PLoS ONE: Dynamics mellem kræft cellesubpopulationer afslører en model Koordinering med Både Hierarkisk og Stochastic Concepts

Abstrakt

Tumorer er ofte heterogene, hvor tumorceller af forskellige fænotyper har forskellige egenskaber. For videnskabelige og kliniske interesser, er det af afgørende betydning for at forstå deres egenskaber og de dynamiske variationer mellem forskellige fænotyper, specielt under radio- og /eller kemoterapi. I øjeblikket er der to kontroversielle modeller, der beskriver tumor heterogenitet, kræft stamceller (CSC) model og stokastisk model. For at tydeliggøre den kontrovers, vi målte sandsynligheder for forskellige division typer og overgange af celler via

in situ

immunofluorescens. Baseret på eksperiment data, vi konstrueret en model, der kombinerer CSC med stokastiske begreber, som viser, at der findes både særprægede CSC subpopulationer og de stokastiske overgange fra NSCCs til CSCS. Resultaterne viste, at de dynamiske variationer mellem CSCS og ikke-stamceller cancerceller (NSCCs) kan simuleres med modellen. Yderligere undersøgelser viste også, at modellen kan anvendes til at beskrive dynamikken af ​​de to subpopulationer efter strålebehandling. Endnu vigtigere er, viste analysen, at den eksperimentelle påviselige ligevægt CSC andel kun kan opnås, når de stokastiske overgange fra NSCCs til CSCS forekomme, hvilket indikerer, at tumor heterogenitet kan eksistere i en model, koordinere med både CSC og stokastiske begreber. Den matematisk model baseret på eksperimentelle parametre kan bidrage til en bedre forståelse af tumor heterogenitet, og give referencer på dynamikken i CSC delpopulation under strålebehandling

Henvisning:. Wang W, Quan Y, Fu Q, Liu Y, Liang Y, Wu, J., et al. (2014) Dynamics mellem Cancer cellesubpopulationer afslører en model Koordinering med både Hierarkiske og Stokastiske begreber. PLoS ONE 9 (1): e84654. doi: 10,1371 /journal.pone.0084654

Redaktør: Toru Hosoda, Tokai University, Japan

Modtaget: Juni 29, 2013; Accepteret: November 18, 2013; Udgivet: 9 Jan 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Key projekt af National Natural Science Foundation of China (10935009), National Science Foundation for Young Scholars i Kina (31000383) og National Grand instrument Program (2012YQ030142). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

tumorer er ofte heterogene hvor der findes enkelte tumorceller i forskellige fænotyper med distinkte funktionelle egenskaber [1]. Klinisk, tumorer fra forskellige patienter, uanset om leukæmiske eller fast, ofte udviser betydelig heterogenitet i form af morfologi, celleoverflademarkører, genetiske læsioner, celleproliferation kinetik, og respons på behandling [2]. Det er derfor af afgørende betydning for at forstå den molekylære og cellulære grundlag af heterogenitet. I øjeblikket er der to kontroversielle modeller, der beskriver den heterogenitet i tumor, CSC modellen og stokastisk model. CSC model, også kendt som hierarkiet model, tyder på, at væksten og udviklingen af ​​mange cancere er drevet af små men karakteristiske subpopulationer af CSCS, og tumoren er en karikatur af normalt væv udvikling, hvor stamcellerne opretholde normale væv hierarkier [3] . De CSCS på spidsen af ​​hierarkisk struktur kan ikke kun holde sig ved selv-fornyelse, men også differentierer til NSCCs. I modsætning hertil stokastisk model, også kendt som klonal evolution model, forudsiger, at en tumor er biologisk homogen og opførslen af ​​cancercellerne tilfældigt påvirket af uforudsete iboende og /eller ydre faktorer [3].

