PLoS ONE: Funktionel Screening Identificerer miRNA Påvirkning Apoptose og spredning i kolorektal Cancer

Abstrakt

MikroRNA’er (miRNA) spiller en afgørende rolle i mange biologiske processer og er afvigende udtrykt i humane kræftformer. Særlig miRNA funktion enten som tumorsuppressorer eller onkogener og synes at have diagnostisk og prognostisk betydning. Selvom mange miRNA er dys-reguleret i kolorektal cancer (CRC) kun en lille brøkdel er blevet karakteriseret funktionelt. Brug high-throughput funktionel screening og miRNA profilering af kliniske prøver den foreliggende undersøgelse sigter mod at identificere miRNA vigtigt for kontrollen af ​​cellevækst og /eller apoptose i CRC. Den high-throughput funktionelle screening blev udført i seks CRC-cellelinier transficeret med et på forhånd miR bibliotek inklusive 319 syntetisk humant præ-Mirs. Fænotypiske ændringer blev evalueret ved immunfarvning af spaltet cPARP (apoptose) eller MKI67 (proliferation). Desuden blev TaqMan Menneskelig MicroRNA Array Indstil v2.0 bruges til at profilere ekspressionen af ​​667 miRNA i 14 normal colon mucosa og 46 mikrosatellit stabile stadie II CRC patienter. Blandt de miRNA, der inducerede vækst anholdelse og apoptose i CRC-cellelinjer, og på samme tid var dys-reguleret i de kliniske prøver blev miR-375 udvalgt til yderligere analyse. Uafhængig

in vitro

analyse af forbigående og stabile transfekterede CRC cellelinjer bekræftede, at miR-375 reducerer cellernes levedygtighed gennem induktion af apoptotisk død. Vi identificerede YAP1 som en direkte miR-375 mål i CRC og viser, at HELLS og NOLC1 er ned-stream mål. Knock-down af YAP1 efterlignede fænotype fremkaldt af miR-375 overekspression indikerer, at miR-375 sandsynligvis udøver sin pro-apoptotisk rolle gennem YAP1 og dets anti-apoptotiske down-stream mål BIRC5 og BCL2L1. Endelig

in vivo

analyse af muse xenotransplantattumorer viste, at miR-375-ekspression betydeligt reduceret tumorvækst. Vi konkluderer, at high-throughput screening held identificerede miRNA, der inducerer apoptose og /eller inhiberer proliferation i CRC-celler. Endelig kombinerer den funktionelle screening med profilering af CRC vævsprøver vi identificeret klinisk relevante miRNA og miRNA mål i CRC

Henvisning:. Christensen LL, Holm A, Rantala J, Kallioniemi O, Rasmussen MH, Ostenfeld MS, et al. (2014) Funktionel Screening Identificerer miRNA Påvirkning Apoptose og spredning i kolorektal cancer. PLoS ONE 9 (6): e96767. doi: 10,1371 /journal.pone.0096767

Redaktør: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina

Modtaget: Juli 24, 2013; Accepteret 11. april 2014 Udgivet: 3 juni 2014

Copyright: © 2014 Christensen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af dansk Højteknologifonden, John og Birthe Meyers Fond, dansk Frie Forskningsråd (Medical Sciences), dansk strategiske Forskningsråd, Lundbeckfonden og den Europæiske Unions syvende rammeprogram (SYSCOL HEALTH-F5 -2.010-258.236). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kolorektal cancer (CRC) er en almindelig ondartet sygdom og en førende dødsårsag kræft verdensplan. Livstidsrisikoen er omkring 5% og stigende [1]. CRC er forårsaget af ophobning af talrige genetiske og epigenetiske ændringer. Kromosomal ustabilitet fører til allel ubalance udgør 70-85% af tumorerne mens 20-15% har DNA mismatch reparation defekter, der fører til mikrosatellit ustabilitet. De molekylære ændringer i CRC er blevet intensivt undersøgt for at finde diagnostiske og prognostiske markører. Blandt andet har mRNA-ekspression profilering været meget anvendt til at identificere differentielt udtrykte gener med prognostiske og diagnostiske implikationer. Men på nuværende tidspunkt ingen af ​​disse er blevet oversat, til klinisk praksis og dermed er der stadig behov for yderligere molekylær karakterisering og klassificering af CRC.

