PLoS ONE: Integrativ proteomiske Analyse af Serum og Peritoneale Væsker Hjælper Identificer proteiner, der er opreguleret i Serum af kvinder med æggestokkene Cancer

Abstrakt

Baggrund

Vi brugte intensive moderne proteomics tilgange til identificere prædiktive proteiner i ovarie cancer. Vi identificerer up-regulerede proteiner i både serum og peritonealvæske. For at evaluere de samlede resultater af den tilgang, vi spore adfærd 20 validerede markører på tværs af disse eksperimenter.

Metode

Massespektrometri baserede kvantitative proteomanalyse efter omfattende protein fraktionering blev brugt til at sammenligne serum af kvinder med serøs æggestokkræft til raske kvinder og kvinder med godartede tumorer i æggestokkene. Kvantificering blev opnået ved isotopisk mærkning cystein aminosyrer. Label-free massespektrometri blev anvendt til at sammenligne peritonealvæske taget fra kvinder med serøs ovariecancer og dem med godartede tumorer. Alle data blev integreret og kommenteret baseret på, om proteiner er blevet tidligere valideret ved hjælp af antistof-baserede analyser.

Resultater

Vi valgte 54 kvantificerede serum proteiner og 358 peritonealvæske proteiner, hvis case-kontrol forskelle overskred en foruddefineret tærskel. Sytten proteiner blev kvantificeret i begge materialer og 14 er ekstracellulær. Af 19 validerede markører, der blev identificeret alle blev fundet i cancer peritonealvæske og en undergruppe af 7 blev kvantificeret i serum, med et af disse proteiner, IGFBP1, nyligt validerede her.

Konklusion

Proteome profilering anvendes på symptomatiske tilfælde ovariecancer identificerer en lang række up-regulerede serumproteiner, hvoraf mange er eller har været bekræftet af immunoassays. Antallet af tiden kendte validerede markører er højest i peritonealvæske, men de udgør en højere procentdel af de observerede i både serum og peritonealvæske proteiner, hvilket antyder, at de 10 yderligere markører i denne gruppe kan være af høj kvalitet kandidater.

Henvisning: Amon LM, Law W, Fitzgibbon MP, Gross JA, O’Briant K, Peterson A, et al. (2010) Integrativ proteomiske Analyse af Serum og Peritoneale Væsker Hjælper Identificer proteiner, der er opreguleret i Serum af kvinder med kræft i æggestokkene. PLoS ONE 5 (6): e11137. doi: 10,1371 /journal.pone.0011137

Redaktør: Sudhansu Kumar Dey, Cincinnati Children Research Foundation, USA

Modtaget: Marts 26, 2010; Accepteret: 26 maj 2010; Udgivet 15. juni, 2010

Copyright: © 2010 Amon et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette projekt er finansieret delvist med føderale midler fra National Cancer Institute, National Institutes of Health, under tilskud numre U01 CA111273, P50 CA83636, kontrakt nr HHSN261200800001E, og de Kanariske Foundation. Indholdet af denne publikation afspejler ikke nødvendigvis synspunkter eller politik Department of Health og Human Services, heller ikke nævner af firmanavne, kommercielle produkter, eller organisationer indebærer godkendelse af den amerikanske regering. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene (OC) er en førende årsag til lidelse og død for kvinder i USA, og diagnosticering det til en på forhånd metastatisk stadie kan dramatisk reducere dødeligheden. Selvom OC udgør kun 4% af alle kræftdiagnoser i kvinder (National Cancer Institute. Http://www.cancer.gov) det er den mest dødbringende af alle gynækologiske kræftformer. Som med mange kræftformer, er en kvindes overlevelse [1] med OC stærkt forbundet med dets scenen på diagnose. Serøs ovariecancer (SOC) er den mest udbredte og dødelige histologi; over 70% af alle OC tilfælde er diagnosticeret i en metastatisk stadie.

