PLoS ONE: Påvisning af MET Gene Copy Antal i Cancer Samples Brug af Droplet Digital PCR Method

Abstrakt

Formål

Analysen af ​​

MET

genkopital (KN ) er blevet anset for at være en potentiel biomarkør til at forudsige responset på MET-målrettede behandlinger i forskellige cancerformer. Men for at de nuværende standardmetoder bestemme

MET

CN er SNP 6.0 i det genomiske DNA af kræft cellelinjer og fluorescens

in situ

hybridisering (FISH) i tumormodeller henholdsvis som er dyre og kræver avanceret tekniske færdigheder og resultat i relativt subjektive vurderinger. Derfor har vi ansat en ny metode, dråbe digital PCR (ddPCR), for at bestemme den

MET

genkopital med stor nøjagtighed og præcision.

Metoder

Den genomiske DNA af cancer cellelinjer eller tumormodeller blev testet og sammenlignet med den

MET

gen CN og

MET /CEN-7

forhold bestemt af SNP 6,0 og FISH henholdsvis.

Resultater

i cellelinjer, den lineære sammenslutning af

MET

KN opdaget af ddPCR og SNP 6.0 er stærk (Pearson korrelation = 0,867). I tumormodeller,

MET

KN opdaget af ddPCR var signifikant forskellig mellem

MET

gen forstærkning og ikke-forstærkning grupper efter FISH (gennemsnit: 15,4 vs. 2,1;

P

= 0,044). I betragtning af at

er MET

genamplifikation defineret som

MET

CN 5,5 af ddPCR, konkordansen på mellem ddPCR og FISH var 98,0%, og Cohens kappa koefficient var 0.760 (95% CI, 0,498-1,000;

P

. 0,001)

konklusioner

resultaterne viste, at ddPCR metoden har potentiale til at kvantificere

MET

gen antal kopier med høj præcision og nøjagtighed i forhold til resultaterne fra SNP 6.0 og fisk i kræft cellelinjer og tumorprøver henholdsvis

Henvisning:. Zhang Y, Tang ET, Du Z (2016) Påvisning af

MET

Gene Copy Antal i Cancer Samples Brug af Droplet Digital PCR metode. PLoS ONE 11 (1): e0146784. doi: 10,1371 /journal.pone.0146784

Redaktør: Soheil S. Dadras, University of Connecticut Health Center, UNITED STATES

Modtaget: September 18, 2015; Accepteret: December 22, 2015; Udgivet: 14 Jan 2016

Copyright: © 2016 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev finansieret af Amgen Inc. Alle forfatterne er medarbejdere i Amgen Inc. bidragyder ydet støtte i form af løn til YZ, ET, og ZD, men havde ikke nogen yderligere rolle i undersøgelsen design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. De specifikke roller disse forfattere er formuleret i afsnittet Forfatter Bidrag

Konkurrerende interesser:. Alle forfatterne er medarbejdere i Amgen Inc. Denne kommercielle tilhørsforhold ændrede ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker om deling af data og materialer .

Introduktion

i normale fysiologiske funktioner, er MET udtrykkes i celler af epitelial oprindelse, hvor det spiller en væsentlig rolle i cellevækst og homeostase [1]. Men er blevet observeret i flere humane kræftformer, herunder lever- og gastrisk kræft [2-6], afvigende MET signalering.

MET

genamplifikation er blevet rapporteret at være korreleret med dårlig prognose hos patienter med GC [7-9] og kan anvendes som en potentiel biomarkør for at estimere sygdomsprognosen eller forprogrammeret respons på MET inhibitorer i kliniske forsøg. Således er det vigtigt at udvikle en præcis og optimeret platform for at bestemme

MET

genkopital før MET-målrettet terapi. I rutinemæssige undersøgelser, SNP 6.0 og FISH er standard metoder til at vurdere

MET

kopi antal cancer cellelinjer

in vitro

og tumorprøver

in vivo

hhv. Disse metoder har mange begrænsninger, herunder avancerede tekniske færdigheder, der kræves høje omkostninger og behovet for erfarne eksperter til at analysere tumorprøverne, hvilket resulterer i variable resultater mellem laboratorier. For eksempel er FISH-analyse normalt udføres på formalinfikserede, paraffinindlejrede (FFPE) væv, hvilket kræver en række komplekse processer, såsom fiksering og immunohistologisk farvning, og kan forårsage genomisk DNA beskadigelse og brud. Disse spørgsmål øge sandsynligheden for falske negative resultater på grund af den lave kvalitet og mængde af DNA. Derfor påvisning af gen-amplificeringer er udfordrende på grund af den lave følsomhed af disse metoder.