MikroRNA’er (miRNA) omfatter en rigelig klasse af små (19-24 nt), ikke-kodende regulerende RNA-molekyler [2]. De spiller en kritisk rolle i reguleringen af ​​genekspression ved post-transkriptionel niveau ved komplementær binding af miRNA-strengen til mRNA’et målsekvensen, hvilket fører til enten mRNA nedbrydning eller translationel inhibering [3]. Mere end 60% af alle protein-kodende gener indeholder konserverede miRNA bindingssteder og er således potentielle mål for miRNA [4]. MiRNA har vist sig at være involveret i mange biologiske processer, såsom celleproliferation, apoptose, differentiering og angiogenese [5] – [7]. På nuværende tidspunkt har miRNA vist sig at spille en vigtig rolle i mange typer af cancere (gennemgået af Garzon et al. [8]). Rolle miRNA i udviklingen af ​​CRC er blevet intensivt undersøgt. I 2006 Cummins og medarbejdere udgav den første detaljerede og systematisk analyse af miRNA-ekspression i CRC, viser op og ned regulering af specifikke miRNA [9]. Siden da flere undersøgelser har bekræftet den dys-regulering af miRNA i CRC [10] – [15]. Alligevel vor viden om funktionen af ​​de enkelte miRNA er begrænset til et forholdsvis lille antal miRNA. Funktionel screening har været brugt til at identificere miRNA, der er kausalt knyttet til specifikke fænotyper (anmeldt af Izumiya et al. [16]). I CRC, er funktionel screening været brugt i nogle få tilfælde at identificere miRNA påvirker celledeling og død [17], [18]. Men den undersøgelse udført af Nakano et al. blev udført i kun én celle linje og deres fund blev ikke korreleret til udtryk for miRNA i kliniske CRC prøver. Endelig har funktionel screening identificeret klinisk relevante miRNA i pancreas og testikelkræft kimcelletumorer [19], [20].

anerkendte diagnostiske og prognostiske potentiale miRNA og et behov for yderligere systematiske funktionelle analyser af miRNA i CRC opfordrede os til at kombinere high-throughput funktionel screening med miRNA udtryk profilering i kliniske prøver. Ektopisk udtryk for 319 miRNA i 6 forskellige CRC-cellelinjer blev kombineret med miRNA udtryk profilering af 14 normal colon mucosa og 46 kolorektale tumorer. Disse analyser identificeret en række miRNA, der blev vist at være udtrykkes forskelligt i CRC og at have en indvirkning på celleproliferation og /eller apoptose

in vitro

. Blandt dem miR-375 blev udvalgt til yderligere

in vitro

in vivo

analyser, som bekræftede, at miR-375 reducerer tumorvækst gennem induktion af apoptotisk død. For at identificere potentielle miR-375 mRNA henvender udtryk for miR-375 blev korreleret til genom-dækkende mRNA ekspression profiler. Korrelation analyse af både

in vitro

modelsystemer og kliniske CRC prøver viste, at ekspressionen af ​​Ja-associeret protein 1 (YAP1) var negativt korreleret til miR-375. Ago2 immunpræcipitering viste, at YAP1 er en direkte MIR-375 mål i CRC. Yderligere funktionelle undersøgelser viste, at pro-apoptotiske rolle miR-375 sandsynligvis medieres af YAP1 og dens anti-apoptotiske nedstrøms mål BIRC5 og BCL2L. Endelig blev lymfoid-specifikke helicase (HELLS) og nucleolar og coiled-organ fosfor protein 1 (NOLC1) identificeret som nedstrøms mål for MIR-375 potentielt spille en rolle i cellecyklus regulering pathways.

Materialer og metoder

En komplet beskrivelse af de materialer og metoder findes i supplerende materiale (metoder S1).