afsløring strategier tidligt for OC i øjeblikket under evaluering har typisk involveret kombinere en eller flere blod-baserede markører (typisk markøren CA 125) som et middel til henvise kvinder til en bekræftende imaging modalitet såsom transvaginal sonografi. Ved brug af en markør som en first-line skærmen, vil udførelsen af ​​hele screeningsstrategi være begrænset af udførelsen af ​​denne markør og en særdeles vigtig attribut ydeevne for en tidlig påvisning markør er bly-tid, dvs. hvor tidligt i sygdomsforløbet markøren løfter. Selvom foreløbige resultater tyder på, at opnå en positiv prædiktiv værdi tærskel på 10% [2] er mulig ved hjælp af den sekventielle multimodale tilgang, modellering tilgange [3] – [6] og prækliniske valideringsundersøgelser profilering CA 125 og andre markører [7 ] tyder på, at bly-tid opnået fra CA 125 kan være utilstrækkelige på en meningsfuld reducere dødeligheden i en stor del af kvinderne.

andre end CA 125 Mange markører er blevet identificeret og valideret i uafhængige undersøgelser ved hjælp af prøver indsamlet ved tidspunktet for klinisk diagnose [8] – [18]. Vi henviser til disse markører som “validerede prædiktive proteiner”, som vi betyder proteiner bekræftet ved hjælp af immunoassays i flere uafhængige prøver og derfor som en gruppe, vil sandsynligvis være overvejende sande positiver. For nylig er mange af disse markører er blevet evalueret i prøver opnået før diagnose og foreslå, at vi kan forvente nogle proteiner valideret i symptomatisk sygdom til også ophøje før symptomerne udvikler [7]. Det er klart, vil forbedre tidlig påvisning for SOC kræve identifikation af nye klasser af markører, eventuelt ved plasma eller serum proteomiske tilgange.

Et mål af vores undersøgelse omfatter identificere yderligere markører ved hjælp serum proteomics. Imidlertid har muligheden for at opdage differentierede proteiner i serum og plasma været kontroversielt og ikke bredt vellykket, og så et sekundært mål for vores undersøgelse er at validere den samlede serum proteom eksperimentel arbejdsgang ved hjælp af flere markører som guld standarder. I dette manuskript beskriver vi et sæt proteom eksperimenter, afhøre komplekse blandinger af human OC biomaterialer. Forsøgene havde to formål; den første var at identificere tidligere uidentificerede proteiner, der kan være yderligere kandidater som prædiktive markører. Den anden var at validere serum proteomics tilgang ved at spore adfærd kendte validerede prædiktive proteiner for at fastslå, at platformen er i stand til at opdage markører. Tidlige plasma og serum proteom opdagelse indsats, oftest afhængige af SELDI eller MALDI metoder [19] – [26], har stort set mislykkedes i denne henseende. Nyere metoder, der anvender tandem MS kombineret med intensiv fraktionering [27] – [29] kunne være mere passende for serum og plasma biomarkør opdagelse, da de har vist sig at identificere proteiner for kræft i bugspytkirtlen [30], der er efterfølgende blevet valideret. Men fordi succes for enhver opdagelse tilgang sikkert vil afhænge af sygdommen egenskaber så meget som den teknologi, før at investere ressourcer i at udvikle antistoffer til nye markører, vi først ønskede at bekræfte, at den fremgangsmåde er i stand til at producere reproducerbare resultater.

Vi har forhørt både en cirkulerende fluid, serum, og en fluid proximalt til tumoren, ascitesvæske eller peritonealvæske fra kontrolpatienter med benigne serøse tumorer (BST). Vi har udført to forskellige eksperimenter på serum: det første eksperiment sammenlignet serumpuljer fra metastatiske SOC patienter til pools fra matchede raske symptomfri frivillige; det andet eksperiment sammenlignet serumpuljer fra et andet sæt af metastatiske SOC patienter til serumpuljer fra kvinder med BST. For de proximale fluid eksperimenter sammenlignede vi puljer af ascitesvæske fra metastatiske SOC patienter til puljer af peritonealvæske fra patienter med BST. I alle eksperimenter blev prøver matchet baseret på alder, opbevaring varighed, hormonbehandling brug og tidspunktet for indsamlingen før kirurgi (for case /kontrol sammenligning). Ved at kombinere disse datasæt og identificere proteiner, der synes at være opreguleret i SOC i både serum og væske proksimalt for tumoren, håber vi at berige vores potentiel kandidat liste med kræft-specifikke markører.