dråbe digitale PCR (ddPCR) er en metode, der absolut kan kvantificere

markedsøkonomisk behandling

kopi nummer uden behov for standardkurver. I en typisk digital PCR prøven tilfældigt fordelt i adskilte skillevægge, således at nogle indeholder ingen nukleinsyre-template og andre indeholder en eller flere skabelonkopier. Skillevæggene er PCR amplificeret til slutpunkt og derefter aflæst under anvendelse af en dråbe læser til at bestemme den del af positive partitioner baseret på fluorescens amplitude, fra hvilken den absolutte koncentration af målet eller reference-dna skønnes statistisk ved modellering som en Poisson-fordeling. Derfor ddPCR er et slutpunkt måling, som gør det muligt at kvantificere nukleinsyrer uden behov for standardkurver, eksterne kalibratorer og endogene kontrol [10].

I denne undersøgelse, vi søgte at ansætte ddPCR assays til absolut kvantificere

MET

kopi nummer i cancer-cellelinjer og tumorprøver og sammenlignet vores resultater med dem, der opnås ved hjælp af SNP 6.0 og FISH for de samme prøver.

Materialer og metoder

Cell linjer, PDX prøver, og ekstraktion af genomisk DNA

otte human GC og otteogtredive HCC-cellelinier blev indkøbt fra fem organisationer: American Type Culture Collection (ATCC), japansk Indsamling af Research Bioressourcer (JCRB), Koreansk cellelinje Bank (KCLB), Shanghai Institutes of Biological Sciences, CAS (SIBS), og Zhongshan Hospital Fudan University (ZHFU) (se tabel 1). Cellelinierne blev rutinemæssigt dyrket i 96-brønds plader i ATCC anbefalede vækstmedium ved 37 ° C, 5% CO

2 og 95% fugtighed. Genomisk DNA blev ekstraheret fra cancercellelinier med TIANampGenomic DNA Kit (Tiangen, Cat: DP304) ifølge producentens instruktioner. Et hundrede og seksoghalvtreds FFPE af patient-afledt xenograft (PDX) modeller (herunder 116 GC og 39 HCC-modeller) blev opnået fra Shanghai LIDE Biotech Company. For PDX model prøverne blev genomisk DNA ekstraheret under anvendelse af DNeasy blod og væv Kit (Qiagen, Cat #: 69509) ifølge producentens protokol. DNA-koncentrationen blev bestemt med et NanoDrop spektrofotometer (Thermo), og fordøjet med HaeⅢ enzym (NEB, Cat #: R0108S) ved 37 ° C i 1 time. Det fordøjede DNA-prøve blev fortyndet 10 gange med autoklaveret Millipore H

2O og opbevaret i en -20 ° C fryser.

DDPCR til bestemmelse af

MET

CN

Reaktionsblandingen TaqMan PCR blev samlet i et endeligt volumen på 20 pi med 2x Supermix, 20x primere og 20x prober og 20 ng af det genomiske DNA som template. Hver reaktionsblanding blev derefter fyldt i en DG8 patron (Bio-Rad) med 70 pi af dråber generation olie til at generere en dråbe. Dråberne fra hver brønd blev derefter overført til en 96-brønds PCR-plade. Pladerne blev varmeforseglet og derefter termisk cykluser under følgende betingelser: 95 ° C i 10 minutter (én cyklus); 40 PCR-cykler af 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 1 min; og et hold ved 4 ° C. Efter PCR blev pladerne anbragt på en QX200 dråbe læser (Bio-Rad), som analyserede dråber af hver brønd af pladen og kvantificeret mål-DNA’et. PCR blev analyseret under anvendelse QuantaSoft udgave 1.7.4.0917 (Bio-Rad) for at bestemme kopitallet variation (CNV). 20x henvisning assay for AP3B1 inkluderet primere målrettet centromeren loci på kromosom 5 og en probe er mærket med en HEX fluorescerende signal (Bio-Rad). Den 20 x CNV PCR assay for MET inkluderet primere rettet mod regionen fra intron 20-exon 21 på kromosom 7, og proben blev mærket med en FAM fluorescerende signal (Life Technologies, katalog nr Hs02884964_cn). Hver brønd blev replikeret for alle prøverne.

MET

kopi nummer blev beregnet som forholdet mellem koncentrationerne af

MET

og

AP3B1

og ganget med to. Hver data for

MET

KN hjælp ddPCR repræsenterer to eller tre fusionerede tekniske replikatbrønde uden skabelon kontrol (NTC) som negativ kontrol.

