PLoS ONE: Identifikation af to nye HOXB13 Kimcellelinje Mutationer i portugisisk Prostata Cancer Patients

Abstrakt

HOXB13

kimcellelinje variant G84E (rs138213197) blev for nylig beskrevet i mænd af europæisk afstamning, med højeste forekomst i Nordeuropa. Den G84E mutation er ikke blevet fundet i patienter af afrikansk eller asiatisk afstamning, som kan foretage andre

HOXB13

varianter, hvilket indikerer allel heterogenitet afhængigt af befolkningen. For at få indblik i det fulde omfang af kodning

HOXB13

mutationer i portugisiske patienter med prostatacancer, besluttede vi at sekventere hele den kodende region af

HOXB13

gen i 462 tidlig debut eller familiær /arvelige tilfælde. Desuden har vi søgt efter somatiske

HOXB13

mutationer i 178 prostata carcinomer at vurdere deres forekomst i prostata carcinogenese. Tre forskellige patienter viste sig at bære i deres kimcellelinje DNA to nye missense varianter, som ikke blev identificeret i 132 kontrolpersoner. Begge varianter er forudsagt til at være skadelig ved forskellige

i silico

værktøjer. Ingen somatiske mutationer blev fundet. Disse resultater understøtter yderligere den hypotese, at forskellige sjældne

HOXB13

mutationer kan findes i forskellige etniske grupper. Påvisning af mutationer disponerer for prostatakræft kan kræve re-sekventering stedet genotype, der er relevante for befolkningen under undersøgelse

Henvisning:. Maia S, Cardoso M, Pinto P, Pinheiro M, Santos C, Peixoto A, et al. (2015) Identifikation af Two Novel

HOXB13

Kimcellelinje Mutationer i portugisiske Prostata kræftpatienter. PLoS ONE 10 (7): e0132728. doi: 10,1371 /journal.pone.0132728

Redaktør: Ludmila Prokunina-Olsson, National Cancer Institute, National Institutes of Health, UNITED STATES

Modtaget: Marts 12, 2015; Accepteret: 17 jun 2015; Udgivet: 15 Juli 2015

Copyright: © 2015 Maia et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. SM blev tildelt en ph.d.-stipendium (SFRH /BD /71397/2010) af den portugisiske Foundation for Science and Technology (http: //www.fct. pt /index.phtml.en). MC og MP er stipendiater i den portugisiske Cancer League (https://www.ligacontracancro.pt/). Projektet blev finansieret af den portugisiske Oncology Institute-Porto (https://www.ipoporto.pt/en/; tildele reference: CI-IPOP 16-2012). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (PRCA) er den mest almindeligt diagnosticeret nonskin kræft blandt mænd i de udviklede lande [1], hvor den kumulative risiko efter alder 75 skønnes at være 8,8 [2]. De bedst etablerede risikofaktorer for udvikling af PRCA er stigende alder, afrikansk afstamning og familie historie af sygdommen [3], hvor sidstnævnte er til stede i 10-20% af patienterne [4]. Case-kontrol og kohortestudier har vist, at den relative risiko for PRCA stiger betydeligt med stigende antal af berørte slægtninge og med faldende alder ved debut [5], og at enæggede tvillinger har en firedobbelte øget konkordans på PRCA forhold til dizygote tvillinger [6] .

Arvelig prostatakræft (HPC), som anslås at udgøre 5-10% af alle PRCA tilfælde, henviser til nukleare familier med mindst tre tilfælde af PRCA, familier med PRCA i hver af tre generationer i den fædrene eller maternel afstamning, eller en klynge af to pårørende diagnosticeret før de fylder 56, mens sammenlægning af PRCA tilfælde i en familie, der ikke opfylder disse kriterier er klassificeret som familiær PRCA [7]. Flere forfattere peger på, at op til 43% af de patienter diagnosticeret før de fylder 56, kan bære en høj risiko allel [6,8], men identifikation af stærkt penetrerende gener i familiær /arvelig PRCA har været vanskeligere end for andre typer af almindelige kræftform, nemlig i bryst og tyktarm. Selvom stede i kun 1-2% af alle PRCA tilfælde kimlinie mutationer i

BRCA2

gen var den første veletablerede genetiske risikofaktor [9], der giver en 7,3-8,6 gange øget risiko for at udvikle den sygdom før en alder af 65 i forhold til ikke-bærere [10]. I tidlig debut PRCA, forekomsten af ​​

BRCA2

mutationer stiger til 2,9%, der giver en 23-fold øget risiko for at udvikle sygdommen i en alder af 56 år [11].

