PLoS ONE: baicalein inhiberer Progression af Galdeblære kræftceller ved at nedregulere ZFX

Abstrakte

baicalein, et udbredt kinesisk urtemedicin, har flere farmakologiske aktiviteter. Imidlertid forbliver de præcise mekanismer i de anti-spredning og anti-metastatiske virkninger af baicalein på galdeblæren kræft (GBC) dårligt forstået. Derfor er målet med denne undersøgelse var at vurdere de anti-spredning og anti-metastatiske virkninger baicalein og den relaterede mekanisme (r) på GBC. I den foreliggende undersøgelse fandt vi, at behandling med baicalein inducerede en signifikant inhiberende virkning på proliferation og fremmes apoptose i GBC-SD og SGC996 celler, to udbredte galdeblæren cancercellelinjer. Derudover behandling med baicalein inhiberede metastase af GBC celler. Endvidere demonstrerede vi for første gang, at baicalein inhiberede GBC cellevækst og metastase via nedregulering af ekspressionsniveauet af zinkfinger-protein X-bundet (ZFX). Afslutningsvis vores undersøgelser tyder på, at baicalein kan være en potentiel phytochemical flavonoid for terapi af GBC og ZFX kan tjene som en molekylær markør eller intelligent mål for GBC

Henvisning:. Liu TY, Gong W, Tan ZJ, Lu W, Wu XS, Weng H, et al. (2015) baicalein inhiberer Progression af Galdeblære kræftceller ved nedregulering af ZFX. PLoS ONE 10 (1): e0114851. doi: 10,1371 /journal.pone.0114851

Academic Redaktør: Seok-Geun Lee, Kyung Hee University, Korea, Republik

Modtaget: Januar 16, 2014 Accepteret: November 13, 2014; Udgivet: januar 24, 2015

Copyright: © 2015 Liu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering: Denne undersøgelse blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr 81.172.026, 81.272.402, 81.301.816 og 81.172.029), National High Technology Research and Development Program (863 Program) (nr 2012AA022606), Fonden for Tværfaglig forskning af Shanghai Jiao Tong University (nr YG2011ZD07) , Shanghai videnskab og teknologi kommissionen mellemstatslige internationalt samarbejdsprojekt (nr 12410705900), Shanghai videnskab og teknologi kommissionen medicinsk-ledende projekt (nr 12401905800), Program for Changjiang Scholars, Natural Science Research Foundation of Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (nr 13XJ10037), førende Talent program Shanghai, Sejlsport program af Shanghai videnskab og teknologi kommissionen (14YF1403000) og Specialized Research Foundation for Ph.D program of Higher Education-Priority Development Field (nr 20130073130014). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Galdeblære kræft (GBC) er den femte mest almindelige kræft i galdevejene, kendetegnet ved tidlig lymfeknude invasion og fjernmetastaser [1-3]. Det har tendens til at være en aggressiv tumor, der spreder tidligt og 90% af GBC patienterne præsenteres på et fremskredent, inoperabel stadium [4, 5]. Tidlig galdeblære karcinom er asymptomatisk eller manifesterer kun som en abdominal ubehag. Nogle patienter kan udvikle symptomer på akut eller kronisk cholecystitis, som er let at ignorere eller miss. I den senere periode, kan patienterne udvikle mavesmerter, gulsot og kantet, men de fleste af patienterne har ingen kirurgiske muligheder. Prognosen af ​​avancerede galdeblæren karcinom er meget dårlig [6-10], og 5-års overlevelse er kun omkring 5%. Hidtil kirurgisk resektion er den eneste behandling, der giver et håb for helbredelse [11]. Derfor er det meget vigtigt at identificere pålidelige biomarkører og narkotika til overvågning både progression og behandling af sygdommen.