SNP 6,0 assay

Blandt de 46 cellelinier blev SNP 6.0 rådata for 35 af de cellelinier downloades fra CCLE projektet (https://www.broadinstitute.org/ccle/home), og de rå data for de andre 11 cellelinjer blev indsamlet ved hjælp Affymetrix Genome Wide Menneskelig SNP Array 6.0 platform, herunder BEL7402, HCCC-810, NOZ, OCUG-1, OZ, QGY7701, QGY7703, SMMC7721, SNU354, SNU368, og SNU739. Alle de rå data blev behandlet ved hjælp PICNIC software og præsenteres som

MET

kopier.

MET

FISH

MET

gen forstærkning blev analyseret ved FISH hjælp af Dako

MET /CEN-7

IQISH Probe Mix (RUO).

CEN-7

centromer probe blev anvendt som reference kontrol, i overensstemmelse med producentens anvisninger. De formalin-fikserede, paraffinindlejrede prøver (cellepellets) blev snittet og derefter udsat for afparaffinering og rehydrering. H forholdet 2.0:

MET

forstærkning blev observeret. Hvis forholdet var borderline (1,8-2,2), blev yderligere 20 kerner tælles, og forholdene blev genberegnet.

Statistisk analyse

De gyldige HCC og GC målinger for

MET

CN blev kombineret for de statistiske analyser. Pearsons korrelationer og lineær regression blev anvendt til at vurdere forholdet mellem ddPCR og SNP 6.0 eller FISH. For at sammenligne forskellene i

MET

CN analyseret af ddPCR mellem gen forstærkning og ikke-forstærkning grupper analyseret ved FISH,

t

-tests blev anvendt. Konsistensen af ​​genamplifikation baseret på ddPCR og FISH blev evalueret i henhold til konkordans sats og Cohens kappa koefficient. Analyserne blev udført med SAS 9.4-software.

Resultater

Sammenligning af

MET

KN test mellem ddPCR og SNP 6.0 i cancer cellelinjer

Genomisk DNA blev opnået ud fra 8 GC og 38 HCC-cellelinier efter

MET

kopiantal detektion, og resultaterne af ddPCR assayet blev sammenlignet med dem af SNP 6.0 at bestemme, om ddPCR kan erstatte de molekylærbiologiske standardteknikker. Resultaterne blev vist i S1 tabel. Vi bestemmes

MET

kopi antal cellelinjer

in vitro

ved hjælp af en Affymetrix microarray. Dernæst brugte vi ddPCR at teste

MET

kopi nummer i de samme prøver ved at normalisere til

AP3B2

henvisning gen. Vi observerede, at de cellelinjer med høj

MET

kopiere numre i henhold til SNP 6,0 havde også høje ddPCR målinger. Den lineære forening for

MET

kopi nummer målinger mellem ddPCR og SNP 6.0 er stærk baseret på Pearsons korrelation (r = 0,867;

P

0,001). Desuden hældning og skæring med

MET

CN af SNP 6,0 til ddPCR i den lineære regression var signifikant (

P

0,001) med en værdi svarende til 1,996 (standardafvigelser af estimater = 0,177) og -4.159 (standard fejl skøn = 0,752), (fig 1).

data er baseret på en lineær regressionsmodel, der justerer for SNP 6.0 med intercept. Solid linje angiver fitting kurve; grå kasse repræsenterer 95% konfidensgrænser; stiplet linje afbilder 95% forudsigelse grænser. Hver data for

MET

KN hjælp ddPCR repræsenterer to eller tre fusionerede tekniske replikatbrønde uden skabelon kontrol (NTC) som negativ kontrol.

MET

gen forstærkning analyse i GC og HCC PDX modeller

Fordi ddPCR præcist kunne vurdere

markedsøkonomisk behandling

kopi nummer i kræft cellelinjer, vi så afgøres, om ddPCR kunne påvise tilstedeværelsen af ​​

MET

forstærkning og sammenlignet resultaterne til dem, der opnås fra FISH. Mange publikationer har rapporteret anvendelse af digitale PCR måling af gen kopi nummer i FFPE væv i forhold til FISH [11,12]. Her analyserede vi 116 GC og 39 HCC PDX tumormodeller. De rå data er sammenfattet i S2 tabel.