Resultater

Annotation af proteiner baseret på eksisterende data ressourcer

En liste over 21 proteiner tidligere vist sig at være opreguleret i plasma eller serum af SOC sammenlignet med raske kontrol ved ELISA-analyser blev udarbejdet ved at undersøge OC biomarkør litteratur. Vi identificerede disse proteiner samt en ekstra protein, IGFBP1, opdaget og valideret i dette arbejde som sande positive kontroller. Fire af de sande positive proteiner blev ikke identificeret i enten plasma eller peritonealvæske: MUC16 [31] – [33], TNFRSF6B [14], VTCN1 [14], [17] (aliaser CA 125, DcR3, B7-H4, henholdsvis ) og VEGF [16]. Tabel 1 viser de 19 sande positive proteiner, som blev identificeret i plasma eller peritoneal væske [14], [16], [17], [31] – [33]. Alle af dem blev observeret og kvantificeres peritonealvæske, og 7 blev observeret i plasma; ingen positive kontroller blev identificeret udelukkende i plasma.

Serum sammenligninger

serum proteomics eksperimenter (beskrevet nedenfor) sammenlignet metastatisk serøs kræft i æggestokkene (SOC) til enten raske symptomfri (HA) kvinder eller kvinder med godartede serøse tumorer (BST). Tabel 2 viser det samlede antal af kvantificerede proteiner i hvert serum eksperiment. Over 360 proteiner blev kvantificeret i hvert eksperiment og i alt 470 proteiner blev kvantificeret i mindst den ene eller anden eksperiment. Kollapse disse proteiner ved gen-symbol resulterer i lidt lavere totaler skyldes forskellige isoformer identificeret for det samme gen. I figur 1 er associationen mellem log2 nøgletal for alle kvantificerede proteiner ved gen-symbol for de to serum eksperimenter afbildes (horisontale og vertikale akse afspejler SOC versus HA og SOC versus BST, henholdsvis). Bemærk, at alle forhold er orienteret således, at en positiv værdi betyder et protein-forhold højere i SOC. Proteiner, der ikke blev observeret i et eksperiment, er repræsenteret ved en pseudo-forhold på ‘1’ (log2 = 0) for at eksperimentere.

Grønne punkter repræsenterer proteiner opreguleret i begge forsøg. Blå punkter repræsenterer proteiner opreguleret i et eksperiment og ikke observeret i den anden. * Benchmark markør valideret ved ELISA-assay; ** Ny markør valideret af ELISA-assay

Figur 1 viser en lovende mønster, at man kan forvente at se i et eksperiment, der sammenligner to komplekse blandinger og hvori nogle differentierede proteiner overholdes.: fleste proteiner falder nær oprindelsen og varierer i en ikke-korreleret måde, da ikke systematiske forandringer, som sker, men en række af dem i øverste højre kvadrant tendens væk fra massen. Med henblik på at karakterisere vores resultater, mærke vi et protein som opreguleret hvis dens konsensus forholdet opfylder eller overstiger et 2-gange ændring (dvs. log2 (SOC /HA) + log2 (SOC /BST) ≥1 som angivet ved linie i figur 1). Alle 54 proteiner, der opfylder dette kriterium er vist med grønt, hvis observeret i begge sammenligninger eller blå hvis observeret i kun én. Disse proteiner er også anført i tabel S1 (i supplerende oplysninger).

De proteiner, der svarer til vores ‘benchmark’ proteiner fra tabel 1 er angivet med en stjerne. blev observeret i alt syv benchmark proteiner i serum, herunder seks, der tidligere var valideret samt en ekstra markør, IGFBP1, betegnet med to stjerner, som vi valideret her baseret på disse eksperimenter. Alle syv af de observerede benchmark proteiner var opreguleret af vores kriterier. Den observerede berigelse (7 af 7) er meget signifikant (p-værdi = 1e-6), hvilket viser, at vores serum proteomisk analyse finder høj konkordans med validerede assays.