baicalein er en af ​​de effektive ingredienser udvundet fra

Labiatae

planter

scutellaria baicalensis georgi

‘s tør rod, der har mange farmakologiske virkninger, såsom antiinflammatorisk, anti-bakteriel, anti-virale, anti-allergi, anti-oxidation og så videre [12-14]. For nylig er antitumor-virkningen af ​​baicalein forårsagede mere og mere opmærksomhed af mennesker. Cellulære og dyreforsøg har vist, at baicalein havde stærke anti-tumor aktivitet. For eksempel baicalein aktiveret AhR og faciliated nedbrydningen af ​​cyclin D1, som forårsager standsning af cellecyklus ved G1 fasen, og inducerer inhibering af celleproliferation [15]. Baicalein inhiberer DMBA /TPA-induceret hud tumorigenesisin mus ved modulering proliferation, apoptose og inflammation [16]. Baicalein ophæver reaktive ilt arter (ROS) -medieret mitokondriel dysfunktion i eksperimentel pulmonal carcinogenese

in vivo

[17]. Baicalein kan spille en vigtig rolle i inhiberende virkning på proliferation af ovariecancerceller [18]. På grund af sin brede anti-tumor-spektrum, passende medicin kilde, små toksicitet og bivirkninger, baicalein synes at være en lovende molekylær markør eller terapeutisk mål af galdeblæren kræft.

zinkfingerprotein, X-bundet (ZFX) er en transkriptionsfaktor, der kodes af dets gen på pattedyrs X-kromosom. ZFX spiller en central rolle i at kontrollere forny sig selv og vedligeholdelse af både embryonale stamceller og hæmatopoietiske stamceller [19-23]. Ekspressionsniveauet af ZFX korrelerer med aggressivitet og sværhedsgrad hos mange cancertyper, herunder prostatacancer, brystcancer, humane malignt gliom og leukæmi. Tidligere forskning viste, at ZFX kan spille en kritisk rolle ved celleproliferation, cellecyklusfordeling, og apoptose i mange cancerceller [24-29]. Vores tidligere resultater også fundet, at ZFX kan inddrage i reguleringen af ​​celledeling og migration i galdeblæren kræft [30]. Således blev den nuværende undersøgelse designet til at undersøge virkningerne og mekanismer baicalein mod galdeblæren kræft celleproliferation, invasion og metastase

In vitro

i en ortotopisk galdeblæren tumor model

in vivo

. Endvidere havde ZFX blevet vist, nedstrøms mål for baicalein, som kan tilbyde en lovende ny tilgang i effektiv behandling af galdeblæren carcinom.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Nude mus (med en indledende kropsvægt på 20-22 g) blev opnået fra Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd (Shanghai, Kina). Alle dyr behandlinger blev udført i nøje overensstemmelse med de internationale etiske retningslinjer og National Institutes of Health Guide vedrørende Pleje og anvendelse af forsøgsdyr. Forsøgene blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg for Shanghai Jiao Tong University.

cellelinjer og kultur

GBC-SD og SGC996 celler blev købt fra Shanghai Cell Institute Land Cell Bank . GBC-SD-celler blev dyrket i høj-glucose DMEM (Gibco, USA) og de SGC996 celler blev dyrket i RPMI1640 (Gibco, USA). Alle de to celler blev suppleret med 10% føtalt bovint serum (Gibco, USA), 100 ug /ml streptomycin og 100 U /ml penicillin (Hyclone, USA), ved 37 ° C, under en 5,0% CO2 atmosfære.

Drugs og antistoffer

baicalein blev købt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, USA), opløst i DMSO som en bestand koncentration på 100 mmol /l, og opbevares i mørke ved -20 ° C. Fig. 1 viser den kemiske strukturformel af baicalein. De endelige baicalein koncentrationer anvendt til de forskellige eksperimenter blev fremstillet ved fortynding af stamopløsningen med høj-glucose DMEM eller RPMI1640. Antistofferne anvendt til Western blotting var som følger: kanin anti-caspase-3, anti-Bcl-2, anti-Bax, anti-PARP, anti-p53, anti-cyclinA, anti-cyclinB1, anti-cyclinD1, anti-MMP2 , anti-MMP9, anti-ZFX og muse-anti-β-actin. Alle antistoffer blev købt fra Cell Signaling Technology.

Den molekylære formel for baicalein er C15H10O5and sin molekylvægt er 270,24.