Etik Statement

anvendelse af menneskelige vævsprøver til forskning formål blev godkendt af Research Board på Walter og Eliza Hall Institute of Medical Research HREC (Kohorte 1 AUS, HREC Ingen 12/19), den etiske komité ved universitetet i pommerske (Kohorte 1 POL, BN-001/174/05) , Region Midtjylland udvalgene vedrørende Biomedical Research Ethics (Kohorte 1 DK, 1999/4678) og Region Syddanmark udvalgene vedrørende Biomedical Research Ethics (Kohorte 2 DK, VF-20.040.047). Informeret skriftlig tilladelse blev givet af alle deltagere. Alle eksperimenter dyr blev godkendt af Dansk Dyreforsøgstilsynet (journalnummer: 2013-15-2934-00861 /ACHOV)

Kliniske prøver og cellelinier

Kohorte 1 bestod af i alt 46 frisk frosset mikrosatellit stabil (MSS), primære fase II (T2-4, N0, M0) CRC’er og 14 normal colon mucosa. En uafhængig kohorte bestående af 25 normal colon mucosa og 63 MSS, primære fase I-IV (T2-4, N0-3, M0 /1) CRC’er (kohorte 2) blev anvendt til validering. Patienter og prøve egenskaber er sammenfattet i Tabel 1. Cellelinjer, vækstbetingelser og cellelinje godkendelse kan findes i den supplerende materiale (Metoder S1).

Dyr

BALB /cAnNTac -nude immune deficiente mus (6-8 uger, 20-22 g) blev erhvervet fra Taconic Europe (DK-4623 Ll. Skensved, Danmark). Forud for forsøgene blev musene gav en prøvetid på mindst 14 dage. Musene blev fastholdt på identiske betingelser (dvs. konstant rumtemperatur (22 ° C) og en naturlig dag /nat lys cyklus. Standard laboratorie mad og vand blev leveret ad libitum.

miRNA funktionelt bibliotek skærm

cellen spot microarray teknologi blev anvendt til at generere høj densitet pre-miRNA transfektions microarrays som tidligere beskrevet med mindre modifikationer [21]. Kort fortalt, et bibliotek holder 319 syntetisk humant pre-miRNA (Ambion pre-miR v1.0) (Ambion , Austin, TX, USA) blev anvendt til trykning af grupperingerne. Efterfølgende CRC celler (HCT116, LS174T TR4, DLD1 TR7, HT29, Caco2 og SW480) podedes på grupperingerne og revers transficeret i 48 timer. for at tillade mikroskopisk påvisning af præ-miRNA effekter påvirker celleproliferation og /eller apoptose arrayene blev immunfarvet for Ki-67 (proliferationsmarkør) og for spaltede poly ADP-ribose polymerase (cPARP) (apoptose markør). DNA blev farvet under anvendelse af 4 ‘, 6 diamidino -2-phenylindol (DAPI) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) eller SYTO60 (Invitrogen). Den microarray analyse blev udført med mikroskopisk billeddannelse af arrayene ved hjælp scanR højt indhold imager (Olympus) og virkningen af ​​miRNA over-ekspression på apoptose og celleproliferation blev betragtet som tidligere beskrevet [21]. Kort fortalt, efter normalisering en z-score (z = (χ-μ) /σ) blev beregnet til scoring af de målte spot værdier. χ = normaliseret spot niveau værdi, μ = global matrix betyder, og σ = standardafvigelse (SD)

RNA og miRNA isolation

Total RNA ( 200 baser). blev isoleret fra cellepellets og frisk frosset vævsprøve ved anvendelse RNeasy Mini Kit (Qiagen) ifølge producentens instruktioner. De små RNA’er ( 200 baser) blev udvundet fra gennemløbsfraktionen hjælp RNeasy Micro Kit sammen med RNeasy MinElute spin-søjler (Qiagen) (beskrevet i supplerende materiale (Methods S1)). De små RNA fra RNAlater bevarede vævsprøver blev isoleret direkte ved hjælp af RNeasy Micro Kit (Qiagen).

miRNA profilering i kliniske prøver

miRNA udtryk profilering blev udført ved hjælp af stilken loop RT qPCR baseret TaqMan Menneskelig MicroRNA Array Indstil v2.0, som angivet af fabrikanten (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) [22]. Den NormFinder algoritme blev anvendt til at identificere egnede reference- gener [23].

miRNA og mRNA RT-qPCR

Single rør TaqMan microRNA eller mRNA analyser (Applied Biosystems) blev anvendt til at kvantificere de enkelte modne miRNA eller mRNA (detaljer i supplerende materiale (Metoder S1)). Applied Biosystems TaqMan Assay ID’er og primeren anvendt til detektion af mRNA henvisning genet ubiquitin C (UBC) er anført i tabel S1 i File S1.