to modeller fremkaldte store interesser i både eksperimentelle og teoretiske studier. I eksperimentelle undersøgelser, selv om den mekanisme af tumor heterogenitet er stadig uklart, der er stærke beviser for, at kræft er en cellulær hierarki med CSCS på spidsen [2], [4] – [7], hvilket indikerer, at kræftbehandling kan kræve fjernelse af CSCS [4], [8]. Disse papirer støttede CSC modellen og fremkaldte nye strategier på at målrette CSCS til behandling af kræft [2], [4] – [7]. viste imidlertid, flere andre papirer, den fænotypiske plasticitet inden tumorer kan producere tovejs inter-konvertering mellem CSCS og NSCCs, hvilket resulterer i en dynamisk variation i den relative forekomst af CSCS [1], [9] – [11]. Vesuna

et al

fandt, at forbigående ekspression af

Twist

kan inducere stamceller fænotype i flere bryst-cellelinjer, og at faldende

Twist

udtryk delvist vender den molekylære signatur stamcelle [12]. Morel

et al

rapporterede, at bryst CSCS kan genereres gennem EMT kaskade [13]. Liang

et al

foreslog, at CSCS er inducerbare ved at øge genomisk ustabilitet i cancerceller [14]. Interessant efterrensersold

et al

rapporteret, at normale og neoplastiske ikke-stamceller spontant kan konvertere til en stilk-lignende tilstand [9]. Vigtigere, Iliopoulos

et al

rapporterede, at bryst CSCS kan induceres fra NSCCs via IL6 sekretion og de to cellepopulationer kan nå dynamisk [1] ligevægt. For nylig Gupta

et al

beskrevet en model, der fænotypisk ligevægt i populationer af kræftceller opnås via stokastiske tilstandsovergange [10]. Vores tidligere undersøgelser viste også

situ

overgange og fænotype dynamisk ligevægt mellem CSCS og NSCCs, enten med eller uden strålebehandling [11]. I

I teoretiske studier, hot debat også er blevet stimuleret blandt forskellige papirer. Beretta

et al

analyseret asymptotiske opførsel af CSC andel og tilfældet, når der ikke er nogen overgange fra ikke-stammen at dæmme celle [15], der viser stabilitet CSCS procentdel i en matematisk måde. Gupta

et al

udviklet en Markov-model til at forklare det fænomen, at en renset fænotype subpopulation endelig returnerer til ligevægt fænotypiske proportioner på den betingelse, at transit celler stokastisk blandt forskellige tilstande [10]. Denne model forudsiger, at ikke-stamceller som basal og luminal har en ikke-nul sandsynlighed for at blive stilk-lignende tilstand. Zapperi

et al

analyserede slags matematiske modeller og foreslog, at ufuldkommen sortering kunne være et alternativ forklaring på den “rensede” delpopulation vender tilbage til ligevægt proportioner [16].

CSC-modellen og den stokastiske model foreslår forskellige kliniske strategier tumorterapi. I øjeblikket, det haster ligger i, hvordan at forbedre begge modeller for at få en bedre forståelse af tumor heterogenitet og de dynamiske variationer af forskellige subpopulationer, specielt de CSCS og NSCCs i tumor. Vi konstrueret en matematisk model baseret på målte parametre fra forsøg, specielt de typer og satser for divisioner og overgange. Resultaterne viste, at de eksperimentelle dynamik mellem CSC og NSCC subpopulationer kan simuleres via modellen, enten med eller uden strålebehandling. Yderligere analyse viste, at den eksperimentelle påviselige ligevægt CSC andel kan kun opnås, når de stokastiske overgange fra NSCCs til CSCS opstår, hvilket tyder på tumor heterogenitet kan eksistere i en model, koordinere med både CSC og stokastiske begreber.

ligninger og Forudsætninger

Tidligere undersøgelser antydet, at CD133-positive celler er potentialet CSCS delpopulation i SW620 humane colon celler [11], [17], [18]. Ved hjælp af

in situ

immunofluorescens blev division typer CSCS og NSCCs gennem overfladen markør ændringer analyseres. For CSCS blev begge symmetriske og asymmetriske divisioner fanget. Det vil sige, en CSC kan opdele i to CSCS (selvfornyelse), to NSCCs (differentiering) samt en CSC og en NSCC (asymmetrisk division) (fig. 1A). For NSCCs, blev kun den symmetriske division type (proliferation) fanget, det er, er en NSCC deler sig i to NSCCs. Vigtigere er det, der er karakteristiske fænotype overgange fra NSCC til CSC uafhængig af celle mitose (figur 1A).