3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl ) -2, blev 5 diphenyl tetrazolium (MTT) assay

Drug følsomhed bestemt ved anvendelse af MTT-assayet. Kort fortalt blev cellerne trypsineret og udpladet i plader med 96 brønde (Corning, USA) ved en densitet på 5 x 10

3 celler pr. Cellerne blev dyrket natten over og derefter genopfyldes med frisk medium indeholdende forskellige koncentrationer (0, 15, 30, 60, 120 og 240 pmol /L) af baicalein for 24, 48 og 72 timer. Derefter 20 pi MTT (Sigma-Aldrich) opløst i PBS ved 5 mg /ml blev tilsat direkte til alle brøndene, og pladerne blev inkuberet i 4 timer ved 37 ° C. Formazankrystallerne der blev dannet, blev opløst i 100 pi DMSO efter fjernelse af supernatanten. Den optiske densitet blev optaget ved 490 nm på en mikropladelæser (Bio-Tek, USA). Resultaterne repræsenterer gennemsnittet af 3 uafhængige forsøg udført over flere dage. Procentdelen af ​​cellelevedygtighed blev beregnet som følger:

Kolonidannelseseffektivitet assay

Celler i den logaritmiske vækstfase blev fordøjet i en enkelt-cellesuspension med en trypsin-EDTA (Gibco, USA) -opløsning og derefter 2 ml af cellesuspensionen blev podet på plader med 6 brønde (Corning, USA) ved en densitet på 200 celler /ml. Efter adhærens, blev cellerne behandlet med baicalein (0,6,12, og 24μmol /L) i 48 timer og derefter dyrket i 15 dage. Derefter blev cellerne fikseret med 10% formalin og farvet med 0,1% krystalviolet (Sigma-Aldrich). Efter vask blev pladerne lufttørret og digitale billeder blev taget af farvede enkelte kloner observeret under et mikroskop (Leica, Tyskland). Resultaterne repræsenterer gennemsnittet af 3 uafhængige forsøg udført over flere dage.

Cell cyklus analyse

Celler blev behandlet med baicalein (0,30,60 og 120μmol /L) i 48 timer. Derefter blev cellerne opsamlet og fikseret med kold 70% ethanol og opbevaret ved -20 ° C. Cellerne blev derefter vasket og resuspenderet i kold PBS og inkuberet ved 37 ° C i 30 minutter med 10 mg /ml RNase og 1 mg /ml propidiumiodid (Sigma-Aldrich). DNA-indhold blev udført ved flowcytometri (BD, San Diego, USA). Procentdelen af ​​celler i de forskellige cellecyklusfaser blev bestemt under anvendelse af Cell Quest erhvervelse software (BD Biosciences).

Flowcytometrianalyse af celleapoptose

annexin V /propidiumiodid blev udført ifølge producentens anbefalinger (Invitrogen, USA). Kort beskrevet blev celler udpladet i plader med 6 brønde (Corning, USA) og inkuberet i 48 timer med baicalein (0,30,60, og 120μmol /l). Kort fortalt blev cellerne opsamlet og blev derefter vasket med kold PBS, centrifugeret, resuspenderet i 100 ul bindingsbuffer indeholdende 2.5ul FITCconjugatedannexin-V og 1UL 100 ug /ml PI og inkuberet i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke. I alt mindst 10 000 arrangementer blev indsamlet og analyseret ved flowcytometri (BD, San Diego, USA).

Påvisning af morfologisk apoptose med Hoechst 33342 farvning

Efter behandling med baicalein (0 , 30,60, og 120μmol /L) i 48 timer blev GBC-SD-celler vasket med PBS og fikseret med methanol: eddikesyre (3: 1) i 15 minutter ved stuetemperatur. Fikserede celler blev vasket med PBS og farvet med 5 pg /ml Hoechst 33342 farve i 10 minutter. Ændringer i kernerne i celler efter farvning med Hoechst 33342 blev observeret ved anvendelse af et fluorescensmikroskop (Leica, Tyskland).

