlet med 10 pmol /l SP600125 i otte timer. Cisplatin koncentrationer inhiberer 50% af cellevækst (IC

50) blev beregnet efter 72-hr drug inkubation (cisplatin doser: 100, 10, 1, 0,1 og 0,01 uM, slutkoncentrationer). Cellevækst blev målt med Alamar blå farvestof som tidligere beskrevet [27].

Microarray analyse af genekspression

Totalt RNA blev isoleret fra A2780 og A2780CP20 ovarian cancer cellelinjer med den GenElute Mammalian Total RNA Purification Kit (Sigma-Aldrich). RNA-koncentrationen blev læst i en NanoDrop. RNA kvalitet blev bekræftet i en Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA). Et hundrede nanogram af total RNA blev anvendt til cDNA-syntese. Komplementære cDNA blev syntetiseret, mærket, fragmenteret og hybridiseret til Affymetrix GeneChip Gene 1.0 ST Humant Array. Efter 16 timers inkubation ved 45 ° C blev arrays vasket, farvet og scannet (Affymetrix Model 3000 scanner), og data blev analyseret under anvendelse af Partek Genomics Passer (Partek, St. Louis, MO). Eksperimenter blev udført i dobbeltbestemmelse. To-ANOVA blev anvendt til at bestemme forskelle i genekspression (p 0,05 gange ændring 2). 1359 prober (4%) sæt viste ± 2-gange ændring mellem A2780CP20 og A2780-celler. Yderligere filtrering (± 3 gange forandring, og p 0,003) viste 321 prober (0,96%) ændret mellem A2780CP20 og A2780 celler

RNA isolation og cDNA syntese

I alt RNA (herunder miRNA. ) blev isoleret ved hjælp af

mir

Vana miRNA isolation kit fra Ambion (Life Technology, Grand Island, NY). RNA blev omdannet til cDNA med Enhanced Avian RT første streng syntese kit fra Sigma-Aldrich. Kort fortalt, total RNA (1 ug), 500 uM dNTP og 3,5 uM oligo (dT)

23 blev blandet, og vand blev tilsat op til 10 pi totale volumen. Prøverne blev blandet, centrifugeret og opvarmet ved 70 ° C i 10 min. Denne blanding blev kombineret med 1 pi forbedrede aviær RT, 2 pi 10X buffer, 1 pi RNase inhibitor og vand op til 20 pi slutvolumen. Prøver blev inkuberet ved 25 ° C i 15 minutter efterfulgt af 45 ° C i 50 minutter. cDNA-syntese til at opdage modne miRNA blev udført med All-in-One miRNA QRT-PCR detektion kit (GeneCopoeia, Rockville, MD). Kort fortalt, cDNA syntese blandingen indeholdt 1 ug totalt RNA, 1 pi Poly (A) Polymerase, 1 pi RTase Mix, 5 pi 5X PAP /RT puffer og vand op til 25 pi slutvolumen. Den revere transkriptionsreaktion blev inkuberet ved 37 ° C i 60 min, og 85 ° C i 5 minutter i en Veriti termisk cykliseringsapparat (Applied Biosystems, Carlsbad, CA).