peritonealvæske eksperimenter

peritonealvæske forsøg sammenlignes ved anvendelse af en etiket-fri metode, der giver os mulighed for at kvantificere alle observerede proteiner, ikke kun dem, der indeholder en isotopisk mærket cystein aminosyre. Efter at kollapse ved gen-symbol, er 2950-proteiner observeres i begge forsøg. Sammenligningen af ​​log2 (peptid spektrale tællinger) mellem SOC til BST er afbildet i figur 2. For nemheds skyld er proteiner med spektral count = 0 i en fluid men observeres i den anden væske indstilles til 0,5. Vi definerer et protein som opreguleret hvis den har en SOC-peptid tæller mindst to gange højere end den tilsvarende BST peptid tæller. Fra 2950 identificerede proteiner ved gen symbol, er 358 udvalgt som potentielt opreguleret baseret på dette kriterium (se tabel S1). Proteiner, der blev også fundet opreguleret i serummet eksperimenter er vist i rødt. Vi anmærke også de proteiner, rapporteret af Kuk

et al

[34], som evaluerede SOC ascitesvæske. I vores eksperimenter, 73 Kuk kandidater overholdes, vist med blåt i figur 2, og er fordelt bredt blandt SOC og BST tæller med kun 37 opreguleret. Kuk

et al

ikke vurdere materiale fra BST. Som i serum eksperimenter, fandt vi en signifikant berigelse af validerede biomarkører blandt de up-regulerede proteiner i ascitesvæske. Af de 19 benchmark proteiner hos begge peritonealvæske (mærket i figur 2), alle på nær to, MIF og MSLN, opreguleret (p-værdi = 2e-16). Bemærk, at MIF opregulering er muligvis forbundet med prøve konstatering skævhed [9]. Dataene her er i overensstemmelse med konklusionerne fra Kuk

et al.

At kræft ascitesvæske kan være en værdifuld ressource til at identificere biomarkør kandidater, selv om vores resultater fra BST tyder på, at mange af dem ikke vil være kræft specifik.

Røde punkter er opreguleret i SOC serum. Blå punkter er proteiner observeret i ovariecancer ascitesvæske ved Kuk et al [34]. Benchmark proteiner er mærket. Points over grønne stiplede linje betragtes opreguleret i peritonealvæske.

Sammenligning af serum versus peritoneal væske

For at sammenligne de to forskellige typer af væske, de konsensus log2 nøgletal end både serum eksperimenter blev plottet mod log2 forholdet SOC ascitesvæske løbet BST peritonealvæske, som vist i figur 3. da kun proteiner observeret i begge materialer kan plottes, denne sammenligning omfatter kun de 358 proteiner observeret i både serum og peritonealvæske. I alt 17 af disse proteiner blev betegnet opreguleret i begge sæt. Den samlede konkordans af alle proteiner, som målt ved korrelationen i forholdene, er ikke stærk, men dette er ikke uventet, da de fleste proteiner ikke skiftes mellem de to kilder og for de eksperimentelle variationskilder bør dominere. Kun blandt proteiner, der systematisk varierer mellem tilfælde og kontrol skal vi finde konkordans. De 17 proteiner, som er opreguleret i begge forsøg (anført i tabel 3 og vist i blåt i figur 3) er stærkt beriget med de validerede biomarkører listet i tabel 1. Alle syv observerede benchmark proteiner målt i begge forsøg blev fundet opreguleret (p-værdi = 2e-16). Men den største fordel, vi observerer ved at bruge overlapningen af ​​de to eksperimenter er en betydelig stigning i andelen af ​​validerede markører blandt alle opreguleret markører. I serum, 15% af de up-regulerede proteiner var benchmark proteiner og i ascites kandidatlisten væske, 5% var benchmark proteiner. Hvis vi bruger overlapningen af ​​disse to eksperimenter er procentdelen af ​​kandidat-proteiner fra de validerede benchmark liste stiger til 7 ud af 17 (41%).

Proteiner opreguleret i begge fluider er farvet blå. * Benchmark markør valideret ved ELISA-assay; ** Ny markør valideret af ELISA-assay.

