PLoS ONE: Måling NOTCH1 Aktivering i Cancer Brug Immunohistochemistry

Abstrakt

Faste, paraffinindlejrede (FPE) væv er en potentielt rig ressource for at studere rolle NOTCH1 i kræft og andre patologier, men test, der pålideligt opdage aktiveret NOTCH1 (NICD1) i FPE prøver har manglet. Her vil vi bygge bro over denne kløft ved at udvikle en immunhistokemisk (IHC) plet, der detekterer en neoepitop skabt af den proteolytiske spaltning begivenhed, der aktiverer NOTCH1. Efter validering ved hjælp xenotransplanterede kræft og normale væv med kendte mønstre af NOTCH1 aktivering, anvendt vi denne test til tumorer er forbundet med dysreguleret Notch signalering ved mutationsændringer undersøgelser. Som forventet blev hyppig NICD1 farvning observeret i T lymfoblastær leukæmi /lymfom, en tumor, hvor aktivering

NOTCH1

mutationer er almindelige. Men når IHC blev brugt til at måle NOTCH1 aktivering i andre menneskelige kræftformer, flere uventede fund opstod. Blandt B-celle tumorer, NICD1 farvning var langt hyppigere i kronisk lymfatisk leukæmi end det ville forudsiges på grundlag af hyppigheden af ​​

NOTCH1

mutationer, mens mantle celle lymfom og diffust storcellet B-celle lymfom viste ingen tegn på NOTCH1 aktivering. NICD1 blev også påvist i 38% af perifere T-celle lymfomer. Af interesse, blev NICD1 farvning i kronisk lymfatisk leukæmi celler og i angioimmunoblastisk lymfom konsekvent mere udtalt i lymfeknuder end i omkringliggende bløde væv, implicerer faktorer i nodal mikromiljø i NOTCH1 aktivering i disse sygdomme. Blandt carcinomer blev diffus stærk NICD1 farvning observeret i 3,8% af tilfældene af triple negativ brystkræft (3 af 78 tumorer), men var fraværende fra 151 ikke-småcellet karcinom og 147 ovariekarcinomer. Hyppig farvning af normalt endotel blev også observeret; i overensstemmelse med denne observation, blev stærk NICD1 farvning også set i 77% af angiosarcomer. Disse resultater supplerer indsigter fra genomiske sekventering undersøgelser og foreslå, at IHC-farvning er et værdifuldt eksperimentel værktøj, der kan være nyttige ved udvælgelse af patienter til kliniske forsøg

Henvisning:. Kluk MJ, Ashworth T, Wang H, Knoechel B, Mason EF, Morgan EA, et al. (2013) Måling NOTCH1 Aktivering i Cancer Brug Immunhistokemi. PLoS ONE 8 (6): e67306. doi: 10,1371 /journal.pone.0067306

Redaktør: Jose Angel Martinez Climent, Navarra Universitet, Center for Applied Medical Research, Spanien

Modtaget: April 1, 2013; Accepteret: 16 maj 2013; Udgivet: 18 juni 2013

Copyright: © 2013 Kluk et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Støttet af tilskud fra NIH og leukæmi og lymfom Society (JCA) og BWH Patologisk Institut Robbins Award (MJK). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende interesser: Medforfatter Jon Aster er en konsulent for Cell signaling Technologies, der fremstiller nogle af antistofreagenser, der er beskrevet i dette dokument. Alexander Stoeck, Sriram Sathayanrayanan, og Brian Haines er medarbejdere i Merck Oncology. Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om deling af data og materialer.

Introduktion

Notch receptorer deltager i en bevaret signalvej, der regulerer mange cellulære fænotyper, herunder celle skæbne , celledeling, og celleoverlevelse (for gennemgang, se [1]). Pattedyr har fire Notch gener (

NOTCH1

–

4

), hver med forskellige mønstre af udtryk og forskellige knockout fænotyper i mus. Canonical signalering gennem alle fire receptorer er afhængig af en række ligand-afhængige proteolytiske spaltninger, hvoraf den sidste er foretaget af et multisubunit protease kaldet gamma-sekretase, som spalter Notch receptorer i den indre halvdel receptorens transmembrane domæne. Dette frigiver det Notch intracellulære domæne, NiCd, der translokerer til kernen og danner en kortvarig transkriptionel aktivering kompleks.

Resultater fremstillet ved Notch signalering i normale celler varierer dramatisk med cellulær sammenhæng, formentlig fordi epigenetisk mønsterdannelse af genomer fører til varierede virkninger af NiCd på transkriptionel udgange. Genotypiske data fra mennesker og eksperimentelle resultater fra mus viser, at

NOTCH1

også har varieret roller i cancer, som enten et onkogen eller et tumorsuppressorgen afhængig cellulær kontekst. Gain-of-funktion mutationer af