I begyndelsen af ​​2012,

HOXB13

blev identificeret som en modtagelighed gen for PRCA [12]. En sjælden, men tilbagevendende germlinie variant [G84E, s (Gly84Glu), c.251G . A, rs138213197] blev rapporteret blandt mænd af europæisk afstamning og var forbundet med PRCA risiko. Desuden bærefrekvensen var højere hos patienter med tidlig debut (2,2%) eller en positiv familiehistorie med PRCA (2,2%) og højest i gruppen med både familie historie og tidlig debut sygdom (3,1%). Den laveste mutation frekvens blev set hos patienter med sent debuterende og nonfamiliær PRCA (0,6%). Siden denne publikation, har flere undersøgelser bekræftet sammenhængen mellem G84E variant og PRCA risiko [13-17], der er ansvarlig for op til 5% af familiære /arvelige PRCA tilfælde hos mænd af europæisk afstamning. Interessant, har G84E mutationen ikke findes blandt PRCA patienter af afrikansk eller asiatisk herkomst [12,15,18], der i stedet vise andre

HOXB13

mutationer, dokumenterer allel heterogenitet i forskellige etniske baggrunde. Den G84E variant er nu anses for at være en af ​​grundlæggerne mutation, der opstod i det nordlige Europa, hvor dens udbredelse er størst [14,16,17], og

HOXB13

skiller sig ud som den mest udbredte replikeres modtagelighed gen for PRCA afsløret til dato.

Da de fleste tidligere undersøgelser har genotypebestemmes kun G84E variant og findes begrænsede data for sydeuropæiske befolkninger, vi udførte sekventering af

HOXB13

kodende region at vurdere hyppigheden af ​​germlinie mutationer i 462 tidlig debut eller familiære /arvelige PRCA sager. Desuden har vi vurderet forekomsten af ​​somatiske

HOXB13

mutationer i PRCA ved sekventering af

HOXB13

kodende region af 178 prostata carcinomer.

Materialer og Metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse blev godkendt af Institutional etiske komité for den portugisiske Oncology Institute-Porto (autorisationsnummer: 38,010) og skriftligt samtykke blev opnået fra alle deltagere

Tidlig debut og familiær. /arvelig PRCA

Denne undersøgelse omfattede i alt 462 indeks tilfælde (HPC prøver) fra familier med tidlig debut og /eller familiær /arvelig PRCA, der blev udvalgt på grundlag af et af følgende kriterier: 1) PRCA diagnose før en alder af 56 eller 2) PRCA diagnose på alle alderstrin med familie historie af sygdommen (op til fjerde slægtninge) og mindst et familiemedlem (probanden eller en slægtning) med PRCA, før de fylder 66. de fleste patienter blev inviteret til at deltage i en undersøgelse med det primære formål at identificere germline mutationer i forbindelse med arvet PRCA disposition, der har som udgangspunkt alle levende patienter, der er registreret på North Region Cancerregisteret (RORENO) med en PRCA diagnose, før de fylder 66, mens en mindretal af familierne var blevet henvist til genetisk rådgivning på grund af tidlig debut eller familiær disposition. Alle undtagen to patienter (en fra Det Forenede Kongerige og en anden fra Angola) havde mindst én portugisisk forfader. Ingen systematisk PRCA screeningsprogram findes i den undersøgte population, er kun opportunistisk screening tilbydes mænd over 50 år. DNA blev ekstraheret fra perifert blod leukocytter hjælp Magna Pure LC DNA Isolation Kit-Large Volume (Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Tyskland) og når DNA var tilgængelig fra mere end én berørte slægtning pr familie, den yngste på tidspunktet for diagnosen blev betragtet som indekstilfældet.