MTT assay

Celler blev podet i 96 -Nå plader, reverse-transficeret og inkuberes i 72 timer med præ-Mirs eller siRNAs. Cellelevedygtighed /proliferation blev målt ved anvendelse af 3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) assay (Roche Applied Science, Penzberg, Tyskland) (beskrevet i supplerende materiale (Methods S1)). De Applied Biosystems pre-mir og

Silencer

Vælg siRNA ID’er og sekvenser af YAP1 siRNAs fra GenePharma (Shanghai, Kina) er anført i tabel S2 i File S1.

LDH assay

Celler blev podet i plader med 96 brønde og revers-transficeret i 48 eller 72 timer med præ-Mirs eller siRNA’er (tabel S2 i File S1) (yderligere oplysninger findes i supplerende materiale (Methods S1)). Efterfølgende blev celledød (LDH aktivitet) målt ved hjælp af Cytotoksicitet Detection Kit

PLUS (LDH) (Roche Applied Science).

Caspase 3/7 aktivitet assay

Caspase 3 /7 aktivitetsassay blev anvendt til måling apoptotisk død og hovedsageligt udføres som tidligere [24] beskrevne. Kort fortalt blev cellerne podet i plader med 24 brønde og revers-transficeret med præ-Mirs eller siRNA’er i 48 timer (tabel S2 i File S1). Caspase 3/7 inhibitor (z-DEVD-fmk) (BioVision, San Francisco, CA, USA) blev tilsat 6 timer efter transfektion (slutkoncentration 25 uM). Caspase 3/7 aktivitet i cellelysater målt ved frigivelse af AFC (excitation, 400 nm; emission 489 nm) fra substratet Ac-DEVD-AFC (Biomol, Plymouth Meeting, PA, USA), blev målt ved anvendelse af en multiplate læser ; Multiscan MCC /340 (ThermoFisher Scientific).

Laser Capture mikrodissektion

Laser Capture mikrodissektion (LCM) blev udført på kryosektioner fra parret kræft og tilstødende normale kolon mucosa biopsier (beskrevet i detaljer i den supplerende materiale (Methods S1)). De epitelceller blev fanget på individuelle hætter med Veritas 704 mikrodissektion Instrument (Applied Biosystems) ved hjælp af ultraviolet laserskæring ifølge instruktionerne fra producenten.

MIR-375 methylering niveauer i CRC cellelinjer og kliniske prøver

Bisulfite modificeret DNA var hele genomet forstærkes og hybridiseret til Infinium HumanMethylation450 BeadChips (Illumina, San Diego, Californien) natten over som beskrevet af producenten. BeadChips blev scannet med en BeadXpress Reader instrument (Illumina) og analyseres data ved brug Bead Studio Methvlerinq Modul Software (Illumina). Methylering niveauer blev leveret i beta-værdier, med en beta-værdi på 0 svarer til ingen methylering, og en, der svarer til fuld methylering. De id’er for de CpG steder i umiddelbar nærhed af

MIR-375

var som følger CpG1; cg00215432, CPG2; cg00218620, CpG3; cg00705280, CpG4; cg02257674, CpG5; cg04348419, CpG6; cg06214770, CpG7; cg14358282, CpG8; cg21615583, CpG9; cg22306928, CpG10; cg01822124 og CpG11; cg26394220.

chip analyse

Chippen analyse blev udført som beskrevet tidligere [25]. De anvendte primere til at forstærke chip DNA-regioner er anført i tabel S1 i File S1.

Identifikation af potentielle miR-375 mål på grundlag af mRNA profilering og

i silico

mål forudsigelse

mRNA profilering af mIR-375 transficerede HCT116-celler og de kliniske prøver er beskrevet i supplerende materiale (Methods S1). Placeringen og antallet af miR-375 frø sekvenser (dvs. komplementære til stillingen 2-8 i miRNA) inden den fulde længde mRNA sekvens blev kortlagt ved hjælp af sekvens data hentet fra Targetscan V5.2 og Ensembl 62 databaser [26], [27 ].