MET

kopi nummer analyseret af ddPCR er signifikant forhøjet i

MET

forstærkning gruppe (gennemsnit, 15,4) i forhold til

MET

ikke-forstærkning gruppe (gennemsnit, 2,1) analyseret ved FISH hjælp af en

t

-test med ulige varians (

P

= 0,044) (figur 2). Den lineære sammenhæng mellem

MET

CN analyseret af ddPCR og

MET /CEN-7

forholdet analyseret af FISH var relativt stærk, som vurderes af Pearsons korrelation (r = 0,782;

P

0,001). Desuden ved lineær regression, hældning og skæring med forholdet mellem FISH til

MET

, CN ved ddPCR var signifikant (

P

0,001), med en værdi svarende til 2,723 (standardfejl af skøn = 0,176) og -0.803 (standard fejl af skøn = 0,272) henholdsvis (figur 3). Generelt resultaterne foreslået, at

MET

kopi talværdier opnået ved ddPCR kunne skelne mellem de

MET

ikke-forstærkning og forstærkning grupper defineret af FISH og at ddPCR kan bruges til at måle

MET

kopi nummer i PDX-modeller.

P

-værdi var baseret på

t

-test antager forskel afvigelser i hver gruppe. Hver data for

MET

KN hjælp ddPCR repræsenterer to eller tre fusionerede tekniske replikatbrønde uden skabelon kontrol (NTC) som negativ kontrol.

data er baseret på en lineær regression model, der justerer for FISH forholdet med intercept. Solid linje angiver fitting kurve; grå kasse repræsenterer 95% konfidensgrænser; stiplet linje afbilder 95% forudsigelse grænser. Hver data for

MET

KN hjælp ddPCR repræsenterer to eller tre fusionerede tekniske replikatbrønde uden skabelon kontrol (NTC) som negativ kontrol.

konkordans sats og Cohens kappa koefficient var bruges til at observere sammenhængen i genamplifikation mellem ddPCR og FISH og vurdere, om der var en god afskæringsværdi for at definere ddPCR-baserede genamplifikation sammenlignet med FISH forholdet 2,0. Blandt de cut-off kandidater,

MET

CN 5,5 af ddPCR havde den højeste konkordans rate (98%) og Cohens kappa koefficient (κ = 0.760) (95% CI, 0,498-1,000;

P

0,001). Især blandt de 155 gyldige PDX prøver, selv om de fleste af prøverne havde sammenhæng i

MET

genamplifikation mellem ddPCR og FISH, kun 3 PDX modeller (GAPF528, GAPF509, og GAPF012), der var positive for

MET

CN af ddPCR viste ikke en påviselig FISH forhold . 2,0 (tabel 1)

diskussion

Menneskelige genomer udviser segmental kopi nummer variation (CNV) på tusindvis af loci [ ,,,0],13].

MET

genamplifikation er blevet beskrevet i gastrisk cancer (GC) og hepatocellulært carcinom (HCC), hvilket resulterer i dysregulering af MET-signalering og er associeret med klinisk prognose og dårligt resultat [6]. Den afvigende MET signalering er blevet betragtet som en robust mål i anticancerterapi. Således er det tænkeligt, at en række undersøgelser [7-9] har påvist

MET

genamplifikation som en potentiel biomarkør at estimere patienter med kræft, der vil drage fordel af behandlingen med selektive MET hæmmere eller antistoffer. Hidtil har der ikke været nogen standardiseret metode til at validere

MET

genamplifikation eller

MET

kopi nummer.

SNP 6.0 og fisk er de metoder, der almindeligvis anvendes til at vurdere

MET

kopi nummer i kræft cellelinjer

in vitro

og tumorprøver

in vivo

hhv. en række spørgsmål, kan imidlertid komplicere påvisning af genamplifikation. Først, disse metoder er meget dyre og kræver avancerede tekniske færdigheder, og dermed, informatik teknikere eller erfarne patologer skal analysere dataene, subjektive vurderinger. For det andet,

in vivo

tumorprøver, såsom FFPE væv, er altid testet af FISH og bruger lange fragment prober, hvilket resulterer i variationer i genkopital detektion det afhængigt af proberne er rettet mod forskellige gen loci. Således har vi forsøgt at identificere en fremgangsmåde med enkle tekniske krav for mere præcist at detektere

MET

kopital.