Ud over eksperimentelle data, tabel 3 omfatter også annotation til to GO kategorier, ekstracellulær region og inflammatorisk eller respons på såret, hvor et “ja” angiver proteinet kommenteret for dette udtryk enten på blad eller en forælder node. Den “ekstracellulære region” term indikerer, at protein er placeret uden for plasmamembranen og kunne udskilles i blodet. Blandt de 17 proteiner, 14 (82%) af dem er betegnet som ekstracellulær sammenlignet med 17% af alle proteiner observeret i eksperimenterne. Dette misforhold understøtter den hypotese, at vi ved at kombinere data fra cirkulerende og proximale fluider kan være mere tilbøjelige til at opdage protein biomarkører udskilte eller stald fra tumoren frem for at udlede andre steder i værten. Vi har også inkluderet GO udtryk relateret til inflammation i denne tabel for at udelukke proteiner, der måske ikke er kræft-specifikke. Kun to af de 17 overlappende proteiner er kendt for at være involveret i inflammation.

ELISA validering af IGFBP1

validering status for alle 17 kandidatlande proteiner er angivet i Tabel 3. Commercial ELISA assays er tilgængelige for 8 af de 17 proteiner. Af dem, seks blev valideret i tidligere undersøgelser (se tabel 1). De resterende to proteiner fra denne undersøgelse, MMP9 og IGFBP1, blev analyseret i denne undersøgelse.

Valideringen blev gennemført i tre faser. I det første trin blev markørerne testet i en række blandinger af varierende forhold af samlede sera fra OC patienter og samlede sera fra HA kontroller fra filtreringen sæt prøver (50 OC, 9 ha kontroller) beskrevet i Methods. Begge proteiner havde høje koncentrationer i den høje OC pool men kun IGFBP1 viste en koncentration afhængighed med forholdet mellem ovariecancer sera at kontrollere. Begge proteiner blev derefter testet mod individuelle prøver fra filtrering sæt (12 OC, 12 HA kontroller) er beskrevet i Methods. IGFBP1 niveauer signifikant højere i cancer serum (p-værdi = 0,0097), mens MMP9 niveauer ikke var (p-værdi = 0,20). Et tredje sæt af prøver, der var begrænset til serøse sager ovariecancer (44 SOC, 78 HA kontroller) blev anvendt til at bekræfte højde af IGFBP1. I dette datasæt, betydningen af ​​sagen til at styre forskel steg til 5.0e-4 og ROC-kurven havde en AUC på 0.860. ROC-kurven for disse prøver er vist i figur 4 viser evne IGFBP1 at klassificere OC versus HA og BST kontrol, som viser resultater i overensstemmelse med adfærden i proteomics eksperimenter.

SOC vs HA er vist i sort og SOC vs BST i blå

diskussion

proteomiske profilering af serum eller plasma for at opdage kræft biomarkører endnu ikke mødt med åbenlyse succes [19] -. [26], hvor proteinerne var valideret i uafhængige stikprøver eller ved hjælp af uafhængige platforme. En bemærkelsesværdig undtagelse er en bugspytkirtelkræft undersøgelse ved hjælp af en musemodel og dybtgående fraktionering af intakte proteiner [30]. I dette manuskript har vi brugt en lignende tilgang til tandem MS proteomisk profilering af serum i kombination med profilering af peritoneal væske som proksimale tumor væske. Vi har produceret en kort liste over 17 biomarkører fundet op reguleret i både serum og proksimal væske – der omfatter 7 proteiner, der er blevet valideret ved anvendelse af eksisterende ELISA analyser, herunder en ny SOC biomarkør (IGFBP1). De resterende 10 markører i denne gruppe kan repræsentere kandidater af høj kvalitet.

Vores succes med at identificere mange validerede markører kan skyldes en række funktioner i den eksperimentelle design. Prøve skævhed blev elimineret ved omhyggelig prøvetagning og stramt matchende sager til kontrol. Ud over at matchende baseret på alder, race og familie historie af OC blev kontroller også matchet på HRT brug og antallet af dage før indgrebet ved blod uafgjort. HRT er blevet vist at dramatisk påvirke niveauerne af mange serumproteiner [35], [36]. Thorpe

et al

[37] viste, at blod udtaget operationsdagen er forbundet med elevation af flere serumproteiner. Denne skævhed blev undgået her ved omhyggelig prøve matching baseret på case /kontrol kollektion tilstand. Et andet vigtigt aspekt denne analyse var brugen af ​​omfattende prøve fraktionering før MS. Dette design, som har vist sig at opnå følsomheden af ​​10 ng /ml koncentration [35], [36], tillod større dybde af proteom dækning ved tandem MS at identificere potentielt relevante ændringer.