Ago2 immunoprecipitation

Scr og miR-375 transficeret celle (~3.5 × 10

6), blev skrabet af dyrkningskolber på is i blid lysis buffer (20 mM TRIS pH 7,5 , 10 mM NaCl, 0,5% NP-40, 2 mM EDTA suppleret med RNase inhibitor RNaseOut (Invitrogen) og Complete Mini Protease inhibitor Cocktail (Roche)) og hypertonically lyseret ved at forøge NaCl-koncentrationen til 150 mM. Efter centrifugering ved 4 ° C og 19.000 * g i 10 minutter blev supernatanten opsamlet og udsat for immunopræcipitation (10% blev anvendt til input kontrol) ved inkubering med monoklonalt Ago2 antistof (11A9) (Sigma-Aldrich) -bundet Protein G-koblet magnetiske Dynabeads (Life Technologies) (15 mg 11A9 pr 25 ml perler) ifølge producentens anbefaling. Anti-FLAG immunfældning blev udført parallelt som en negativ kontrol (antistof F1804, Sigma). Perlerne blev vasket 5 gange i iskold vaskebuffer (50 mM TRIS pH 7,5, 150 mM NaCl og 0,05% NP-40). Total RNA fra input blev Ago2-IP og FLAG-IP komplekser oprenset under anvendelse QIAZol (Qiagen).

Ingenuity Pathway Analyse

Ingenuity Pathway Analysis (IPA) software (Ingenuity Systems, Redwood City, CA, USA) blev anvendt til at få indsigt i de overordnede biologiske ændringer, som ektopisk udtryk for miR-375. Normaliserede og filtrerede mRNA data blev uploadet til IPA. Brug af Ingenuity Pathways Knowledge Base (IPKB) hvert gen blev knyttet til bestemte funktioner, veje og sygdomme og en berigelse analyse blev udført at undersøge, om de data, der blev beriget for gener forbundet med en bestemt funktion. Fishers eksakte test blev anvendt til at vurdere betydningen af ​​de berigelser

Protein udvinding og Western blotting

Protein ekstraktion og Western blotting-analyse blev udført i overensstemmelse med standardprocedurer (detaljer i supplerende materiale (Metoder S1) ).

Konstruktion af plasmider til Luciferase reporter assay

Valgte fragmenter af 3’UTRs af HELLS (NM_018063) og NOLC1 (NM_004741) indeholdende formodede miR-375 bindende steder blev amplificeret fra normal humant genomisk DNA og klonet nedstrøms for

Renilla

luciferasegenet i siCHECK-2-vektoren (Promega, Fitchburg, WI, USA). Udvalgte konstruktioner blev muteret i den formodede miRNA bindende region hjælp QuickChange Lightning mutagenese Kit (Agilent Technologies) ifølge den billede protokol. Nærmere oplysninger herom findes i den supplerende materiale (Metoder S1) og de anvendte primere til kloning og mutagenese er beskrevet i tabel S3 i File S1.

Luciferase reporter assay

Transficerede HEK-293T-celler blev analyseret ved anvendelse Dual Glo Luciferase Assay System (Promega) som beskrevet tidligere [28] (detaljer er beskrevet i supplerende materiale (Methods S1)). Luminescens blev detekteret med en multiplate læser; Multiscan MCC /340 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA).

Renilla

Luciferaseaktivitet var normaliseret til

Firefly

Luciferaseaktivitet for hver transficeret godt, for at korrigere for forskelle i transfektion og høst effektivitet.

Generation og karakterisering af stabile HCT116 celler med inducerbar mIR-375-ekspression

Dannelsen af ​​stabile HCT116 celler med inducerbar ekspression af mIR-375 er beskrevet i detaljer i supplerende materiale (Methods S1). Indledningsvis

MIR-375

blev klonet i 3’UTR region af

turbo rød fluorescens proteingenet

(TRFP) i pSBInducer10 vektoren (

MIR375

_pSBInducer10). Den pSBInducer10 vektor blev konstrueret ved at erstatte lentivirale elementer i pINDUCER vektoren [29] med SleepingBeauty inverterede terminale gentagelser. Stabile HCT116_miR-375 og HCT116_Scr cellepuljer blev dannet som følger. For det første, 1,5 × 10