polymerasekædereaktion (PCR) og SYBR- i-baseret real-time PCR

PCR blev udført i en Verity 96 brønde termisk cykliseringsapparat (Applied Biosystems). Kort fortalt, 12,5 pi JumpStart REDTaq Readymix 1X (Sigma), 0,5 pi fremad, og 0,5 pi revers primere (0,4 uM slutkoncentration af hver), 2 pi af cDNA-produktet, og vand op til 50 pi slutvolumen. Cykliseringsbetingelserne var en cyklus ved 94 ° C i 5 minutter, efterfulgt af 30 cykler ved 95 ° C i 15 sek (denaturering), 60 ° C i 30 sek (annealing), og 72 ° C i 30 sek (forlængelse). Et sidste forlængelsestrin blev udført ved 72 ° C i 10 min. PCR-produkter blev separeret ved elektroforese i 1% agarosegel. Billeder blev opnået (efter gel farvning med ethidiumbromid) i et FluorChem 8900 (Alpha Innotech). SYBR-I-real time PCR til at vurdere modne miR-21 niveauer blev udført med All-in-One miRNA QRT-PCR detektion kit (GeneCopoeia) i en StepOne plus real-time PCR termiske cyklus-system (Applied Biosystems). PCR reaktioner mix indeholdt 10 pi 2X All-in-One qPCR Mix, 2 pi All-in-One miRNA qPCR primer, 2 pi universal adapter PCR-primer, 2 uL første cDNA og 4 pi vand. Specifikke primere for miR-21 og U6 (intern standard) blev anvendt (GeneCopoeia). Cykelforhold: en cyklus på 15 min ved 95 ° C, og 40 cykler af 15 sekunder ved 94 ° C, 30 sekunder ved 60 ° C og 30 sekunder ved 72 ° C [28]. Smelte kurve analyse blev altid udføres ved afslutningen af ​​PCR-reaktionen. Relativ MIR-21 ekspression blev beregnet med ΔΔCt-metoden [29], [30], [31].

Western blot-analyse

Celler blev opsamlet og vasket to gange med Phosphatbufferopløsning ( PBS), høstet og opbevaret ved -80 ° C, indtil den forarbejdes. For cytosoliske og nukleare ekstraktion blev celler resuspenderet i cytoplasmatisk puffer (0,5% Nonidet P-40, 10 mM KCI, 10 mM Hepes, pH 7,9, og 1X protease inhibitor) i 15 minutter på is og centrifugeret ved 14.000 rpm ved 4 ° C [32]. Supernatanterne (indeholdende den cytoplasmatiske fraktion) blev opsamlet. De resterende pellets blev vasket to gange med den cytoplasmatiske puffer efterfulgt af tilsætning af nuklear puffer (400 mM NaCl, 20 mM Hepes, pH 7,9 og 1X proteaseinhibitor). Prøver blev inkuberet i 15 minutter på is, centrifugeret i 10 minutter ved 4 ° C og supernatanten (indeholdende de nukleare proteinfraktioner) blev opsamlet. For total proteiner ekstraktion blev cellerne lyseret med lysepuffer (150 mM NaCl, 1% Triton-X, 0,4 mM NaF, 0,4 mM Navo

4, 25 mM Tris-HCl, pH 7,6 og 1X protease inhibitor) i 45 minutter på is, centrifugeret i 10 min ved 4 ° C, og supernatanterne blev opsamlet. Proteinkoncentration blev bestemt ved anvendelse Bio-Rad Protein Reagenser (Bio-Rad, Hercules, CA). Proteinlysater (50 ug) blev separeret ved SDS-PAGE, blottet på membraner og probet med den passende fortynding af hvert primært antistof. Membraner blev skyllet og inkuberet med det passende peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof, skylles igen, og blev påvist de bundne antistoffer ved anvendelse af forstærket kemiluminescens (GE Healthcare, Piscataway, NJ) efterfulgt af autoradiografi i en FluorChem 8900 (Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA). Primære anti-organer: anti-phospho-SAPK /JNK (Thr183 /Tyr185), anti-SAPK /JNK, anti-phospho-c-Jun (Ser73), anti-c-Jun, anti-phospho-ERK (Thr202 /Tyr204 ), anti-ERK-kinase, anti-STAT3, anti-histon H3 (Cell Signaling, Danvers, MA), anti-PDCD4 (Rockland, Gilbertsville, PA) og anti-β-actin (Sigma-Aldrich). Sekundære antistoffer blev anvendt, var anti mus og anti-kanin IgG peberrodsperoxidase (HRP) -bundet, anti-kanin (Cell Signaling).