Cell migration og invasion

GBC-SD3 × 10

4-celler og SGC996 1 × 10

5-celler blev anbragt på den ikke-coatede membran i øverste kammer (Corning, USA). Celler blev udpladet i medium uden serum. Medium indeholdende 10% FBS blev anbragt i det nedre kammer til at virke som en kemoattraktant. Efter adhærens blev celler behandlet med forskellige koncentrationer af baicalein (0, 7,5, 15, 30, 60 pmol /L) i serum-frit medium. Cellerne blev inkuberet i 24 timer; celler, som ikke invaderer gennem porerne blev fjernet under anvendelse af en vatpind. Celler migrerer gennem 8,0 um polycarbonatmembraner til den nedre overflade blev fikseret med 10% methanol og farvet med 0,1% krystalviolet. Migrerende celler blev kvantificeret ved at tælle farvede celler under et mikroskop (× 200) i fem tilfældige felter for hver brønd. Hvert eksperiment blev udført tre gange. Invasion assays blev udført på en måde svarende til migrationen assays, bortset fra at inserter blev forud belagt med Matrigel (BD, USA).

In vitro sårheling assay Salg

GBC-SD-celler blev dyrket i 6-brønds plader ved en densitet på 1,5 × 10

5 /ml og dyrket til konfluens. Sår blev skabt ved at skrabe sammenflydende cellemonolag med en pipettespids. Celler blev skyllet grundigt med medium for at fjerne cellerester før behandling med forskellige koncentrationer (0, 7,5, 15 og 30μmol /L) af baicalein i FBS frataget tilstand. Cellerne fik lov til at migrere i 24 blev taget med inverteret mikroskop (Leica, Tyskland).

h og billeder af de migrerede celler revers transkription og kvantitativ real-time polymerasekædereaktion (qPCR)

Kvantitativ PCR blev anvendt til at kvantificere ekspressionen af ​​mRNA i de eksperimentelle grupper. Kort fortalt blev GBC-celler behandlet med baicalein (15, 30, 60 og 120 pmol /l) i 48 timer. Totalt RNA blev isoleret under anvendelse af RNA let (Invitrogen, USA). Første streng cDNA blev syntetiseret fra 500 ng total RNA under anvendelse af en PrimeScript revers transkriptase (Takara, Japan). Kvantitativ realtids-PCR blev udført i et reaktionsvolumen på 20 pi herunder 2 pi cDNA. Primersekvenserne var som følger: MMP9 (fremadrettede 5′-TGT ACC GCT ATG GTT ACA CTC G-3 ‘, revers-5′-GGC AGG GAC AGT TGC TTC T-3′), MMP2 (fremadrettede 5′ AAC TAC GAT GAT GAC CGC AAG «reverse-5′-GAC AGA CGG AAG TTC TTG GTG -3), ZFX (frem-5’-TGT GGA GTG TGG TAA GGG TTT T ‘; reverse-5′-ACT GGT GTG TTT TGC TTT CTT G -3), og GAPDH (fremad-5’-AAG CTC ATT TCC TGG TAT GACA-3 ‘, omvendt-5′-TCT TAC TCC TTG GAG GCC ATGT-3’). PCR-betingelser var som følger: 95 ° C i 30 sek, efterfulgt af 40 cyklusser ved 95 ° C i 5 sek, 60 ° C i 34 sek. Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) blev anvendt som en intern reference gen at normalisere ekspressionen af ​​apoptotiske gener. Relativ kvantificering af apoptose-relaterede gener blev analyseret ved den sammenlignende tærskelcyklus (Ct) metode. For hver prøve blev Ct værdien af ​​den apoptotiske gen normaliseret ved hjælp af formlen: ACt = Ct (apoptotiske gener) – Ct (GAPDH). For at bestemme de relative ekspressionsniveauer blev den følgende formel anvendt: ΔΔCt = ACt (behandlet) – ACt (kontrol). Værdien blev anvendt til at plotte ekspressionen af ​​apoptotiske gener ved anvendelse af formlen 2-ΔΔCt.