6 HCT116 celler blev transficeret med pCMV-SB100XCO (vektor med transposasen) og enten

MIR375

_pSBInducer10 (HCT116_miR-375) eller

Scr

_pSBInducer10 (HCT116_scr). Otteogfyrre timer efter transfektion puromycin (slutkoncentration 1 ug /ml) (Sigma) blev tilsat til at selektere for stabilt transficerede celler. Udvælgelsen puromycin blev udført i 5 dage. Efterfølgende blev cellerne behandlet med 50 ug /ml doxycyclin (DOX) (Sigma) i 48 timer fører til transskriptionel aktivering af tRFP-

MIR375

kassette. TRFP fluorescens markør blev anvendt som et surrogat for at sortere til cellepopulationer, der udtrykker det højeste niveau MIR-375 efter induktion af dox. Kort fortalt blev cellerne med den højeste TRFP plan (100-1000 gange over baggrundsniveauet i ubehandlede celler) (HCT116_miR-375H og HCT116_ScrH) isoleret ved fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) under anvendelse af en 4-laser FACSAriaIII (BD Biosciences, San Jose, CA) og anvendes til alle efterfølgende analyser. Dox afhængig ekspression af modent MIR-375 i HCT116_miR-375H-celler blev analyseret ved anvendelse af RT-qPCR som beskriver tidligere. De HCT116_miR-375H celler fænotypisk karakteriseret ved hjælp xCELLigence (Roche Applied Science), Caspase 3/7 assays og YAP1 Western blotting (detaljer i supplerende materiale (Metoder S1)).

In vivo

tumorvækst analyse

HCT116_miR-375H-celler (3,5 x 10

6 celler pr injektion) blev suspenderet i 200 pi PBS og injiceret subkutant i den venstre flanke af bedøvede mus (n = 12). Musene blev inddelt i to grupper med 6 dyr i hver: Gruppe A; miR-375 (+ dox) og Gruppe B; kontrol (- dox). Tumorerne blev målt regelmæssigt (længde og bredde) af samme observatør. For at inducere ekspression af MIR-375, blev dox (Vibradox Sandoz) (0,2 mg /ml) tilsat til drikkevandet af musene i gruppe A, når tumorerne nåede en størrelse på cirka 50 mm

3. Musene i gruppe B fik almindeligt drikkevand. Den dox behandling blev udført i 14 dage. Fire mus blev taget ud af undersøgelsen før dox behandling (to havde meget hurtigt voksende tumorer og to havde tumorer, der stoppede voksende) dvs. n = 4 i gruppe A og B. Den estimerede tumorvolumen (EV) blev beregnet som VE = længde × (bredde)

2 × 1/2. EV blev plottet mod antallet af dage efter påbegyndelse af DOX behandling og xenograft vækstkurver blev dannet.

Statistisk analyse

Betydningen af ​​miRNA ekspressions ændringer blev analyseret ved anvendelse af Mann Whitney U test i Multi Experiment Viewer (MeV) matrix analysator software [30]. Den hierarkiske gruppering af differentielt udtrykte miRNA blev udført ved hjælp af Gene Cluster 3.0 [31]. Kun blev miRNA, der blev udtrykt i mere end 80% af prøverne indeholdt. Heat kort blev genereret med Java TreeView [32]. Students uparrede

t

-test blev anvendt til at sammenligne miRNA inducerede ændringer med respektive kontrol i MTT-analysen, LDH assay, Apoptosis assay, RT-qPCR analyse og

in vivo

tumorvækst analyse. Den studerendes parret t-test blev anvendt til RT-qPCR analyse af Mikrodissekterede vævsprøver. En

s

-værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

High-throughput screening identificerer en række miRNA, der inducerer apoptose og /eller hæmmer proliferation i CRC celle. linjer

for at identificere miRNA med den mest konsekvente indvirkning på vækst og /eller overlevelse af CRC cancerceller vi udførte en high-throughput screening i seks CRC-cellelinjer, ved hjælp af en bibliotek holder 319 syntetisk humant pre-miRNA. Pre-miR inducerede ændringer i cPARP og Ki-67 blev anvendt til at identificere miRNA som inducerede apoptose og /eller inhibere proliferation henholdsvis. Fordelinger af Z-scorer for hver præ-miR er vist i figur S1. De z-score rang produkter blev anvendt til at identificere sammenhængen i de pre-miRNA virkninger på tværs af alle testede CRC cellelinjer [33]. Den rang produkt Top-40 pre-Mirs er anført i tabel S4 i File S2 (øget cPARP) og tabel S5 i File S2 (reduceret Ki-67). Flere af top 40 rangerede miRNA har tidligere vist sig at påvirke hverken apoptose og /eller proliferation

in vitro

(en undergruppe af disse er vist i Tabel S6 i File S1).