chromatin immunoprecipitation (chip)

A2780CP20 og A2780 celler blev opsamlet og tværbindes med 1% formaldehyd i 10 minutter ved 37 ° C. Celler blev lyseret i natriumdodecylsulfat (SDS) lysis buffer (1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris, pH 8,1 og protease- og phosphataseinhibitorer). Prøver blev sonikeret (4 ° C) under anvendelse af en Branson 250 sonikator med 10 fortsat pulser af 10 sekunder (SEC) hver. De sonikerede lysater blev præ-clearet med protein A eller G magnet perler natten over ved 4 ° C. Lysater blev immunfældet med 5 eller 10 ug antistof /magnet perler mod pc-Jun, Pol-II (Santa Cruz), c-Jun (BD transduktion laboratorium, Franklin Lakes, New Jersey, USA) eller IgG (Abcam, Cambridge, MA , USA) natten over ved 4 ° C. Prøver blev vasket fem gange i 5 min hver ved 4 ° C med vaskebuffer (RIPA) (50 mM Hepes-KOH pH 7,6, 500 mM LiCI, 1% NP-40, 0,7% deoxycholsyre, 1 mM EDTA, og 1X protease og 1X phosphataseinhibitorer). Prøver blev vasket en gang med 1X TE-puffer og elueret med SDS elueringspuffer (1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8,1, og 1X protease og 1X phosphataseinhibitorer). Efter eluering blev prøver revers tværbundet ved 65 ° C i 4 timer, behandlet med RNase A (0,2 ug /ml) ved 37 ° C i 2 timer, blandet med CaCl

2 (300 mM CaCl

2 i 10 mM Tris pH 8,0) og proteinase K (0,2 mg /ml) ved 37 ° C natten over. Den immunopræcipiterede DNA blev isoleret ved anvendelse af Qiaquick PCR Purification Kit (Qiagen). DNA blev kvantificeret ved SYBR-1-baseret real-time PCR under anvendelse af en StepOne Plus Thermocycler (Applied Biosystems). Kort fortalt PCR-reaktionsblandingen indeholdt 10 pi SYBR-grønt, 0,5 pi fremadrettet primer, 0,5 pi revers primer (0,25 nM slutkoncentration), 2 pi DNA-prøve og 7 pi nuclease frit vand. Cykelforhold: en cyklus på 10 min ved 95 ° C, og 40 cykler af 30 sekunder ved 95 ° C, 30 sekunder ved 60 ° C og 30 sekunder ved 72 ° C Salg

Transiente og stabile transfektioner

Ektopisk mIR-21-ekspression blev udført i A2780 celler. Kort fortalt, A2780 (2 × 10

4 celler /ml) -celler blev podet i seks brøndplader. For hver brønd, 1 ug pCMV-MIR21 eller 1 ug tom vektor (pCMV-EV) (begge fra OriGene Technologies, Inc. Rockville, MD) og 1 pi MegaTran 1,0 transfektionsreagens (Origen) blev fortyndet i 98 pi Opti-MEM I (Life Technologies). pCMV-vektor indeholder et grønt fluorescein protein (GFP) kassette. Blandingen blev inkuberet i 10 minutter ved stuetemperatur og tilsat til cellerne. Fireogtyve timer senere blev mediet erstattet med frisk RPMI-1640 (10% FBS, 0,1% antibiotikum /antimykotisk opløsning og 500 ug /ml G418 disulfat saltopløsning). Efter 2-3 uger, uafhængige kolonier blev udtaget og dyrket separat som uafhængige kloner. Transfektionseffektiviteten blev overvåget ved immunofluorescens som følger: A2780 kloner blev podet i mikroskopobjektglas natten over. Derefter blev cellerne fikseret med 4% paraformaldehyd, blokeret med 0,3% H