Alle undtagen to patienter (en med prostata basalcellekarcinom og en anden med carcinosarcoma af prostata) havde den histopatologiske diagnose af prostata adenocarcinom. Den gennemsnitlige alder ved diagnose af indekset sager var 56,3 år (spændvidde: 36-79 år), med 52,4% af de patienter diagnosticeret før en alder af 56, 46,3% i alderen 56 og 65, og kun 1,3% efter 65 år (med kun ét tilfælde efter alder 70). Med hensyn til inklusionskriterier, vi havde fastsat for denne undersøgelse, 151 (32,7%) opfyldte alderskriteriet kun 220 patienter (47,6%) opfyldte familiens historie kriterium kun vejledende, og 91 patienter (19,7%) opfyldte begge kriterier. Af de i alt 462 familier undersøgt, 74 opfylder de klassiske Hopkins kriterier for arvelige [7] PRCA. Demografiske, kliniske og patologiske egenskaber er opsummeret i tabel 1. Medicinsk historie blev indsamlet under medicinske udnævnelser når det er muligt eller fra medicinske journaler, og familiens historie blev selvrapporterede.

Tumor prøver

Vi søgte efter somatiske

HOXB13

mutationer i 178 DNA-prøver ekstraheret fra prostata carcinomer fra patienter uselekterede til familie historie eller alder ved debut, med klinisk lokaliseret PRCA diagnosticeres og behandles med radikal prostatektomi på vores institution mellem 2001 og 2006. Kun 26 emner fra prostatektomi case-serier undersøgt for somatiske mutationer deles med 462 indeks sager undersøgt for germline mutationer. Disse tumorer tilhører en tidligere beskrevet konsekutiv serie af 200 prostatacarcinomer [19], hvorfra god kvalitet tumor-DNA var tilgængelig. Alle vævsprøver blev nedfrosset umiddelbart efter operationen og opbevaret ved -80 ° C. Fem-um tykke snit blev skåret og farvet for identifikation af de områder af PRCA og derefter vævet blok blev trimmet for at maksimere udbyttet af målceller ( 70% af tumorcellerne). Efterfølgende blev et gennemsnit på halvtreds 12-micron tykke snit skåret og hver 5

th afsnit blev farvet for at sikre en ensartet procentdel af målceller. DNA blev ekstraheret fra tumorvæv ved phenol /chloroform-metoden under anvendelse af fase-lock gel (5 PRIME, Hamborg, Tyskland). Den gennemsnitlige alder ved diagnose var 63,4 år (spændvidde: 49-74 år) og den patologiske etape var pT2 og pT3 i 54,6% og 45,4% af tilfældene, henholdsvis

HOXB13

sekventering.

for mutation screening af hele

HOXB13

kodende region, specifikke primerpar (S1 tabel) blev designet ved hjælp af Primer-BLAST design værktøj fra National center for Biotechnology Information (NCBI) [20 ]. En touchdown PCR blev udført med et indledende trin med denaturering ved 97 ° C i 10 minutter, efterfulgt af fire sæt cykler (6 + 6 + 6 + 22) med denaturering ved 97 ° C i 1 minut og forlængelse ved 72 ° C i 2 minutter. Annealing forekom ved 64 ° C i 1 minut i det første sæt af cykluser, og ved 62 ° C, 60 ° C og 56 ° C i 30 sekunder for de efterfølgende sæt. Reaktionen sluttede med en endelig ekstension ved 72 ° C i 10 minutter. Sanger-sekventering blev udført under anvendelse BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) ifølge producentens instruktioner. Produkterne blev kørt på en 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) og sekvenser blev sammenlignet med den

HOXB13

NCBI henvisning sekvens (NM_006361.5) ved hjælp af Mutation Surveyor V4.0.7 software (Softgenetics, State College, PA, USA)

Genotypning af kontrollen

Som kontrolpersoner, vi brugte 132 mandlige bloddonorer (gennemsnitsalder 56,8 år;. SD ± 5,1 år) fra det portugisiske Oncology Institute of Porto med nogen personlig historie af kræft på tidspunktet for blodprøvetagning. De ikke-synonyme substitutioner påvist i de PRCA patienter blev screenet i kontrol ved hjælp af Kaspar SNP genotypning (KBioscience, Herts, UK) på et Roche LightCycler 480 Real-Time PCR System ifølge producentens anvisninger. Kaspar assay primere (S1 tabel) blev designet ved hjælp af Primer-BLAST design værktøj fra NCBI [20]. Data blev analyseret i LightCycler 480 Software 1.5.0.