(A). Typiske division typer CSCS /NSCCs og overgang fra NSCC til CSC. Scale bar lig 50 um. (A-b) Typisk

in situ

division type af et NSCC (hvid pil) og overgangen fra en NSCC til en CSC (gul pil); (C-d). Typisk

in situ

symmetriske afdelinger af CSCS: selvfornyelse (én CSC deler sig i to CSCS) og differentiering (One CSC deler sig i to NSCCs); NSCC (hvid pil), CSC (gul pil). (E-f). Typisk

in situ

asymmetrisk opdeling af CSC (One CSC kløft i én CSC og en NSCC); NSCC (hvid pil), CSC (gul pil). (jeg). Kinetiske ligninger, der svarer til de fænomener i a og b. (Ii) Kinetiske ligninger, der svarer til fænomener i c og d. (Iii) Kinetisk ligning, der svarer til fænomenet i e og f. (B). Ordningen af ​​model baseret på de eksperimentelle resultater

Større antagelser:..

Der er CSCS og NSCCs subpopulationer i SW620 humane colon cancerceller [11]

En CSC kan opdele symmetrisk i to CSCS (selvfornyelse) eller to NSCCs (differentiering) med sandsynlighed

P

S

eller

P

D

(fig. 1A) . Desuden kan en CSC opdele asymmetrisk i en CSC og en NSCC med sandsynlighed

P

A

(

P

A

= 1-

P

S

–

P

D

) (figur 1A). Forskellige CSC division typer har samme mitose hastighed angivet med

K

C

.

En NSCC kan opdele i to NSCCs (spredning) med hastighed på

K

N Hotel (figur 1A).

en NSCC kan konvertere til en CSC med hastighed på

K

T Hotel (fig. 1A) [11].

NSCC har begrænset formere potentiale og kunne gå gennem ældning med levetid på

M

generation [19], [20].

M

th

generation dør med en hastighed på

d

(fig. 1B). Værdien af ​​

d

og

M

simpelthen sat til at være 1 og 50 som foreslået tidligere [21].

Den skematiske af modellen er vist i fig. 1B. Ifølge de antagelser, der er anført ovenfor, kan dynamikken mellem CSCS og NSCCs blive beskrevet med ordinære differentialligninger (ODE) (ligning (1)). I ODE’er, finder vi, at

P

S, P

D

og

P

A

vises i visse kombinationer. Så disse tre parametre kunne indarbejdes i en parameter. (1)

C

angiver antallet af CSCS og

N

jeg

betegne antallet af NSCCs;

i = 1, 2,

…,

M

.

Det er velkendt, at strålebehandling kan forårsage en masse skader i celler, blandt hvilke DNA dobbelt strengebrud (DSBs) er de mest giftige [22]. Her tilføjer vi dødelighed korreleret med DSBs dynamik ind i vores model, når cellerne blev bestrålet. Efter stråling, antallet af DSBs hurtigt øget, og mættet i de bestrålede celler [23], derefter faldt på grund af DNA-reparation. Derfor er baseret på DSBs ‘dynamik [24], [25], kunne dødeligheden beskrives som

k

betegner DSBs produktion i gennemsnit pr dosis.

D

betegner dosis.

r

er reparation på DSBs,

r

C

r

N

repræsentere reparation på CSC og NSCC hhv.

m

står for dødbringende mis-reparation på pr DSB par. I nuværende model,

m

C

m

N

repræsenterer dødbringende mis-reparation satser CSC og NSCC henholdsvis (Detaljer kan findes i ligninger S1 i File S1) .