2O

2 i methanol i 10 minutter og 10% FBS i 20 min. Celler blev inkuberet med anti-GFP-antistof (fortynding 1:250) eller DAPI (fortynding 1:5000 fra Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas, Texas, USA) natten over. Den næste dag blev objektglassene vasket, og sekundært antistof-anti-kanin (fortynding 1:5000) blev tilsat. Dækglas blev placeret på objektglas og fikseret med vandig-montering medium (Abcam). Celler blev visualiseret og fotograferet i et Olympus 1X71 omvendt mikroskop (Center Valley, PA). For at hæmme miR-21, vi forbigående transfektion A2780CP20 celler med et miR-21 oligonukleotid (Life Technology, Grand Island, NY, USA) og en negativ oligonukleotid inhibitor som kontrol (Life Technology). MiRNA inhibitorer blev altid blandet med HiPerfect transfektionsreagens (Qiagen, Valencia, CA, USA), og Opti-MEM I vækstmedium (Life Technologies).

Lille interferens RNA (siRNA) transfektion

for at lukke munden på human c-Jun (NM_002228) to siRNA’er rettet sekvenserne: 5′-CCTTCTATGACGATGCCCT-3 ‘, og 5′-GATGGAAACGACCTTCTAT-3’ blev anvendt (Sigma-Aldrich). En ikke-silencing siRNA (NC-siRNA) blev anvendt som den negative kontrol (Sigma-Aldrich). Kort fortalt A2780CP20 (2,25 × 10

5 celler) blev podet i petriskåle. Fireogtyve timer senere blev 200 nM siRNA (slutkoncentration) blandet med HiPerfect transfektionsreagens (Qiagen) ved 1:02 ratio (siRNA: transfektionsreagens) i Opti-MEM I vækstmedium. Blandingen blev inkuberet i 15 minutter ved stuetemperatur og tilsat til cellerne. Celler blev indsamlet efter 24 timer og opbevares ved -80 ° C indtil brug.

Cell vækst og proliferation

A2780CP20 (2 × 10

4 celle /ml) blev podet i seks godt plader. Fireogtyve timer senere blev en transfektion reaktionsblanding indeholdende MIR-21 inhibitor (Life Technology) (50 nM slutkoncentration) og HiPerfect transfektionsreagens (Qiagen) i et 01:04 forhold, blev tilsat til cellerne. Seks timer senere blev dyrkningsmediet fjernet og erstattet af RPMI-1640-medium (10% FBS). For at vurdere cellelevedygtighed tooghalvfjerds timer efter transfektion blev levende celler opsamlet og talt i nærværelse af 0,5% Trypan blue under anvendelse af en grevinde automatiseret celletæller (Invitrogen, Grand Island, NY). Celleproliferation blev vurderet med en kolonidannelse assay. Kort beskrevet otte timer efter transfektion blev 1000 celler podet i 10 cm-petriskåle. Ti dage senere blev kolonierne farvet med 0,5% krystalviolet i methanol og talt ved anvendelse mikroskopet Nikon Eclipse TS100. Salg

In vitro invasion assay Salg

celler (2,5 x 10

4-celler /ml) blev udpladet i en petriskål. Fireogtyve timer senere blev en transfektion reaktionsblanding indeholdende MIR-21 inhibitor (Life Technology) (50 nM slutkoncentration) og HiPerfect transfektionsreagens (Qiagen) i et 01:02 forhold, blev tilsat til cellerne. Den næste dag blev 600 pi af fortyndet matrigel (serum-frit RPMI-medium) putted ind øvre kammer 6 brønde Transwell-plader (Corning Incorporated, Lowell, MA). Kammeret blev inkuberet ved 37 ° C i mindst 4 til 5 timer for gelering. MIR-21 inhibitor-transficerede celler blev opsamlet og resuspenderet i serum-frit RPMI-1640 medium ved en tæthed på 1,5 x 10