miRNA udtryk profilering af kliniske prøver

for at løse

in vivo s

ignificance af miRNA identificeret i high-throughput funktionelle screening vi profileret udtryk for 667 unikke miRNA i 14 normal colon mucosa og væv prøver fra 46 kliniske fase II CRC prøver. I alt blev 53 miRNA differentielt udtrykt mellem normal slimhinde og CRC (Mann Whitney U test p≤0.01 og 1.5≤FC

(log2) ≤-1,5) (figur 1 og tabel 2). En delmængde af 25 miRNA viste øget udtryk i CRC tumorer i forhold til normal slimhinde mens 28 miRNA blev nedreguleret i CRC tumorer. Kombinere resultaterne af miRNA profilering af kliniske prøver med resultaterne af high-throughput funktionelle screening identificerede vi 10 miRNA som blev differentielt udtrykt i kliniske CRC prøver og samtidig inducerede fænotypiske ændringer i den funktionelle screening (Top-40 rangeret) (tabel 2 og tabel S6 i File S1). Derudover otte dys-regulerede miRNA inducerede fænotypiske ændringer i mindst en cellelinje, men var ikke Top-40 rangeret (tabel 2). Elleve af de ovennævnte miRNA blev nedreguleret, og dermed disse miRNA er tumor suppressor kandidater. Endelig 20 af dys-regulerede miRNA blev ikke medtaget i den præ-miRNA bibliotek fra Ambion og dermed deres evne til at fremkalde fænotypiske ændringer kan ikke analyseres i nærværende undersøgelse (tabel 2). Afslutningsvis vi identificeret 11 miRNA, der blev nedreguleret i CRC prøver og samtidig inducerede proliferation og /eller inhiberes apoptose i CRC cellelinier og dermed disse miRNA potentielt involveret i colorektal tumorigenese.

Hierarkisk klyngedannelse af miRNA med en signifikant forskellig udtryk mellem kolorektale adenokarcinomer og normale kolon mucosa prøver (p≤0.01). Rækkerne repræsenterer individuelle miRNA og søjlerne repræsenterer individuelle vævsprøver. Skalaen repræsenterer intensiteten af ​​genekspression (log2 skala, der går mellem -2,98 og 2,98) (p-værdier og FCS findes i tabel 2). De miRNA markeret med blå viste sig at hæmme proliferation og /eller inducere apoptose i high-throughput skærm (Top-40 rangeret miRNA).

Validering af fænotyper identificeret i høj- throughput screen

for at validere de identificerede fænotyper, de miRNA, der blev nedreguleret i kliniske prøver og Top-40 klassificeret i fænotype skærmen (miR-150, MIR-375, miR23b, mir-138, miR- 139-5p og miR-9) blev udsat for detaljeret funktionel analyse ved hjælp HCT116, HT29, LS174T TR4, DLD1 TR7 og SW480 tyktarmskræft cellelinjer. Vi har for nylig offentliggjort en detaljeret funktionel analyse af miR-139-5p og dermed miR-139-5p ikke var inkluderet i disse analyser [25]. Den ektopiske ekspression af MIR-375, MIR-9 og MIR-138 signifikant reduceret levedygtighed mere end en cellelinje (MTT reduktion 20% og p ≤ 0,05) (figur 2A (HCT116) og figur S2), mulig på grund til en generel antiproliferativ eller pro-apoptotiske rolle disse miRNA. MIR-150 og MIR-23b kun reduceret levedygtighed én cellelinje (DLD1 TR7). Blandt de resterende miRNA blev MIR-375 identificeret som et apoptoseinducerende miRNA i high-throughput screen. For at validere dette resultat, vi udført LDH og Caspase 3/7 analyser i transfekterede CRC cellelinjer. MIR-375 forøgede Caspase 3/7 aktivitet og demonstreret sammenfaldende stigning i celledød (LDH-frigivelse) i både HCT116 og DLD1 TR7 (figurerne 2B og C, og figur S3). Endvidere kunne apoptotisk død induceret af MIR-375 inhiberes med z-DEVD-fmk (caspase 3/7 inhibitor) (figur 2D) som viser, at apoptose er afhængige af Caspase 3/7 aktivitet. Afslutningsvis valideringen analyse bekræftede antiproliferativ rolle MIR-9 og MIR-138, og den apoptoseinducerende kapacitet MIR-375 som identificeret i high-throughput analyse. Ovenstående miRNA har tidligere vist sig at være dys-regulerede i humane cancere og reducere proliferation og /eller inducere apoptose