Resultater

Parametre målt via in situ eksperimenter

De sandsynligheder for CSCS ‘division typer og procentdelen af ​​overgang NSCCs blev bestemt ved hjælp af

in situ

immunfluorescens (fig. 1). For at være i overensstemmelse med eksperiment resultater af populationsdynamik, vi skønnede

K

T

,

K

N

K

C

ved at beregne mængde ændring af sorterede CSCS og NSCCs og procentdelen af ​​NSCCs ‘overgang på én dag. Fordi CSCS og NSCCs ‘celle cykler er begge cirka en dag, opdelingen af ​​nyfødte NSCCs i sorterede CSCS befolkning bidrager lidt til kvantitet ændring i en dag, og opdelingen af ​​nye CSCS i sorterede NSCCs er ikke signifikante (ligninger, der anvendes i forbindelse med vurdering er vist i ligning S2 i File S1). Værdierne af disse parametre er vist i tabel 1.

Efter strålebehandling, er gennemsnittet af DSB produktion i en celle rapporteret at være 25-35 /Gy [26]. Og

r

beregnes ud fra halveringstiden for DSBs eller foci og dens størrelsesorden er ca. 10 /dag [23], [27]. Da CSC har højere evne til at reparere DNA-skader [28], den antagelse, at

r

C

r

N

er lavet. Her sætter vi

r

N

= 10 og

r

C

= 15. overlevelse fraktioner (

S

) i CSCS (

S

C

) og NSCCs (

S

N

) under 2 Gy strålebehandling måles fra forsøgene. Derfor er den dødelige mis-reparation på CSCS (

m

C

) og NSCCs (

m

N

) kan beregnes ved følgende ligning (ligning (2)) , (2)

Som vist i tabel 2, at værdien af ​​

k

, D,

r

N

,

r

C

,

S

C

,

S

N

,

m

C

m

N

er 25, 2, 10, 15, 95,0%, 43,0%, 0,0012 og 0,0092 hhv.

Simulering af langsigtede dynamiske variationer mellem CSC og NSCC subpopulationer

på baggrund af parametre, analyserede vi derefter dynamikken i CSC andel (definerer som) under forskellige begyndelsesbetingelser via den matematiske model (simulering af celleantal variation er vist i tabel S1 i File S1 og fig. S1).

Teoretisk er det vist, at CSC andel sidst når en stabil værdi, uanset hvad begyndelsestilstanden er (fig. 2A). Sammenligning simulering resultater med eksperimentelle data, der tidligere er rapporteret [11], er det klart, at den stadige værdi beregnet ved denne model er tæt på de eksperimentelle resultater (Fig. 2B), hvilket viser parametre får fra

in situ

immunofluorescens kan forudsige tendens dynamikken mellem CSCS og NSCCs delpopulation (eksperiment data er vist i tabel S2-S3 i File S1). Desuden oprensede NSCCs og CSCS sorteret fra SW620-cellelinien ved FACS blev dyrket, og CSC proportioner på dag 26 efter inokulering blev testet. Som vist i fig. 2C, CSC andele af forskellige initiale kulturer nå samme konstante værdi, der er lig med CSC andel i usorterede SW620 celler.

(A). Diagram af eksperiment procedurer; (B). Sammenligning mellem simuleringsresultater og eksperiment resultater; (C). Eksperimentelle resultater af langsigtet ligevægt CSC proportioner fra indledende oprensede CSCS og NSCCs.

Parameter følsomhedsanalyse

Svarene fra CSC forhold til ændringen af ​​parametre ved ligevægt analyseres (parametre er vist i tabel 1). Regelmæssigt, er hver parameter forøges eller formindskes med en procent og ændringen af ​​CSC andel ved ligevægt beregnes som tidligere [29] rapporterede.