5 celler /ml. Den matrigel blev forsigtigt vasket med opvarmet serumfrit-RPMI-1640-medium, og 1,0 ml af cellesuspensionen blev putted på matrigel. Den nedre kammer i Transwell blev fyldt med 1,0 ml RPMI-1640-medium (10% FBS), og pladen blev inkuberet ved 37 ° C i 48- timer. Transbrøndene blev fjernet fra 6-brønds plader og farves med protokollen HEMA 3 Stain sæt (Fisher Scientific Company, Kalamazoo, MI). De ikke-besatte celler blev skrabet af på toppen af ​​Transwell med en vatpind. Antallet af invaderede celler blev talt i fire mikroskopfelter (10X) pr tilstand. Procentdel af invasion blev beregnet i forhold til antallet af besatte celler i kontrolgruppen miRNA inhibitoren godt, hvilket blev taget som 100%.

Statistisk analyse

t-test blev udført under anvendelse af GraphPad Prism version, 5,04 til Windows, GraphPad Software, San Diego California USA, www.graphpad.com. Alle eksperimenter blev udført tredobbelt og p-værdi 0,05 for et tosidet test blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Ekspression af MIR-21 og MIR-21-relaterede molekyler i. ovariecancerceller

i en foreløbig microarray analyse udført i vores laboratorium, vi identificerede 320 gener udtrykkes forskelligt (fold forandring 3 og p-værdi 3 × 10

-4) i A2780CP20 (cisplatin resistente)

vs.

A2780 (cisplatin følsom) celler (tabel S1). Den microarray data blev deponeret i Gene Expression Omnibus (GEO): tiltrædelse: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE51683. Betragtninger miR-21 og c-Jun blev opreguleret blev PDCD4 nedreguleret i A2780CP20 sammenlignet med A2780-celler (tabel S1). RT-PCR-forsøg bekræftede den microarray data (figur 1A). MIR-21-genet er placeret i intron 10 i TMEM-49-genet [17]. De messenger-RNA (mRNA) niveauer af TMEM-49 og β-actin var ikke anderledes i A2780CP20 og A2780-celler (Figur 1A), som bekræfte tidligere fund, at præ-mir-21 og TMEM-49 uafhængigt reguleres [33]. Figur 1B viser, at Mir-21 niveauer korrelerer med følsomheden af ​​ovariecancerceller for cisplatin behandling (IC

50, figur 1 B). Western blot-analyse (figur 1C) viste, at de samlede c-Jun og p-c-Jun-proteinniveauer var højere i A2780CP20 forhold til A2780-celler. Imidlertid viste modstående resultater (figur 1C), de PDCD4 proteinniveauer. I andre cellelinjer, Signal Transducer og transkriptionsaktivator 3 (STAT3) regulere MIR-21-ekspression [17]. Men STAT3 protein niveauer var ens i A2780CP20 og A2780-celler (figur S1), der udelukker muligheden for, at STAT3 konto for de højere miR-21 niveauer i A2780CP20 sammenlignet med A2780 celler. Disse resultater antyder, at c-Jun er ansvarlig for MIR-21 ekspressionsniveauer i cisplatin-resistente ovariecancerceller.

(A) Validering af mikroarrays ved RT-PCR. (B) MIR-21-niveauer i et panel af ovariecancerceller. MIR-21 niveauer blev udtrykt i forhold til A2780-celler MIR-21 niveauer. IC50-værdier blev beregnet efter 72 timers behandling af celler med forskellige koncentrationer af cisplatin som beskrevet i afsnittet “Materialer og fremgangsmåder”. (C) Vurdering af c-Jun og p-c-Jun-protein ekspression i A2780 og A2780CP20 celler. (D) Proteinekspression analyse af MAPK’er i alt og nukleare fraktioner af A2780 og A2780CP20 celler. Ekspressionsniveau i figurerne A, C og D er uden cisplatin behandling. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 sammenlignet med kontrol. Søjler angiver midlerne til triplikater ± S.E.M.