Et vigtigt aspekt af designet af serum forsøgene var brugen af ​​tre forskellige typer af emner: ovariecancer patienter, raske asymptomatiske forsøgspersoner og patienter med godartede tumorer. Proteiner opreguleret i SOC forhold til HA, men ikke i forhold til BST vil sandsynligvis ikke være kræft-specifikke og blev slået ud af betragtning. Det samme var tilfældet for proteiner opreguleret i forhold til BST, men ikke til HA. Brug kun SOC vs BST sammenligning, ville vi have fundet 5 ud af 7 kvantificerede validerede markører i modsætning til 7 ud af 7 (TIMP1 og SLPI ville blive fjernet).

Ved at kombinere serum data med data fra proteomisk profilering af peritoneal ascitesvæske tilladt os at identificere en gruppe af proteiner har en stor fraktion af vores sande positive proteiner; fjerne proteiner ikke findes også i peritonealvæske reduceret vores potentielle kandidater 54-17 samtidig bevare alle syv benchmark proteiner kvantificeret i serum. Dette resultat understøtter den hypotese, at proteiner identificeret i en fluid proksimalt til tumoren og også i en cirkulerende fluid vil identificere effektive biomarkører. Kuk

et al

[34] viste, at ascitesvæske fra patienter med kræft i æggestokkene indeholdt et stort antal af høj kvalitet markører, og vores resultater er overensstemmende med disse resultater. Men fordi antallet af benchmark proteiner fundet i peritonealvæske er højere end i serum, kan man ikke gøre påstanden om, at flere markører kan identificeres ved at kræve observationer i både serum og proximale væske. Faktisk vores data, og at fra Kuk

et al.

Tyder på, at ascitesvæsken proteomics data kan indeholde det større antal af høj kvalitet markører. Vores resultater tyder på kun at kræver proteiner, der skal overholdes i begge prøver kan føre til en større andel af høj kvalitet markører. Denne hypotese kan ikke bekræftes, men uden også systematisk evaluere sande negative markører samt sande positive. Desuden er det ikke identificere alle kendte markører indikerer ikke, at markøren er ikke af høj kvalitet eller at processen er nødvendigvis skyld. For eksempel, vores platform var ikke i stand til at identificere CA 125 eller tre andre markører, som vi oprindeligt valgt som benchmark proteiner, muligvis på grund af følsomhed begrænsninger på massespektrometri. Eftersom en platform er i stand til at kvantificere eksisterende validerede markører, vil man finde overensstemmelse mellem de to platforme beroligende, som vi fandt her.

I deres kombinerede data fra fire forskellige fraktioneringsmetoder Kruk

et al .

identificeret 445 proteiner i alt, et tal betydeligt lavere end de tusindvis af protein grupper, vi observerede i vores eksperimenter. Denne forskel skyldes dels deres fokus på subproteome af proteiner under 100 kDa som vores sæt indeholder 490 proteiner større end 100 kDa. Men brugen af ​​intensiv fraktionering kan forklare den resterende forskel. På trods af disse forskelle, konklusionerne af deres undersøgelse er meget i overensstemmelse med vores resultater; efter anvendelse nogle data mining teknikker, de reduceret deres kandidatliste til 77 proteiner (herunder 25 kendte OC markører), 73 som blev observeret i vores undersøgelse. Som det fremgår i figur 2, de relative mængder af de Kuk proteiner indbefatter nogle, der er op og ned; kun halvdelen af ​​disse er op af to gange i forhold til den godartede peritonealvæske. Af de 19 benchmark proteiner hos begge pulje af peritonealvæske, 17 har spektrale tællinger to gange højere i SOC end BST. Dette antyder, at selv om Kuk

et al

var korrekte i deres påstand om, at ascitesvæsken er en rig kilde til potentielle markører, vores arbejde tyder på, at inddragelse af et kontrolmateriale kan være nyttige i at reducere falske positiver. En af styrkerne ved denne undersøgelse er brugen af ​​relative mængder af SOC til BST for at finde proteiner specifikke for ondartet sygdom.