Western blot-analyse

Celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af baicalein (0, 15, 30, 60 og 120 pmol /l) i 48 timer og derefter lyseret i en prøvebuffer, efterfulgt af denaturering. Den samlede proteinkoncentration celleekstrakterne blev bestemt under anvendelse af bicinchoninsyre assaysystem (Beyotime, Kina) med BSA som en standard. Lige mængder (80 ug protein per bane) af totale proteiner blev separeret ved SDS-PAGE (8%, 12% geler) under reducerende betingelser. Proteinerne blev dernæst elektroforetisk overført til nitrocellulosemembraner. Membranerne blev blokeret med 5% skummetmælk og inkuberes withanti-caspase-3, anti-Bcl-2, anti-Bax, anti-PARP, anti-p53, anti-cyclinA, anti-cyclinB1, anti-cyclinD1, anti- MMP2, anti-MMP9, anti-ZFX antistoffer, henholdsvis (1: 1000; Cell Signaling Technology) ved 4 ° C natten over. Dette blev efterfulgt af en inkubation med gede-anti-kanin /anti-muse-sekundært antistof konjugeret med peberrodsperoxidase (1: 5000; Abcam). Et lige belastning af hver bane blev vurderet ved immunoblotting de samme membraner med p-actin-antistoffer efter frigørelsen af ​​tidligere primære antistoffer. Fotografier blev taget og de optiske tætheder af båndene blev scannet og kvantificeret med Gel Doc 2000 (BioRad, USA).

In vivo tumor xenograft undersøgelse

Seks uger gammel mand atymiske, nøgne mus (med en indledende kropsvægt på 20-22 g) blev opnået fra Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd (Shanghai, Kina) og opstaldet under patogenfrie betingelser med kontrolleret temperatur (22 ° C), fugtighed, og en 12 timer lys /mørke-cyklus. Føde og vand blev givet ad libitum under hele forsøget. SGC996 celler blev anvendt til tumorxenografter og dyrkes i kultur og derefter løsgøres ved trypsinisering, vasket og resuspenderet i serumfrit RPMI1640. Hver af den athymiske nøgne mus blev subkutant injiceret på 1 × 10

6 celler ina volumen 100 ul i højre flanke område at initiere tumorvækst. Efter SGC996 podning blev mus randomiseret til to grupper (5 mus /gruppe). En gruppe blev behandlet med vehikel (10% DMSO og 90% propylenglycol) intraperitonealt, og den anden gruppe received0.4mg /mus baicalein intraperitonealt til 9 gange. På 21th dag blev dyrene aflivet, og tumorvævet blev fjernet og vejet.

Statistisk analyse

Alle værdier er udtrykt som middelværdi ± SD og de blev analyseret ved den studerendes

t

-test hjælp SPSS-version 13.0 software. En

s

-værdi på mindre end 0,05 blev betragtet som signifikant.

Resultater

Effekt af baicalein levedygtighed og apoptose af galdeblæren carcinomceller in vitro og in vivo

virkningerne af baicalein på væksten af ​​humane GBC-SD og SGC996, to mest anvendte cellelinier af galdeblæren kræft,

in vitro

blev testet. Som vist i fig. 2 (A), efter behandling i 24, 48 og 72 timer, baicalein inducerede en dosis- og en tidsafhængig nedgang i levedygtighed både GBC-SD og SGC996 celler, som analyseret ved MTT-assayet. Som vist i fig. 2 (B) (C), evne til GBC-SD og SGC996 celler til at danne kolonier i nærværelse af baicalein blev påvist med den flade plade kolonidannelse assayet. Kolonien optælling viste, at baicalein havde inducerede en dosisafhængig reduktion i kolonidannelse evne. Resultaterne understøtter det faktum, at baicalein kan udøve en betydelig indflydelse på GBC-SD og SGC996 celler spredning. For yderligere at bekræfte virkningen af ​​baicalein

in vivo

testede vi tumorigeniciteten af ​​galdeblæren carcinomceller under anvendelse nøgne mus tumor xenograft undersøgelse. Som vist i fig. 2 (D), tumorstørrelsen i gruppen af ​​baicalein behandling var mindre end den for kontrolgruppen.

(A) GBC-SD og SGC996 celler blev behandlet med varierende koncentrationer af baicalein, og celleproliferationen var bestemt ved MTT-assay på dag 1, 2, og 3. Hver værdi repræsenterer middelværdien ± SD (n = 3). (B og C) baicalein undertrykt kolonidannelse af GBC-SD og SGC996 celler. Celler blev behandlet med baicalein (6, 12, og 24 pmol /L) og fik lov til at danne kolonier i frisk medium i 14 dage. Indflydelsen af ​​kolonier (gennemsnit ± SD, n = 3) i kolonidannelse er vist. (D) baicalein-behandlede xenotransplantattumorer var meget mindre end kontroltumorer. (E) Vægten af ​​tumorer afslørede, at xenograft tumorvækst i nøgne mus var signifikant langsommere i baicalein-behandlede nøgne tumorer end kontroltumorer. De viste resultater er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg. * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001.