Det er velkendt, at den største aktivator af c-Jun er JNK-1 [34]. Således har vi vurderet protein niveauer af JNK i A2780 og A27870CP20 celler. Den samlede JNK-1 og nukleare p-JNK-1protein niveauer var højere i A2780CP20 forhold A2780 celler. Protein- niveauerne af p-JNK-2/3 og total JNK-2/3, de to andre JNK-1-isoformer, var ens i begge cellelinier (figur 1D), der antyder, at JNK-1 /c-Jun kaskade regulere miR-21 i A2780CP20 celler. Beviser tyder på, at den ekstracellulære signal reguleret kinase, kan ERK aktivere c-Jun [35], [36]. Selv om det samlede ERK protein niveauer var ens i begge cellelinier, de p-ERK protein niveauer var lavere i A2780CP20 forhold til A2780-celler udelukket muligheden for, at aktiverede ERK hensyn til de højere MIR-21 niveauer i A2780CP20 forhold til A2780-celler.

Effekt af JNK-1 /c-Jun hæmning i miR-21 og PDCD4 udtryk

for yderligere at bestemme, om JNK-1 regulerer c-Jun og miR-21-ekspression i cisplatin resistente celler, vi behandlet A2780CP20 celler med SP600125, en velkendt kemisk inhibitor af c-Jun-phosphorylering af JNK-1 [34]. Inkubation af A2780CP20 celler med SP600125 reducerede p-c-Jun-niveauer, som forventet (figur 2A). Der blev ikke observeret signifikante ændringer i protein niveauer af c-Jun, total og p-JNK-1 eller total og p-JNK-2/3 efter behandling af A2780CP20 celler med SP600125 hæmmer (figur 2A). Real-time PCR viste en signifikant reduktion (60% og * p 0,05) i de præ-mir-21-niveauer efter behandling af A2780CP20 celler med SP600125 (figur 2B). Den samme inhibitor forårsagede en stigning i PDCD4 protein niveauer, som observeret i western blot af figur 2C. Endvidere inhibering af MIR-21 med en MIR-21 specifik oligonukleotid-inhibitor (antagomiR) øgede PDCD4 proteinniveauer (figur 2D), som bekræftede tidligere resultater, at MIR-21 regulerer PDCD4 i ovariecancerceller [37], [18]. Endvidere transient transfektion af A2780CP20 celler med et siRNA mod c-Jun signifikant (** p 0,01) inhiberede pre-MIR-21-ekspression (figur 2E). Western blot analyse viste, at behandling af cisplatin følsomme A2780 celler med SP600125 ikke påvirkede niveauet af p-JNK-1, JNK-1, s-JNK-2/3, JNK2 /3, c-Jun, præ-miR- 21 eller PDCD4 (figur S2). Disse resultater antyder, at JNK-1 /c-Jun-vejen fører til MIR-21 overekspression i cisplatin-resistente ovariecancerceller.

A2780CP20 celler blev behandlet med 10 pM SP600125. (A) Western blot viste inhibering af p-c-Jun efter behandling med SP600125 i A2780CP20 celler sammenlignet med kontrol (DMSO). (B) SYBR-I-baseret real-time PCR blev udført for at beregne den relative præ-mir-21-ekspression i A2780CP20 celler efter behandling med SP600125 inhibitor. (C) Western blot og densitometrisk analyse af PDCD4 protein ekspressionsniveauer efter behandling af A2780CP20 celler med SP600125. (D) PDCD4 protein ekspressionsniveauer efter transfektion af A2780CP20 med MIR-21 oligonukleotid hæmmer. (E) A2780 CP20 celler blev transient transficeret med to c-Jun-målrettede siRNA’er som beskrevet i “Materialer og metoder” sektionen. Western blot analyse viser, at både c-Jun-siRNA’er faldt c-Jun-niveauer. SYBR-I-baseret real-time PCR blev udført (se “Materialer og metoder” sektionen) for at beregne de relative pre-mir-21 ekspressionsniveauer i A2780CP20 celler efter siRNA-medieret c-Jun nedregulering. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 sammenlignet med kontrol. Kolonner repræsenterer midlerne til triplikater ± SEM