I denne undersøgelse vurderede vi muligheden for at benytte en ny fremgangsmåde til at kvantificere ddPCR

MET

kopi nummer eller vurdere genamplifikation fra kræft prøver bestående af cellelinjer eller FFPE tumorer. Resultaterne viste, at ddPCR kunne bestemme MET status i tumorprøver. Vi fandt der var en positiv korrelation mellem

MET

kopiere numre detekteret af ddPCR og SNP 6.0 ifølge Pearson s korrelationer (r = 0,867;

P

0,001). Selvom microarray teknologier er værdifulde metoder til CNV bestemmelse, har de begrænset dynamikområde og er dyre for high-throughput screening i populationsstudier [10]. På grund af begrænsningerne i SNP 6.0 tilgang i nøjagtig måling kopiantal større end 4 og manglende følsomhed og opløsning, kan ddPCR blive udviklet til at måle høj kopi CNV mere præcist i et stort antal prøver, som beskrevet før [13]. Baseret på vurderingen af ​​

MET

forstærkning i 155 FFPE PDX tumorer, ddPCR kan retvisende billede af

MET

forstærkning status i forhold til FISH, med en 98% konkordans sats. Desuden er der betydelig forskel på

MET

CNV opdaget af ddPCR mellem FISH-positive og FISH-negative grupper, hvilket giver en meget signifikant bevis på princippet.

Især selv i de fleste af 155 FFPE PDX tumorer, status MET opdaget af ddPCR var sammenlignelige med dem, opdaget af FISH, tre FFPE tumorer, hvis

MET

kopi talværdier var høj (KN 5,5) i ddPCR viste ikke genamplifikation ved FISH (

MET /CEN-7

forholdet 2,0). Årsagen til uoverensstemmelse af

MET

forstærkning mellem ddPCR og FISH kan være undervurdering af

MET

forstærkning af FISH eller overvurdering af

MET

forstærkning af digital PCR. På den ene side, tilstedeværelsen af ​​

MET

genamplifikation kunne være maskeret på grund af karakteristisk for ufuldstændig hybridisering af lange fragment sonder anvendes i FISH, hvilket resulterer i ikke-specifik identifikation af

MET

forstærkning. Især kunne variationen i

MET

forstærkning tilskrives sonden målrette forskellige genomisk loci opdaget af FISH. På den anden side kunne den fiksering, der anvendes til FFPE væv forårsager DNA-fragmentering, skade eller fusion, hvilket fører til en falsk-negativt resultat. Derudover kan antage, at tab af kromosom ofte forekom i mange cancertyper resultere i genomisk kromosomale ustabilitet [14-16], betyder det, at tabet af henvisningen gen loci i tumoren kan forårsage en falsk positiv forhøjet forhold på

MET

:.

AP3B1

i ddPCR, snarere end høj

MET

kopi nummer

af note,

MET

CN anden PDX prøve (GAPF101 ) er 0,00022 uden succes KN opkald ved ddPCR, ekstremt lavere end

MET /CEN-7

forholdet 1 ved FISH. Det indebærer, at sletning eller beskadigelse af

MET

kan forekomme i delvis region MET, der blev ramt af forskellige prober ansat i ddPCR og FISH, hvilket resulterer i forskellen på markedsøkonomisk status mellem FISH og ddPCR. Det vil være spændende at udforske årsagerne til uoverensstemmelse i fremtidig forskning.

Ellers analyse af tumor prøver ved FISH kræver kompleks eksperimentel teknologi og kan afhænge af den subjektive vurdering af patologer. Resultaterne kan variere mellem forskellige patologer baseret på deres erfaringer. I denne undersøgelse, viser vi, at ddPCR er en kvantitativ metode, der absolut kan kvantificere

MET

kopi nummer i kræft prøver enten

in vitro

eller

in vivo

, uden brug for standard kurver eller endogene kontrol.

Samlet set tyder disse data, at ddPCR har potentialet til at detektere

MET

kopi nummer i kræft cellelinjer eller FFPE DNA og stærkt korreleret med SNP 6.0 eller FISH hhv.

MET

genamplifikation er blevet beskrevet at være associeret med tumorgenese og metastatisk progression og betragtes som en biomarkør til at forudsige gavn af MET-målrettet terapi i forskellige kliniske undersøgelser [7-9]. Vores resultater giver den indsigt, at den ddPCR platformen kan være i stand til at anslå forholdet mellem markedsøkonomisk status og patient prognose i kliniske studier og hjælper med at forudsige og screene patienterne i respons på MET-målrettet terapi.

Støtte Information

S1 Table. Sammenligning af

MET

kopi nummer opdaget af ddPCR versus af SNP 6.0

doi:. 10,1371 /journal.pone.0146784.s001

(PDF)

S2 Table. Sammenligning af

MET

kopi nummer opdaget af ddPCR versus ved FISH

doi:. 10,1371 /journal.pone.0146784.s002

(PDF)