in vitro

(tabel S6 i File S1). MIR-375 og MIR-138 er ikke blevet funktionelt karakteriseret i detaljer i CRC. Endelig miR-375, miR-138 og miR-9 blev udvalgt til yderligere analyse på grund af deres nedregulering i kliniske prøver og deres evne til induceret fænotypiske ændringer

in vitro

.

( A) Cellulær levedygtighed (MTT-assay): data er præsenteret som ± SD. af mindst 3 uafhængige forsøg med hver tre biologiske gentagelser og normaliserede til Scr. * P-værdi 0,05 og MTT reduktion 20%. (B) celledød (LDH-frigivelse-assay): Det cellulære død blev udtrykt som procentdel af frigivet LDH ud af totalt cellulært LDH. Mindst to uafhængige forsøg blev udført og udføres tredobbelt. Resultatet af en repræsentativ eksperimenter ± sd. er vist. * P-værdi 0,05. (C) Induktion af apoptose (Caspase 3/7 aktivitet): Caspase 3/7 aktivitet i lysatet af forud miRNA transficerede celler blev undersøgt ved fluorometrisk kinetisk analyse og udtrykt i forhold til Caspase 3/7 aktivitet i “Scr” transficeret celler. Data er præsenteret som ± SD. af mindst 2 uafhængige forsøg med hver tre biologiske replikater. * P-værdi 0,05. (D) Inhibering af MIR-375 inducerede apoptose ved Caspase 3/7 inhibitor z-DEVD-fmk. Caspase 3/7 aktivitet blev målt som beskrevet i (C). Z-DEVD-fmk (DEVD) (25 uM) blev tilsat til cellerne seks timer efter transfektion. Ikke behandlede celler (NT), Lipofectamine kun (Lipo) og præ-mir miRNA precursormolekyler-Negative Control # 1 (SCR) blev inkluderet som negative kontroller i alle assays. De forud MIR-145 transficerede celler blev inkluderet som en positiv kontrol for udførelsen af ​​MTT-assayet. (E) Det nedregulering af MIR-375 er et resultat af reduceret ekspression i de epiteliale celler i tumoren. Ekspression af miR-375 i laser capture mikrodissekeres kolorektal cancer væv. Ekspressionen blev analyseret i epitel og stromaceller fra parrede colorektale adenocarcinomer (n = 3) og tilstødende normal (n = 3) colon mucosa LCM biopsier under anvendelse af RT-qPCR. Søjlerne repræsenterer betyde udtryk i tre prøver ± sd.

Påvisning af miR-375, miR-138 og miR-9 i laser mikrodissekeres kolorektal væv

For at belyse den cellulære oprindelse af miR-375, miR-138 og miR-9, målt vi deres udtryk i laser fanget mikrodissekeret kolorektale adenokarcinomer og tilstødende normal colon mucosa (Figur 2E og figur S4). Disse analyser viste, at MIR-375 i normal colon mucosa blev udtrykt på et højere niveau i epitelcellerne end i stromale celler (p = 0,02) (Figur 2E). Mens der i adenocarcinom miR-375 blev udtrykt på sammenlignelige niveauer i epitel og stromale celler (p = 0,27). Derudover MIR-375-ekspression i normale epitelceller var signifikant højere end den ekspression i epitelceller fra adenocarcinom (p = 0,03). Samlet indikerer disse resultater, at nedreguleringen af ​​MIR-375 i CRC er et resultat af en nedsættelse af MIR-375 ekspression i epitelceller i tumoren. MIR-9 og MIR-138 blev udtrykt primært af stromaceller fra både normal colon mucosa og adenocarcinomer (Figur S4). Disse resultater stemmer overens med tidligere offentliggjorte miRNA udtryk profiler af laser-mikrodissekeres normale slimhinde, adenomer og adenocarcinomer [34].