For at vurdere, om baicalein påvirker cellecyklusprogression, flowcytometrisk analyse blev udført. Resultaterne viste en signifikant reduktion i antallet af celler i den proliferative G0 /G1-fasen og en betydelig stigning i antallet af celler i S-fasen, efter 48 timers behandling med baicalein (fig. 3 (A)). CyclinA, et G1 /S overgangen fremme protein, blev dosisafhængigt forøget med baicalein behandling. Det kan være grunden til S fasen induceret af baicalein. CyclinB1 og cyclinD1 som repræsenterer S /G2 og M /G1 overgangsproces fik henholdsvis dosisafhængigt faldet med baicalein behandling (fig. 3 (B) og S5 Fig.). Disse resultater indikerer, at baicalein anholdelser cellecyklussen på S-fasen.

(A) Celler blev behandlet med 30, 60 eller 120 pmol /L baicalein i 48 timer, og DNA-indholdet blev analyseret ved flowcytometri. Procentdelen af ​​celler i G1, /vises S og G2 M-faser af cellecyklus. Disse resultater var fra 1 repræsentativt eksperiment af 3 uafhængige forsøg. (B) Ekspression af cyklin B og cyklin D i GBC-SD celler og cyklin A og cyklin D i SGC996 celler blev ændret markant efter behandling med baicalein sammenlignet med kontrol. De viste resultater er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg. * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001.

For yderligere at bekræfte disse resultater, vi evaluerede effekten af ​​baicalein på apoptose i GBC-SD og SGC996 celler ved hjælp af annexin V-FITC og propidiumiodidfarvning. Som bedømt ved flowcytometri og vist i fig. 4 (B), en markant dosisafhængig stigning i både de tidlige og sene stadier af apoptose var indlysende i GBC-SD og SGC996 celler efter baicalein behandling sammenlignet med kontrolceller. Salg

(A) Apoptotiske morfologiske ændringer såsom som abnorm cellekernemorfologi, reduktion i celleantal med apoptotisk legemers dannelse og celle krympning, induceret af baicalein (30,60 og 120 pmol /l) behandling i 48 timer, blev observeret af Hoechst 33342-farvning i GBC-SD og SGC996 cellelinier . (B) Celler blev inkuberet med baicalein (30,60 og 120 pmol /l) i 48 timer, efterfulgt af farvning med annexin-V /PI. Celle apoptose blev estimeret ved flowcytometri. (C) baicalein inducerer aktiveringen af ​​apoptose-relaterede proteiner i GBC-SD og SGC996 celler. Efter behandling med baicalein (0, 15, 30, 60, og 120μmol /L) i 48 timer blev cellelysater fremstillet og western blot-analyse blev udført mod Bcl-2, Bax, pro-caspase-3, P53 og PARP. p-actin blev anvendt som en loading kontrol. De viste resultater er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg. * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001.

Morfologiske ændringer i de apoptotiske celler blev afsløret af Hoechst 33342-farvning, som vist i fig. 4 (A). I den ubehandlede GBC-SD og SGC996 celler, blev kernerne farves svagt homogen blå, hvorimod i gruppen behandlet med baicalein, lyse chromatinkondensation og nuklear fragmentering blev observeret.

Virkning af baicalein på apoptose faktorer

for at identificere, hvilke proteiner var hovedsageligt involveret i baicalein-inducerede apoptotiske proces, vi analyseret en række apoptose faktorer ved western blot. Som illustreret i fig. 4 (C), pro-caspase-3 og P53 blev nedreguleret ved baicalein behandling. Spaltet PARP blev væsentligt forøget. Proteinniveau af Bax var opreguleret, mens proteinniveauet af Bcl-2 var faldet betydeligt.