I silico

analyse af varianter

For at forudsige den funktionelle betydning af de identificerede varianter, vi brugte flere bioinformatiske værktøjer. Missense varianter blev evalueret af PolyPhen2 [21], PROVEAN [22], støvtætte [23], MutationTaster [24], MutPred [25], MutationAssessor [26] og ESEfinder 3.0 [27]. PROVEAN, støvtætte og ESEfinder 3.0 blev også forespurgt til synonyme varianter og MutationTaster for synonyme og intron varianter. Den PROVEAN grænsefladen blev brugt til at beregne både PROVEAN og finkæmme scoringer. Den Alamut Visual (version 2.6.1) software (Interactive Biosoftware, Rouen, Frankrig), der indeholder SpliceSiteFinder-lignende [28], MaxEntScan [29], NNSPLICE [30], GeneSplicer [31] og menneskelig Splejsning Finder [32], blev anvendt til at vurdere intron varianter. Standard tærskler blev anvendt i alle splejsning websted forudsigelse programmer.

For at verificere den evolutionære bevarelse af de respektive aminosyrepositioner, tilpasning multipel protein sekvens ved hjælp af menneskelige og orthologe arter sekvenser blev udført ved hjælp af Clustal W2 [33]. PhyloP [34] og Grantham [35] scorer for missense varianter blev også bestemt af Alamut Visual.

haplotypeanalyse

Kimcellelinje DNA-prøver af både patienter (HPC311 og P308T) deler den samme

HOXB13

kimcellelinje mutation blev genotype for de 11 mikrosatellitmarkører (6 lokaliseret i kromosom 17 og en til kromosom 2, 3, 5, 9 og 13) anført i S2 tabel. Alle 11 markører blev analyseret ved PCR under anvendelse fluorescerende endemærkede primere (S2 tabel) kapillarelektroforese blev udført på en ABI PRISM 310 Genetic Analyser (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Resultater

HOXB13

varianter

G84E mutation blev ikke fundet i nogen af ​​de 462 patienter med tidlig debut og /eller familiær /arvelig PRCA. Men fire patienter (prøver HPC311, HPC169, HPC474 og HPC138) gennemført fire forskellige heterozygote varianter, der, så vidt vi ved, er endnu ikke blevet beskrevet i nogen offentliggjort undersøgelse eller offentlig database, nemlig 1000 genomer projektet og Exome Variant Server ( tabel 2). Om HPC311 bærer en transversion fra en cytosin til en adenosin i position 383 (figur 1), hvilket fører til en aminosyresubstitution fra alanin til asparaginsyre i codon 128 [c.383C . A, p (Ala128Asp)]. En transversion fra en cytosin til en adenosin i position 720 blev fundet i emne HPC169 (figur 1), hvilket fører til en aminosyresubstitution fra en phenylalanin til en leucin i codon 240 [c.720C . A, p (Phe240Leu)]. En synonym substitution af et thymin med en adenosin i position 96 (c.96T A) og et intron variant (c.602-19T G). Blev fundet i patienter HPC474 og HPC138 henholdsvis

Stamtavler og elektroferogrammer af patientens HPC311 med

HOXB13

p (Ala128Asp), c.383C .. En variant (A) og patient HPC169 med

HOXB13

p (Phe240Leu), c.720C En variant (B). Indekset sagen og placeringen af ​​hver mutation er angivet med en pil

Derudover fandt vi fem andre varianter, der er angivet både i 1000 genomer Project og Exome Variant Server:. Tre synonym (c.330C A, c.366C T og c.513T C), en intron (c.602-9G A) og et i den 3′-utranslaterede region (c * 28C . A). Den rapporterede allel frekvens i 1000 genomer Project og Exome Variant Server af rs148901331 (c.602-9G A) og rs371753257 (c * 28C . A) er lavere end 1%. Variant rs33993186 (c.330C A) synes at være mere hyppigt hos personer med afrikansk afstamning, selv om vores patient (HPC 517) ikke rapportere afrikansk afstamning. De mindre allel frekvenser (MAF) for rs8556 (c.366C T) og rs9900627 (c.513T C) var 13,2% og 13,0%, henholdsvis i vores prøver, hvilket er i konkordans med eksisterende data (tabel 2).

med hensyn til tumor prøver, p. (Ala128Asp) variant var den eneste ændring fundet (patient P308T, i heterozygoti). Som DNA ekstraheret fra perifert blod fra denne patient var til rådighed, var vi i stand til at bekræfte, at missense ændring var til stede i kimcellelinje og derfor ikke var en somatisk mutation (figur 2).