M

er et helt tal, så ændringen af ​​

M

er plus eller minus 1. Som vist i fig. S2, når

K

T

,

K

N

,

K

C

e

øges med 1 procent, ville CSC andel på ligevægten stige 0,3%, falde 0,5%, øges 0,2% og øge 1,1%. Blandt de parametre,

M

er en ufølsom parameter, som er sat til at være 50 som foreslået tidligere [21]. Ifølge beregninger,

M

er en ufølsom parameter i en lang række. Så valget af M værdi placerer ringe indflydelse på simulering af ligevægt. Andre følsomme parametre, herunder

e Hotel (

e

=

P

S

–

P

D

),

K

N

,

K

T

og

K

C

måles alle i forsøg

Test parametre og dynamikken mellem CSC og NSCC subpopulationer via cellulære automat metode

for yderligere at validere de parametre og dynamikken mellem CSCS og NSCCs, derefter studerede vi dynamikken mellem CSC og NSCC subpopulationer med parametrene via cellulære automat metode. Cellulær automat er baseret på adfærd individuel celle og interaktion mellem individer. Det er almindeligt anvendt til modellering flercellede biologiske systemer herunder tumor. Det kunne afspejle den diskrete ejendom tumor, som er forsømt i ODE metoden [30]. Ved at anvende celle automat metode, kan der opnås en bedre forståelse af, hvordan tumor vokser i mikroskopisk skala [31]. Da begrebet CSC kommer ud, der bruges cellulære automat metode til simulering af CSCS [32] – [36]

Beregningen ordningen findes i Fig.3A.. I hvert tidsskridt, A NSCC afgør, om at dø, eller om at forvandle sig til en CSC. NSCCs og CSCS fremskridt et skridt i deres celle cyklusserne. En celle vil dele sig i to celler, når den er færdig én cellecyklus. Hvis der ikke er ledig site for cellen at dele sig, ville det blive hvilende. Hvis der er plads til cellen at opdele i en CSC ville afgøre division typen tilfældigt; for en NSCC, ville det opdele og både datterceller “generationer stige med 1.

(A). Beregning ordning for cellulær automat metode. (B). Typisk resultat af simulering med cellulær automat fremgangsmåde (første betingelse er, at alle celler er NSCCs). Rød: CSC; Blå: NSCC; Sort: ledig gitter. (C). Sammenligning mellem simulation resultater med cellulær automat metode og eksperimentelle resultater.

Som vist i Fig.3C, med de parametre, viser simulationen sammenhæng med eksperimentet data og CSC andel fra hver gruppe også nået stabil værdi, hvilket yderligere indikerer de parametre, der er indsamlet fra forsøgene er pålidelige. Hertil kommer, at resultaterne af cellulære automat metode giver mere detaljerede oplysninger af dynamikken. I løbet af spredning, CSCS og NSCCs kan for det første danne kolonier, og udvid derefter rundt (Video S1-2). Endelig CSCS og NSCCs spredt ensartet over hele området. Det er muligt, at alle off-fjedre i en CSC eller en NSCC er CSCS og NSCCs i flere generationer. Hvis disse CSCS eller NSCCs forbinde med andre CSCS eller NSCCs henholdsvis de bliver aggregeringer i visse områder (3B).

Simulering af langsigtede dynamiske variationer mellem CSC og NSCC subpopulationer efter strålebehandling

De dynamiske variationer mellem CSCS og NSCCs efter strålebehandling er simuleret med flere andre parametre blev derefter udført (tabel 2) (simulering af celle nummer variation er vist i tabel S4 i File S1and fig. S3). Resultaterne viste, at modelsimuleringen giver en acceptabel forudsigelse af eksperimentelle resultater, som vi tidligere rapporteret [11]. Som vist i fig. 4B, kan CSC proportioner alle grupper fra forskellige indledende proportioner endelig nå samme konstant værdi som de sager uden stråling, hvilket indikerer kort sigt stråling kan ikke forstyrre den langsigtede dynamisk ligevægt mellem CSCS og NSCCs. Interessant nok i blandingen af ​​70% CSCS og 30% NSCCs gruppe, simulering viser, at CSC andel stiger i begyndelsen hurtigt og falder ned i to dage (fig. 4C). Dette er også i overensstemmelse med de eksperimentelle resultater, som vi tidligere rapporteret [11].