Analyse af c-Jun-binding til miR-21 DNA promotorregioner

For at afgjort vise, at c-Jun er ansvarlig for den højere miR -21 niveauer i A2780CP20 sammenlignet med A2780 celler, vi vurderet de pri-mir-21 promotor DNA-regioner, der er forbundet med pc-Jun af chip analyse. Mængden af ​​DNA immunpræcipiteret med p-c-Jun-antistof i begge cellelinier blev amplificeret med et par primere omfattede genkendelseselementer c-Jun-i PRI-mir-21 promotorregionen (figur S3 og tabel S2). Andre par af primere amplificerer en DNA-region langt fra c-Jun-genkendelsessteder blev anvendt som kontrol (tabel S2). Mere end fem gange af DNA-niveauer trækker ud i A2780CP20 end i A2780-celler efter immunpræcipitering med p-c-Jun-antistof (figur 3A). Der blev ikke observeret nogen signifikante forskelle i DNA-mængder efter immunpræcipitering med c-Jun, Pol II eller IgG-antistoffer (figur 3A), som viste, at PC-Jun binder specifikt til pri-MIR-21 promotorområder, og at flere pc-Jun proteinniveauer er højere i A2780CP20 end i A2780 celler. Der blev ikke observeret nogen signifikante forskelle i DNA-niveauer, når PCR blev udført med de ikke-promotor DNA-primere efter immunpræcipitering med pc-Jun-antistof (figur 3B).

chip assay blev udført som beskrevet i “Materialer og metoder “sektion. (A) SYBR-I-baseret real-time PCR-amplifikation af området, der indeholder c-Jun-genkendelsessekvensen i PRI-MIR-21 DNA. Phospho-c-Jun-niveauer bundet til PRI-MIR-21-promotoren var højere i A2780CP20 celler sammenlignet med A2780-celler. (B) SYBR-I-baseret real-time PCR-amplifikation af en DNA-region langt af præ-mir-21-promotoren blev udført som en kontrol. * P 0,05 sammenlignet med kontrol. Kolonner repræsenterer midlerne til triplikater ± SEM

Effekt af miR-21 overekspression i følsomheden af ​​kræft i æggestokkene celler til cisplatin behandling

For at teste, om miR-21 bidrager til cisplatin modstand af kræft i æggestokkene celler, vi ektopisk udtrykte pre-mir-21 i A2780 celler (Figur S4 og S5). Figur 4A viser, at sammenlignet med ikke-transficerede A2780 celler eller med tom vektor (klon 1, fig S4), stabil transfektion af præ-mir-21 (klon 1, fig S4) øgede MIR-21 modne niveauer. De PDCD4 proteinniveauer blev også signifikant reduceret (69%, *** p 0,001) i før-mir-21 A2780 klon (A2780-MIR-21) sammenlignet med den tomme vektor-klon (A2780-EV) (figur 4B) . Ektopisk ekspression af præ-mir-21 i A2780 celler resulterede i en signifikant stigning i celleproliferation (15,4%, *** p 0,001) sammenlignet med A2780-EV-celler (figur 4C). Derudover cisplatin behandling (1 uM), i resulterede A2780-MIR-21-celler i signifikant (ca. 15%, ** p 0,01) reduktion af cellevækstinhiberingen sammenlignet cisplatinbehandlingen af ​​A2780-EV-celler (figur 4D)

(A) A2780 celler blev stabilt transficeret med pCMV-miR21 eller tomme pCMV-EV vektorer. MIR-21-ekspression blev kvantificeret ved QRT-PCR. ** P 0,01.