Spørgsmålet om confounding inflammatoriske proteiner (for nylig behandlet af Checlinska

et al

[38]) minimeres på flere måder i vores undersøgelse. Først vores udtynding og fraktionering metoder tillader os adgang til proteiner uden blot de meget rigelige dem, der ofte omfatter mange proteiner relateret til inflammation. Derudover vores sammenligninger mellem kræft og godartet sygdom bortfiltrere mange proteiner, der løfter grund af tilstedeværelsen af ​​en godartet tumor; inflammatoriske proteiner deles af begge betingelser er elimineret. Også, da vi målretter udskilte proteiner ved at lede efter overlapning mellem proteiner i den proximale væske og dem forhøjede i serum, vil vi reducere muligheden for at observere serumproteiner syntetiseres i leveren som et inflammatorisk respons. Alligevel Tabel 3 indeholder to proteiner (ORM1, SERPINA3) ud af 17 biomarkør kandidater, der har roller i inflammation. Mens vi i høj grad har forbedret andelen af ​​biomarkører relateret til betændelse i forhold til tidligere profilering eksperimenter [39], [40], kan vi ikke helt fjerne alle forstyrrende faktorer og må stole på annotation når rådighed for at fremme filtrering.

I dette arbejde har vi også har opdaget og valideret en hidtil ukendt biomarkør for symptomatisk serøs ovariecancer, insulin vækstfaktor bindende protein 1. ligesom IGFBP2, IGFBP1 er medlem af det insulin-lignende vækst faktor bindende protein familie og binder både insulin-lignende vækstfaktorer, IGF1 og IGF2. Ligesom de andre IGFBP’er, er IGFBP1 udtrykt i lokale væv, herunder ovarie, og er til stede i normalt plasma. Serumniveauer af IGFBP1 er signifikant reduceret hos postmenopausale kvinder, der tager hormonbehandling [35]. Selvom forhøjede serumniveauer af IGFBP2 er blevet påvist i en række cancere, herunder ovariecancer [10], er dette den første bevis på, at IGFBP1 niveauerne stiger i serum eller plasma fra patienter med ovariecancer. En anden undersøgelse viste forhøjede niveauer af IGFBP1 (og IGFBP2) i plasma af patienter med hoved og hals kræft [41].

Endelig skal vi også konstatere, at blandt de 17 markører vist sig at være opreguleret i serum og ascitesvæske af SOC, alle undtagen tre udskilles proteiner. Selv om det rutinemæssigt hævdes at udskilte proteiner bør foretrækkes som kandidater på grund af deres potentiale til at udskille i blodet, er denne påstand ikke ofte understøttes empirisk. Vores data giver en stærk støtte til denne generelt accepterede hypotese.

Som beskrevet i indledningen af ​​dette manuskript, selv om flere serum biomarkører for kræft i æggestokkene er blevet opdaget og valideret, alle markørerne har vist dårlige resultater i pre -diagnostic prøver. I denne undersøgelse har vi satte sig for at indføre muligheden af ​​proteom profilering af serum for at opdage ovariecancer biomarkører ved brug sammen med andre profilering af proksimal fluid. Efter at have demonstreret succes denne tilgang, kan vi nu trygt anvende disse metoder til mere udfordrende præ-symptomatiske prøver.

Materialer og metoder

Rekruttering og indsamling af humant blod og peritonealvæske for opdagelse

Alt forskning til denne undersøgelse blev specifikt gennemført under Fred Hutchinson Cancer Research center Institutional Review Board godkendte protokoller, IR # 6045 og IR # 6094. Alle humane prøver stammede fra patienter, som forudsat skriftlige samtykke. Data blev analyseret anonymt.