Virkning af baicalein på metastase af galdeblæren carcinomaceller

Siden galdeblæren carcinoma cellemigration og invasion er forbundet med metastase, anvendte vi forskellige cellulære assays til at evaluere virkningen af ​​baicalein på metastatiske potentiale galdeblæren carcinomceller. For at undersøge effekten af ​​baicalein på cancercelle mobilitet, udførte vi migration assay under anvendelse af GBC-SD og SGC996 celler. Som vist i fig. 5 (A), blev den cellulære migration inhiberet af baicalein behandling. Endvidere udførte vi sårheling assay til yderligere at bekræfte inhibering virkning baicalein på cellemigrering. Som vist i fig. 5 (C), baicalein påfaldende inhiberede GBC-SD-migration på en dosis-afhængig måde. For yderligere at undersøge, om den invasive aktivitet blev påvirket i afhængighed baicalein undersøgte vi invasiv aktivitet under anvendelse af en matrigel belagt membran. Resultaterne viste, at baicalein dramatisk reduceret antallet af invaderede celler og denne inhibering forekom på en koncentrationsafhængig måde (fig. 5 (B)). Desuden blev spredning og metastase evner yderligere forstærket i celler behandlet med både siRNA mod ZFX og baicalein (S4 Fig.).

Celler blev behandlet med 7,5, 15, 30 og 60μmol /L baicalein forudgående 12 timer til migration (a) eller invasion (B) assay. (C) cellemonolag blev såret ved at skrabe med en 200 pi pipettespids. Besættelsen område i GBC-SD cellemonolag behandlet med baicalein var dosisafhængig faldt 24 timer efter bunden. Baicalein påvirker ekspressionen af ​​matrix metallopeptidaser (MMP’er). (D) Den mRNA-ekspression af MMP-2 og MMP-9 blev detekteret ved qPCR efter behandling med baicalein i 48 timer. (E) Proteinet ekspression af MMP-2 og MMP-9 blev påvist ved Western blot efter behandling med baicalein i 48 timer. De viste resultater er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg. * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001.

MMP’er er kendt for at være afgørende for nedværdigende ekstracellulære matrix komponenter og for at fremme tumor cellulære invasion

in vitro

in vivo

. Efter behandling med forskellige koncentrationer af baicalein i 48 timer i GBC-SD og SGC996 celler, kvantitativ realtids-PCR og Western blot-analyse viste, at mRNA og protein ekspression af MMP-9 og MMP-2 betydeligt faldt sammenlignet med kontrolgruppen i en dosisafhængig måde (figur 5 (D . B)) faldt med baicalein behandling i GBC-SD og SGC996 celler og translokationen af ​​ZFX i kerner blev undertrykt ved baicalein behandling (S2 fig.). Effekten af ​​baicalein på ZFX udtryk var specifik, fordi udtrykket niveau af NF-KB og STAT3 ikke blev berørt af dette molekyle (S1 Fig.).

(A og B) ZFX udtryk i GBC-SD og SGC996 celler induceret af baicalein. Celler blev behandlet med 0, 15, 30, 60 og 120 pmol /L baicalein i 48 timer, derefter proteinet og mRNA-ekspression niveau af ZFX blev bestemt ved Western blot (A) og qPCR (B). (C og D) Celler blev transficeret med ZFX-GFP-plasmidet og GFP plasmid hhv. 72 timer efter transfektion blev celler behandlet med 0, 7,5, 15, 30 og 60 pmol /L baicalein i 72 timer. ZFX-GFP blokeret signifikant inhibering af proliferation af GBC-SD-celler ved baicalein under anvendelse MTT assay (C). ZFX-GFP blokeret signifikant induktion af apoptose af GBC-SD celler ved baicalein anslået af flowcytometri (D). (E og F) 72 timer efter transfektion blev cellerne behandlet med 60 pmol /L baicalein i 24 timer. ZFX-GFP betydeligt blokerede anti-migration og invasion effekt af GBC-SD celler ved baicalein. migration Cellen blev estimeret ved sårheling assay (E) og celleinvasion blev estimeret ved transwell assay (F). (G) ZFX-GFP forhindrede ekspressionen af ​​PARP, inhibering af MMP2, MMP9 og opreguleret forholdet Bcl2 /Bax som reaktion på baicalein. 72 timer efter transfektion blev cellerne behandlet med 60 pmol /L baicalein for 48h.The proteinniveauer af PARP, MMP-2, MMP-9, Bcl2, Bax og ZFX blev bestemt ved Western blot. De viste resultater er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg. * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001.