(A). Diagram af eksperiment procedurer med strålebehandling; (B). Sammenligning mellem simulation og eksperiment resultater i 0-24 dage (stråling anvendes, når t er 0 dage); (C). Amplified billede af resultaterne fra bestrålet 70% CSC-gruppe (0-2d) (stråling anvendes, når t er 0 dage).

Imperfect sortering kan ikke forklare den dynamiske ligevægt mellem NSCCs og CSCS

Den dynamiske ligevægt mellem CSCS og NSCCs er et interessant fænomen [1], [9] – [11]. Dette fænomen, som for nylig rapporteret af flere papirer, kan have stor indvirkning på forståelsen af ​​tumor heterogenitet samt kliniske terapi strategier [10]. Analyse af fænomenet viste også, at en stabil ligevægt CSC andel mellem 0 og 1 er let at opnå, hvis der eksisterer overgange fra NSCCs til CSCS (). Hvis

K

T

lig 0, eksisterer ikke-nul ligevægt CSC andel kun på den betingelse, at der er, netto spredning på CSCS er højere end for NSCCs (detaljer kan findes i diskussion S1 i File S1 og fig. S4), der er heller ikke tilfældet i vores eksperimenter og andre rapporter [2], [37].

En alternativ forklaring på dynamisk ligevægt foreslået af Zapperi

ET al

er, at dette fænomen kan skyldes den ufuldkomne sortering af cellerne via flowcytometri stedet for overgangene fra NSCCs til CSCS. Den ufuldkomne sortering er uundgåelig i forsøgene, hvilket resulterer i nogle celler i den forkerte gruppe som et mindretal (Fig.5A). Som vist i Discussion S1 i File S1,

(A). Diagram over sortering fejl i forsøgene; (B). Sammenligning mellem simulering (

K

T

= 0) og eksperimentere resultater.

R

er CSC andel i hele befolkningen.

Hvis

K

T

er 0,. Under situationen for ufuldkomne sortering,

R

er meget lav i sorteret NSCCs i begyndelsen. Så næsten lig med nul. Så stigningen i

R

vil være ubetydelig i de første mange dage. Ifølge vores eksperimentdata, er større end 0,1 i de første to dage. Hvis

R

er 0,02 i begyndelsen, bør være større end 5. Dette er imod eksperiment optegnelser om celleproliferation. Men hvis

K

T

ikke er 0, er omtrent lig med

K

T

i begyndelsen. Stigningen i

R

vil være mere tæt på vores eksperiment data.

For bedre at illustrere dette sandsynlighed, vi analyseret teoretisk i vores model med sortering fejl CSCS og NSCCs som

θ

procent (normalt

θ

≤2 i henhold til instruktionerne i flowcytometri). Hvis der ikke er overgange fra NSCCs til CSCS (

K

T

= 0), kan modellen ikke passer eksperimentelle data fra CSC andel dynamik erfaringer fra forsøg med

θ

. Simuleret udglødning algoritme bruges til at passe vores eksperiment data, hvis oprindelige tilstand er “renset” CSCS, fordi denne proces kunne opnås med

K

T

= 0. Derefter får vi 50 parameter kombinationer af

K

C

,

K

N

e

. Som vist i Fig.5B viste resultaterne, at selv om mindretal CSCS vil føre befolkningen til stabil ligevægt CSC andel og disse parametre passer eksperimentets data for oprensede CSCS præcist, kunne ingen af ​​disse parameterkombinationer passe eksperimentdata af rensede NSCCs godt. Som vist i Fig.5B, forskellene mellem simulation og eksperimentresultater ligge i tidsrummet for at nå ligevægt. Denne værdi er i høj grad afhængig af

M

. For således at få den kurve, der er den samme med eksperimentdata,

M

bør være omkring 5 eller derunder. Dette er naturligvis imod de eksperimentelle data [21], [38]. Derfor kan ufuldkomne sortering ikke forklare den dynamiske ligevægt mellem CSCS og NSCCs.