Serum fra kvinder med serøs ovariecancer (SOC), godartede serøse tumorer (BST), og fra raske symptomfri (HA) kontroller blev brugt i vores proteom opdagelse og validering eksperimenter. Prøvetagningssystemer protokoller er tidligere blevet beskrevet detaljeret andetsteds [32], [37]. Kort sagt, serum og peritoneal væske fra kvinder med SOC og BST blev indsamlet før kirurgi og kemoterapi som en del af en kræft i æggestokkene Specialized Program for Forskning Excellence (SPORE) finansieret af National Cancer Institute. Diagnosticering af SOC og BST blev bekræftet af centrale patologi gennemgang. Alder og hormonpræparater (HRT) matchede HA kontroller blev rekrutteret gennem en ovariecancer screeningsprogram, hvor alle patienter repræsenterer asymptomatiske kontroller. Alle serumprøver, uanset indsamling kilde, blev bearbejdet med den samme protokol; blod blev opsamlet i 10cc Vacutainer serumseparatorrør (SST) og fik lov til at sidde i 30 minutter til 4 timer ved stuetemperatur. Rørene blev centrifugeret ved 1200 x g i 10 minutter, derefter opdelt i flere 1-ml alikvoter af serum og opbevares ved -80 grader Celsius. Før anvendelse hver 1-ml hætteglas med serum blev optøet på is, opdelt i flere 110 mikroliter subaliquots, og lagres tilbage på -80 grader Celsius.

peritonealvæske blev opsamlet i en steril vakuum-forseglet beholder på operationsstuen ved kirurgisk personale. Anvendelse af en steril 1cc sprøjte, 20.000 enheder heparin (hætteglas indeholder 10.000 enheder pr cc) blev tilsat til hver liter væske til at forhindre dannelsen af ​​blodpropper. I laboratoriet blev fluidet overført til koniske centrifugerør (50cc eller 250cc afhængigt væskevolumen) og centrifugeret i en balanceret centrifuge ved 2000 rpm i 5 minutter for at pelletere den cellulære komponent. Cellefri supernatant blev overført til en 50cc konisk rør og fem 1,5 ml mikrocentrifugerør til opbevaring ved -80 fryser grader Celsius.

Udvælgelse af prøver til discovery eksperimenter

Kun post-menopausale kvinder, der har gennemsnitlig risiko for ovarie eller brystcancer blev inkluderet (gennemsnitlig risiko betyder ingen signifikant familiehistorie med bryst- eller ovariecancer og ingen tidligere kræftdiagnose) i opdagelsen eksperimenter. De første serum opdagelse eksperiment sammenlignede kvinder med sent tidspunkt SOC til HA kontrol, og det andet i forhold til kvinder med BST. SOC puljer af størrelse 4 (til raske kontrolpersoner) og størrelse 5 (til BST) blev udvalgt til at være tæt matchet kontrol baseret på alder (+/- 2 år), prøve opbevaringstid (+/- 1 år) og HRT [35 ]. Desuden fordi indsamlingen miljø har en kendt effekt på serum proteom [37], cases og kontroller blev også matchede baseret på, om blodtapning opstod operationsdagen (for SOC versus kontrol BST), eller om de blev indsamlet tre eller flere dage før kirurgi (for SOC versus HA kontroller). For de peritoneale fluid forsøg blev en pulje af størrelse 10 SOC prøver sammenlignet med en pulje af størrelse 4 BST prøver. Puljen størrelse for BST er mindre, fordi, mens en stor del af SOC patienter udvikler ascites, få BST patienter producerer sammenlignelige ascitesvæske.

Udvælgelse af serumprøver for validering eksperimenter

Forsøg at validere proteiner blev udført for to markører i tre tidligere beskrevne [32], [33] sæt serumprøver. Disse sæt omfattede to filtrering sæt. Det første sæt var sammensat af puljede prøver fra 50 OC patienter (tilfælde pool) serielt fortyndet med serum fra 9 HA kontroller (kontrol pool). Det andet sæt bestod af individuelle prøver fra 12 OC patienter og 12 HA kontroller. En tredje større sæt af individuelle prøver blev anvendt til at bekræfte proteiner, der viste signifikant forhøjelse i det andet sæt. Fordøjelse blev udført natten over ved 37 ° C.

Be the first to comment

Leave a Reply