Stamtavle (A) og elektroferogrammer af patientens P308T opnået fra tumor (B) og fra blod (C) viser tilstedeværelsen af ​​

HOXB13

c.383C . A, s (Ala128Asp) variant i heterozygoti. Indekset sagen og mutationen er angivet med en pil.

Endelig har vi genotype 264 alleler (132 kontrolpersoner) for de to ikke-synonym missense varianter ved hjælp af Kaspar SNP Genotypning System og ingen af ændringer blev fundet.

i silico

analyse af varianter

for at udforske den funktionelle betydning af de identificerede

HOXB13

varianter, vi brugte forskellige bioinformatiske værktøjer. Varianter rs8556 og rs9900627 blev udelukket fra denne analyse på grund af deres høje frekvens. Med hensyn til kodning varianter (tabel 3), den missense varianter s. (Ala128Asp) og p. (Phe240Leu) blev forudsagt til at være patogene ved PolyPhen2, PROVEAN, støvtætte og MutationTaster. Den synonym varianter c.96T A og c.330C A blev klassificeret som sygdomsfremkaldende af MutationTaster, men neutral og tolereres af PROVEAN og finkæmme hhv. Sandsynlighederne for missense varianter blive skadelig forudsagt af MutPred, den funktionelle effekt kombineret score forudsagt af MutationAssessor, og de forudsete virkninger på exoniske splejsning forstærkere givet af ESEfinder 3.0 er vist i Tabel 3. Vedrørende ikke-kodende varianter (tabel 4), blev alle kategoriseret som polymorfier ved MutationTaster. Med hensyn til de Alamut Visual splejsning forudsigelser, de NNSPLICE og GeneSplicer resultater tyder på, at intron variant c.602-19T G kan forstyrre anerkendelsen af ​​den naturlige acceptor splejsning site, mens SpliceSiteFinder-lignende og menneskelige Splejsning Finder forudsige ingen ændring mellem vild -type og muterede sekvenser. Resultaterne for intron variant c.602-9G En var endnu mere usammenhængende, med NNSPLICE forudsige et fald og MaxEntScan en stigning i splejsning effektivitet (tabel 4)

Med hensyn. . til den evolutionære nukleotid bevaring, p (Ala128Asp) variant forekommer i en stærkt bevaret nukleotid (PhyloP score: 0,89), hvorimod p (Phe240Leu) ændring sker i en ikke-konserverede nukleotid (PhyloP score: -0,35).. HOXB13 protein sekvensalignment ved anvendelse Clustal W2 viser, at både alanin i stilling 128 og phenylalanin i position 240 er fuldt konserveret blandt de arter angivet i fig 3. De fysisk-kemiske forskel mellem aminosyrerne er moderat for p (Ala128Asp) variant (Grantham score.: . 126) og lille til p (Phe240Leu) variant (Grantham score:. 22)

aminosyrerne rester forudsagt at ændres ved begge missense mutationer identificeret i denne undersøgelse [p (Ala128Asp) og p.. (Phe240Leu)] er fremhævet med grå skraverede kasser og rest 84 forventes at blive påvirket af den tidligere beskrevne G84E mutation er fremhævet af en grå boks.