Diskussion

Tumor heterogenitet angiver vigtige konsekvenser for vellykkede behandlinger mod kræft [2]. I øjeblikket er der to modeller beskriver heterogenitet i tumor, den stokastiske og CSC-modeller. Den væsentligste forskel mellem dem er, at hver eneste celle eller nogle distinkte subset tumorceller har potentiale til at opføre sig som en [2] CSC. For at tydeliggøre de to begreber, vi startede fra CSC koncept med sortere CSC og NSCC subpopulationer og dyrkning dem separat. Så vi målte sandsynlighederne for CSCS ‘division typer og overgange for NSCCs via

in situ

immunofluorescens som beskrevet tidligere [11], [39], [40]. Baseret på de målte parametre fra forsøgene (fig. 1 og tabel 1), konstruerede vi en matematisk model koordinere med både CSC og stokastiske begreber. Resultaterne viste, at modellen kan simulere tendens eksperimentelle dynamik NSCC og CSC subpopulationer, enten med eller uden strålebehandling (fig.2 og fig. 4).

stokastisk model forudsiger, at en tumor er biologisk homogen og opførslen af ​​cancercellerne tilfældigt påvirket af uforudsete iboende og /eller ydre faktorer [3]. Men der var stigende beviser støttede eksistens CSCS i de seneste to årtier [4]. Traditionelt stokastiske modeller normalt definerer flere mutation fænotyper i tumor og overgangen satserne mellem disse fænotyper. Disse overgange er sædvanligvis ensrettet, fra godartede typer at invasive typer [41], [42]. Men vores

in situ

eksperimentelle resultater viste, at overgangene mellem CSCS og NSCCs er bestemt ikke ensrettede (figur 1A), I modsætning hertil NSCCs kan transit i CSCS uafhængige af celle mitose og CSCS kan generere NSCCs via differentiering samt asymmetriske division afhængig af celle mitose (figur 1A). Desuden genetisk ustabilitet er en af ​​de vigtigste regler i stokastisk model. Gennem akkumulerede genetiske eller epigenetiske ændringer, kan modtagelige fænotype bliver resistente fænotype. I perspektivet af kolonien, tumor udvikler sig til at blive mere resistente over for behandling [42].

Ikke desto mindre fremkomsten af ​​CSCS afslører, at CSCS er motoren i tumorvækst og modstanden til standard kemoterapi og radio- terapi [5] – [7], [43], der viser en mere organiseret hierarkisk struktur end den, som stokastisk model. CSC model foreslår, at vækst og progression af tumorer drives af små, men markante subpopulationer af CSCS [3]. Men flere nylige papirer og aktuelle eksperimenter klart fremgik af den

de novo

generation af CSCS fra NSCCs (Fig.1) [1], [9] – [11]. Overgangene fra NSCCs til CSCS indikerede, at CSC model er ikke nok til at forklare tumor heterogenitet og væsentlige støttet begrebet stokastisk model. Teoretisk set, hvis der ikke overgange fra NSCCs til CSCS (

K

T

= 0), vores model er blot tale om CSC model. Men under den oprindelige tilstand af oprensede NSCCs, hvis overgange ikke eksisterede, CSC andel i kulturen vil altid være nul. Dette er indlysende ikke tilfældet observeret i vores eksperimenter samt flere andre rapporter (Fig.2B og Fig.3C) [1], [9] – [11]. Derfor kunne CSC model ikke forklare fænomener observeret i eksperimenter. Som vist i den del af resultater (fig. 5), kan ufuldkommen sortering ikke udgør denne fejl af CSC model.

Det er interessant, at vi startede fra CSC model, men fik resultaterne med funktioner i både CSC og stokastiske begreber (figur 1A), viser eksistensen af ​​både markante CSC /NSCC subpopulationer og de stokastiske overgange fra NSCCs til CSCS.

Materialer og metoder

Cell kultur

Humane tyktarmskræft SW620 celler blev købt fra Cell Resource center (IBMs, WEBCAMS /PUMC, Beijing, Kina) karakteriseret ved STR profilering. Celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium, suppleret med 10% føtalt bovint serum, 100 enheder /ml penicillin, og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C i 5% CO

2.