Overekspression af ZFX lettet levedygtighed, apoptose og metastase effekt af baicalein i GBC-SD celler

Desuden overekspression af ZFX (S3 Fig.) Resulterede i delvis blokering af baicalein induceret proliferation og apoptose i GBC-SD-celler (figur 6 (C) . (D)). Følgelig blev inhiberingen af ​​migration (fig. 6E) og invasion (fig. 6F) evner af celler ved baicalein bemærkelsesværdigt vendes ved overekspression af ZFX. På den anden side, overekspression af ZFX spænder inhiberes baicalein induceret aktivering af PARP og øget forholdet Bcl2 /Bax. Endvidere overekspressionen af ​​ZFX resulterede også i blokering af baicalein induceret hæmning af MMP-2 og MMP-9 (fig. 6 (G)). Således data antydede, at ZFX protein kunne deltage i baicalein-induceret celle apoptose og anti-metastaser i galdeblæren carcinomceller.

Diskussion

Vores undersøgelse giver nogle nye oplysninger om baicalein anvendes i anticancerterapi. Den anti-cancer virkning baicalein er blevet bekræftet i mange andre kræftformer, men anti-spredning og metastatisk virkning og den tilhørende mekanisme (r) i GBC celler er ikke klart. Her har vi vist de biokemiske og molekylære mekanismer i apoptose og anti-metastatisk induktion af baicalein.

For det første fandt vi, at baicalein kan spille en vigtig rolle i GBC celleproliferation, cellecyklus og apoptose

i vitro

in vivo

. Behandling med baicalein resulterede i et markant fald i levedygtighed dyrkede GBC-SD og SGC996 celler og i antallet af kolonier, at disse celler er dannet. Til vores viden, er dette den første undersøgelse for at vurdere potentielle rolle baicalein på

in vivo

xenograft dyremodel. Signifikant reduktion af tumormasse blev observeret efter en 3-ugers behandling.

in vivo

effekt af baicalein på GBC tumorer støtter stærkt baicalein som en potentiel nyt lægemiddel til anti-GBC behandling.

Effekten af ​​baicalein på cellecyklus arrest og induktion af apoptose i GBC celler blev også evalueret. De antitumorvirkninger af baicalein mentes at blive brugt ved at påvirke standsning i cellecyklus eller ved at interagere med cellecyklus-relaterede proteiner [31]. I vores undersøgelse, baicalein også inducerede S-fase cellecyklusstandsning og inhibering af cyclin B1, cyclin D1, fremme af cyclin A i GBC-SD og SGC996 celler. Da apoptose betragtes som en vigtig mekanisme til inhibering af cancer, udførte vi hoechst33342 farvning assay annexin V /PI assay og detektion af apoptose relateret protein ekspression til yderligere at udforske den mekanisme af baicalein-induceret apoptose. Baicalein bemærkelsesværdigt inducerede apoptose af både GBC-SD og SGC996 celler, som påvist ved ændringer i nuklear morfologi, en stigning i procentdelen af ​​Annexin V-farvning af celler, der blev yderligere bekræftet ved forøget ekspression af spaltning af pro-caspase-3, kløvning af PARP, Bax og reduceret ekspression af Bcl-2 og P53. Mange af disse gener er relateret til den mitokondriske apoptotiske vej. Spaltning af pro-caspase-3, spaltning af PARP og i sidste ende nedbrydning af DNA. Bax og Bcl-2-proteiner, som regulerer den væsentlige ændring i mitochondriemembranpermeabilitet for apoptose [32]. Ud fra disse data kan det konkluderes, at baicalein induceret GBC celle apoptose ved at aktivere den indre mitokondrielle pathway.

Udover celleproliferation, migration og invasive kapacitet af celler er også to af de vigtigste funktioner i maligne celle adfærd. For at belyse virkningen af ​​baicalein på cellemotilitet blev cellevandring og invasionsevne bestemt ved en sårhelende migration assay og Transwell assay hhv. Ud fra disse data, fandt vi, at baicalein kunne undertrykke migration og invasion evne GBC-SD og SGC996 celler. MMP’er er et stærkt reguleret superfamilie af zink afhængige endopeptidaser, der er kausalt forbundet med udvikling og progression af tumorer [33].