klinisk-patologisk karakteristika af

HOXB13

mutation luftfartsselskaber

Patienter HPC311 og HPC169 tilhører vores serie af tidlig debut og /eller familiær /arvelig PRCA og de bærer c.383C . A, s (Ala128Asp), og c.720C A, s. (Phe240Leu), mutationer, hhv. Begge har familie historie PRCA (figur 1) og blev diagnosticeret i en alder af 52, og dermed opfylder ikke kun familiens historie kriterium, men også alder kriterium, vi havde etableret for denne serie. Patient HPC311 havde en serum PSA ved diagnose af 6.2ng /ml, blev indledningsvis behandlet med radikal prostatektomi [Gleason score: 7 (3 + 4); TNM stadie: pT3bN0M0] og fire år senere, på grund af stigende PSA niveauer, modtog han også ekstern strålebehandling. En af hans søstre blev diagnosticeret med leukæmi. Patient HPC169 havde en serum PSA ved diagnose af 4.06ng /ml, en biopsi Gleason score på 6 (3 + 3), en cT2NxM0 kliniske stadium, og han blev behandlet med brachyterapi alene. Han har en faderlig fætter, der blev diagnosticeret med brystkræft i en alder af 70

Patient P308T tilhører prostata karcinom serien og bærer samme kimcellelinje mutation fundet i patient HPC311 [c.383C A; s. (Ala128Asp)]. Efter at være blevet diagnosticeret med PRCA i en alder af 65 og har ingen familie historie PRCA (figur 2), han ikke opfylder nogen af ​​de kriterier, vi havde etableret for kønscellelinie studiet. Han havde et serum PSA ved diagnose af 6.5ng /ml og blev behandlet med radikal prostatektomi [Gleason score: 6 (3 + 3); TNM stadium: pT2cN0M0]. I en alder af 68 var han også diagnosticeret med en høj kvalitet papillær urothelial karcinom i blæren og seks år senere med en gastrisk adenocarcinom. Han har en afdød søster med diagnosticering af mavekræft i en alder af 65 år.

I betragtning af, at de to berørte slægtninge til patientens HPC169 allerede afdøde, og at den berørte slægtning patient HPC311 bor i udlandet, var det ikke muligt at udføre adskillelse analyse i et af de berørte slægtninge. Med hensyn til andre former for kræft, blev adskillelse analyse ikke foretaget, enten fordi det ikke ville være oplysende (sent debuterende brystkræft), eller fordi de berørte pårørende allerede var afdøde (fig 1 og 2).

haplotypeanalyse

Genotypning af polymorfe mikrosatellitmarkører hos patienter P308T og HPC311 bærer

HOXB13

c.383C en kimlinje mutation viste, at selv om vi ikke kunne afvikle en haplotype for disse to personer (på grund af manglende adgang til pårørende til test), de deler en allel i fem af de seks markører i 17q (hvor

HOXB13

er placeret), mens den samme konsistent mønster ikke blev observeret for markører i andre kromosomer (S1 fig, S2 Table) . Hverken genotypiske eller stamtavle data viser, at to patienter er nært beslægtede.

Diskussion

Siden den første offentliggørelse rapportering

HOXB13

som en modtagelighed gen for PRCA [12], flere andre forfattere har bekræftet sammenhængen mellem G84E variant og PRCA risiko [13-16]. Selv den rapporterede hyppighed varierer alt efter den undersøgte population [14-17,36], bærefrekvensen synes at være generelt højere hos patienter med tidlig debut eller en positiv familiehistorie med PRCA og højest i gruppen med både familie historie og tidlig -onset sygdom [12,16,17,37,38]. Flere undersøgelser har også rapporteret, at G84E variant ikke findes i mænd uden europæisk herkomst [16,39], men andre

Der er rapporteret HOXB13

mutationer hos patienter af afrikansk og asiatisk afstamning [12,15,18] . Ingen systematisk undersøgelse af

eksisterer HOXB13

mutationer i PRCA patienter fra Sydeuropa; i virkeligheden, de eneste data fra befolkninger fra denne region er fraværet af G84E variant i 183 mænd indskrevet i chemoforebyggelse forsøget Reducer, herunder 165 fra Portugal, selv om det er uklart, hvor mange af disse efterfølgende udviklede PRCA under opfølgning [ ,,,0],40].

i betragtning af overvægten af ​​den G84E mutation i Nordeuropa og manglen på data om de sydeuropæiske befolkninger, har vi valgt at udføre fuld sekventering af den kodende region af