Cellefarvning og flowcytometri

matchede subpopulationer blev adskilt som tidligere beskrevet [39], [40]. Kort fortalt blev celler farvet i en koncentration på 10

7 celler pr 100 pi puffer. Anti-CD133 /1 (AC133) -PE (MiltenyiBiotec) antistof blev anvendt til flowcytometrisk sortering /analyse. For alle eksperimenter blev prøver sorteres på en BD FACS Aria II og analyseret på en BD LSR II flowcytometer bruge BD FACS Diva Software (BD Bioscience). Side scatter og forward scatter profiler blev brugt til at fjerne snavs og celle dubletter.

In situ

immunofluorescens

Oplysninger om

in situ

immunfluorescens af og chip design er vist i vores tidligere papir [11]. I korte træk blev oprensede NSCCs og CSCS farvet med det monoklonale museantistof mod human CD133-antigen kombineret med R-phycoerythrin (CD133 /1 (AC133) -PE fra Miltenyi Biotec) sammen med det DNA-bindende farvestof Hoechst 33342 hhv. Efter afgasning af chippen, 25 ml celle (CSCS eller NSCCs) suspension blev pipetteret ind i reservoiret. Cellesuspensionen blev stræbt ind i cellekultur værelser på grund af det negative tryk. Efter påsætning af prøven blev cellerne i reservoiret fjernet, og 35 ml medium blev tilsat og dyrket normalt. Efter 2 timers inkubation blev cellerne fotograferet for første gang som beskrevet nedenfor. For immunofluroscence farvning af celler ved definerede tidspunkter såsom 12 timer eller 24 timer blev mediet i reservoiret fjernet og 20 ml medium med passende koncentration af CD133 /1 (AC133) -PE (Miltenyi Biotec) blev tilsat. Efter inkubation blev mediet med CD133 /1 (AC133) -PE i reservoiret fjernet, og 35 ml frisk medium blev tilsat og inkuberet i mørke i vask af cellerne. Celler blev vasket to gange og blev straks fotograferet.

Simuleret udglødning algoritme

Simuleret nedkøling algoritme er en Monte Carlo-algoritme, der ofte bruges til optimeringsproblemer. De første parametre genereres tilfældigt og ansøgerlandene parametre også genereres tilfældigt af visse regler. Disse parametre blev derefter anvendt til at løse ligning (1). I simuleret annealing, vi midlertidigt acceptere en dårligere kombination af parametre med mulighed for at reducere risikoen for lokal optimering. Som temperaturen falder ned, vil nær globale optimale løsninger udledes [44]. I tilpasningsproces, er en parameter kombination accepteret i sidste ende, hvis

Σ (simulering-data)

2

er mindre end tærskelværdien.

Simulation

betegner resultater beregnet af parameteren kombination, og

data

betegner eksperiment resultater. Den beregningsmæssige kode kan findes i Code i File S1.

Cellular automat metode

I cellulære automat metode, celler defineres som agenter med egenskaber, herunder division, overgang og død. Der er to slags agenter: CSC og NSCC. NSCC kan udføre den adfærd, herunder division, overgang og død. CSC kan udføre symmetri og asymmetri divisioner. Agenternes adfærd er kvantificeres ved parametre, som er blevet anvendt i ligning (1). Hver celle agent indtager en regelmæssig gitter med dimension 10 um x 10 um. I denne model blev 200 × 200 gitre defineret. En gitter er indstillet til at rumme en celle højst samtidig. Derfor kunne en celle deler sig i to celler, medmindre der er mindst én ledig sted i sit nabolag (von Neumann nabolag) [45].

Støtte oplysninger

figur S1.

Beregning af celle antal forskellige startbetingelser (t-log10 (celle nummer))

doi:. 10,1371 /journal.pone.0084654.s001

(TIF)

Figur S2. Salg Parametre følsomhed CSC andel ved ligevægt. Blå søjler repræsenterer ændringer i CSC andel på ligevægt, når tilsvarende parametre øges.