HOXB13

gen i stedet for genotypebestemmelse kun for G84E variant. I vores analyse af en serie af 462 indeks patienter med tidlig debut og /eller familiær /arvelig PRCA og en sammenhængende serie af 178 prostata carcinomer fra patienter uselekterede til familie historie eller alder ved debut, var vi i stand til at påvise, i tre forskellige patienter, to nye germlinie forandringer i heterozygoti: p. (Ala128Asp) og p (Phe240Leu).. De to nye missense varianter forventes at være skadelig ved flere forskellige

i silico

værktøjer. Faktisk sammenligne den

in silico

analyser af de to nye missense varianter vi her rapporterer med de af G84E, er der ingen signifikante forskelle i patogenicitet scores: PolyPhen2, PROVEAN, støvtætte og MutationTaster forudsige alle tre varianter til være sygdomsfremkaldende; MutationAssessor forudsiger funktionelle effekt kombineret snesevis af 2,5, 2,5 og 2,9 for G84E, s (Ala128Asp) og p (Phe240Leu) henholdsvis..; sandsynlighederne for varianterne bliver skadelig beregnet af MutPred er 24%, 24% og 60% for G84E, s. (Ala128Asp) og p. (Phe240Leu), hhv. P. (Phe240Leu) ændring er beliggende i den stærkt konserverede homeobox-domæne (figur 4) og den forudsagte aminosyreændring forekommer i en særdeles konserveret rest (Fig 3). . Selvom p (Ala128Asp) er ikke placeret på enhver kendt domæne (figur 4), det forekommer i en stærkt bevaret aminosyre (figur 3) og stærkt konserverede nukleotid (PhyloP: 0,89). Interessant genotypebestemmelse data for polymorfe mikrosatellitmarkører afslørede, at de to emner bærer

HOXB13

c.383C A kimcellelinje mutation deler den samme allel i fem markører, men ikke for markøren nærmest HOXB13 (D17S1326). Dette betyder ikke nødvendigvis udelukker en fælles forfader, som rekombination eller mutationshændelser kunne redegøre for haplotype afvigelse fra en enkelt forfader.

Homeoboxen protein Hox1A3 N-terminale domæne (PF12284) og homeobox domæne (PF00046) er repræsenteret som en orange kasse inde i hver af de tilsvarende exons (homeobox protein Hox1A3 N-terminale domæne: resterne 21-123; homeobox domæne: rester 217-273). Varianter beliggende inden disse domæner er vist over den tilsvarende domæne. Begge missense varianter findes i vores patienter [s. (Ala128Asp) og s. (Phe240Leu)] vises i rødt. Varianter beskrevet af andre forfattere er vist i sort.

Flere forfattere har ikke fundet en signifikant sammenhæng mellem sygdom aggressivitet (nemlig præsentere PSA, Gleason score, TNM stadie, NCCN risikogruppe, ekstra-prostata sygdom på diagnose, biokemisk svigt efter behandling) og G84E luftfartsselskab status [12-14,37,38], mens Laitinen og samarbejdspartnere har rapporteret en sammenhæng mellem G84E mutation og et højt PSA-niveau (≥20ng /ml) ved diagnose. Desuden er det stadig ikke klart, om G84E luftfartsselskaber også har en øget risiko for andre typer af kræft i tillæg til PRCA. To publikationer tyder på, at G84E mutation luftfartsselskaber har en øget risiko for brystkræft [17,41], mens en større undersøgelse ikke identificere en sammenhæng mellem G84E og brystkræft [42]. Med hensyn til sammenhængen mellem G84E mutation og kolorektal cancer risiko, blev der ikke statistisk signifikans findes i to rapporter [17,41], mens en anden undersøgelse med en bredere gruppe foreslog en øget kolorektal cancer risiko [43]. En nylig undersøgelse tyder på, at G84E-mutationen er forbundet med en øget risiko for flere kræfttyper, nemlig bryst og blære. Endvidere blev en stærkere associering med G84E-mutationen findes ikke kun i patienter diagnosticeret med flere cancere (i forhold til dem med en enkelt kræft), men også hos patienter med PRCA diagnose plus en yderligere type cancer (sammenlignet med PRCA alene) [44 ]. I vores undersøgelse af de tre patienter, der huser

HOXB13

missense varianter præsenteret enten med mellem- eller høj risiko for sygdom og en af ​​de tre probander præsenteret tre forskellige primære tumorer, nemlig blære- og mavekræft foruden PRCA. Større undersøgelser case-kontrol er nødvendige for at afgøre, om germlinie

HOXB13

mutationer disponerer for en mere aggressiv sygdom, og at vurdere, om de øge risikoen for andre kræftformer. Svarene på disse spørgsmål vil være afgørende for korrekt genetisk rådgivning og klinisk pleje af

HOXB13

mutationsbærere, da de vil afgøre, hvilken slags screening, behandling og opfølgning, vi skal tilbyde disse patienter og deres afficerede eller . sunde slægtninge

Vi fandt ingen beviser for, at somatiske

HOXB13

mutationer er almindelige i prostata carcinogenese, noget, der er kompatibelt med data i Katalog over somatiske mutationer i Cancer (COSMIC, http: //cancer.sanger.ac.uk/cosmic/, adgang på 15

maj th 2015) viser kun to mutationer i 521 prostata testede karcinomer. Faktisk er den eneste mutation, vi fandt i de 178 prostatacarcinomer viste sig at være en kimcellelinje-mutation. Interessant mutationen vi fundet i tumoren var heterozygote, som faktisk var tilfældet i den eneste G84E bærer tidligere evalueret for tab af heterozygositet i tumoren [12]. Desuden tumorer i G84E bærere synes at opretholde HOXB13 udtryk [12,17]. Disse to observationer, der er forbundet med det faktum, at der ikke beskærer mutationer hidtil er blevet rapporteret i PRCA patienter, er kompatible med en aktiverende onkogen rolle af disse missense

HOXB13

mutationer. Imidlertid har andre forfattere foreslået, at

HOXB13

fungerer som et tumorsuppressorgen i prostata og andre former for kræft [45-47], formentlig gennem haploinsufficiency. Spørgsmålet om, hvorvidt dette gen er et tumorsuppressorgen eller et proto-onkogen er derfor stadig åben, og der er brug for funktionelle undersøgelser at afklare spørgsmålet. Faktisk kan funktionen af ​​HOXB13 afhænge af den cellulære kontekst, da det er blevet vist, at det er en cellevækst suppressor ved inhibering af androgen-medierende signaler [48], men på den anden side kan det også være involveret i androgen- uafhængig overlevelse PRCA celler gennem opregulering af E2F [49].

konstateringen af ​​to nye kimcellelinje mutationer, herunder to patienter med samme missense mutation s. (Ala128Asp), men ikke den tidligere beskrevne G84E variant, tyder at der er geografiske heterogenitet om mønster af

HOXB13

mutationer i tidlig debut eller familiær /arvelig PRCA og denne specifikke test for G84E i andre end dem med nordeuropæisk oprindelse befolkninger kan ikke angives. I stedet bør udføres fuld sekventering af

HOXB13

kodende region indtil mutations mønster af hver population er etableret.

Støtte Information

S1 Fig. . Patienter P308T og HPC311 mikrosatellitmarkørerne markør haplotyper

kapillarelektroforese mønster af mikrosatellitmarkører D17S1326, D17S1323, D17S855 og D17S800 (fra venstre mod højre) for patient P308T (A) og patient HPC311 (B), der bærer c.383C A

HOXB13

mutation. Selvom vi ikke kunne afvikle en haplotype for disse to individer, de præsenterer alleler i almindelige (som angivet ved pilen), der kan være forenelig med en delt haplotype

doi:. 10,1371 /journal.pone.0132728.s001

(TIF)

S1 Table. Primere anvendes til sekventering af hele den kodende region af

HOXB13

gen og for Kaspar SNP genotypning

doi:. 10,1371 /journal.pone.0132728.s002

(DOCX)

S2 Table. Mikrosatellitmarkører genomisk placering, primer sekvenser og haplotyper af de to patienter, der af c.383C En

HOXB13

mutation

doi:. 10,1371 /journal.pone.0132728.s003

(DOCX)

tak

Vi vil gerne takke Paula Paulo for at give nyttige kritisk gennemgang af manuskriptet, og også udtrykke vores taknemmelighed over for alle de patienter og deres familier, der deltog i denne undersøgelse.