NOTCH1

er almindelige i T lymfoblastær leukæmi /lymfom (T-LL) [2,3], og er også blevet beskrevet i delmængder af kronisk lymfatisk leukæmi (CLL) [4- 6], kappecellelymfom (MCL) [7], diffust storcellet B-celle lymfom [8], perifer T-celle lymfom (PTCL) [9], brystcancer [10], og ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) [ ,,,0],11]. Disse aktiverende mutationer indbefatter forskellige punktsubstitutioner, deletioner og translokationer, der producerer ligand-uafhængig NOTCH1 proteolyse og aktivering samt mutationer, der fjerner et C-terminalt PEST degron domæne og derved stabilisere NICD1. Desuden har data fra de dybe sekventering af kræft genomer identificeret hyppig mutation af gener, der koder Notch pathway komponenter i high-grade æggestokkene serøse carcinomer [12], selv om de funktionelle konsekvenser af disse mutationer på Notch signalering er usikker. Der er også tegn på, at NOTCH1 har vigtige funktionelle roller i endotel og andre stromale komponenter, der kan bidrage til den maligne opførsel af kræft [13,14]. Omvendt tab-af-funktion-mutationer fordelt over en stor del af

NOTCH1

locus er almindelige i pladecellecarcinomer af huden [15] og hoved og hals [16,17], og også forekomme i en mindre undergruppe af skælcellecarcinomer i lungen [15,18]. Tilsvarende tab af

notch1

funktion i vaskulær endotel fører til angiosarkom-lignende proliferationer i mus [19,20].

Der er interesse for terapeutisk målretning af NOTCH1 i kræft, hvor det har en onkogen rolle med antagonister såsom hæmmende antistoffer og gamma-sekretase hæmmere (GSI) [21]. Ideelt set ville sådanne forsøg fokus på behandling af patienter, hvis tumorer viser tegn på igangværende NOTCH1 aktivering. I betragtning af den store størrelse af

NOTCH1

locus og mangfoldigheden af ​​genetiske afvigelser, der producerer ligand-uafhængig aktivering af NOTCH1 eller stabilisere NICD1, genetisk screening for onkogen

NOTCH1

ændringer er udfordrende, især når du arbejder med arkivering FPE prøver. Desuden er der mistanke om ligand-medieret NOTCH1 aktivering bidrager også til tumorcellevækst og overlevelse, og sådanne tumorer ville gå uopdaget ved genetisk screening.

En ideel biomarkør test ville påvise NICD1 inden tumorceller direkte, uanset den underliggende mekanisme for NOTCH1 aktivering. Til dette formål har vi udviklet en robust, specifik immunhistokemiske (IHC) farvning metode, der detekterer NICD1 i arkivering prøver. Testen beror på et kommercielt kanin monoklonalt antistof, der tidligere kun anvendes i Western blot analyser, som er specifik for en neoepitop i NICD1 skabt ved gamma-sekretase-medieret proteolyse af NOTCH1, den hændelse, der udløser NOTCH1 signalering. Efter optimering og validering af testen med kræft implanteret bærer forskellige

NOTCH1

aberrationer og normale væv, vi screenede en stor serie af menneskelige kræft i ukendt

NOTCH1

mutationsstatus for aktiveret NOTCH1. De fleste T-LLs og CLLs viste tegn på igangværende NOTCH1 aktivering, ligesom mange perifere T-celle lymfomer og en lille delmængde triple-negative brystkræft. Aktivering af NOTCH1 blev også påvist i størstedelen af ​​angiosarcomer, i overensstemmelse med den observation, at NICD1 er let påviselig i normale endotelceller inden tumor stroma. Derimod blev lidt eller ingen NOTCH1 aktivering observeret i kappecellelymfom diffust storcellet B-celle lymfom, ikke-småcellet lungekræft, og ovariecancer. Disse resultater viser, at NOTCH1 aktivering blandt B-celle tumorer er både mere skarpt begrænset til og mere udbredt i CLL end det ville forudsiges fra tidligere genotypiske data, rejser spørgsmål om den foreslåede tumor undertrykkende rolle for NOTCH1 i vaskulære neoplasmer, og foreslå, at IHC test for NICD1 kan bruges til at vælge patienter til kliniske forsøg med Notch pathway hæmmere, især dem, der involverer patienter med tumorer såsom triple-negativ brystkræft, hvor NOTCH1 aktivering er begrænset til en lille delmængde af tumorer.

Materialer og Metoder

anvendelse af humane væv

Humane væv prøver blev godkendt til brug af Institutional Review Boards som følger. Alle væv involveret ved lymfoide neoplasmer (gem en) blev indsamlet og anvendes uden informeret samtykke under Brigham og kvinders Hospital IRB-protokol 2010-P002736. En ikke-småcellet lungekræft microarray blev konstrueret med væv fra patienter uden samtykke under Brigham og kvinders Hospital IRB-protokol 2006-P001929. En serøs æggestokkræft microarray blev konstrueret med væv fra patienter uden samtykke under Brigham and Women ‘s Hospital IRB-protokol 2006-P000321. En angiosarkom microarray blev konstrueret med væv fra patienter uden informeret samtykke under University of Texas M. D. Anderson Cancer Center IRB-protokol LAB04-0890. I hvert af disse tilfælde blev undersøgelserne givet afkald på samtykke på følgende grundlag: 1) prøver blev indsamlet retrospektivt fra patologi arkiver og førte fra rutinemæssige kirurgiske procedurer udført til diagnostiske formål; 2) patient identiteter blev anonymiseret og helt delinked fra entydige identifikatorer; og 3) var der ingen risiko for deltagerne (kun anonymiserede væv blev anvendt). En T-lymfoblastær lymfom prøve indsamlet som led i et forsøg med Merck GSI MK-0752 blev anvendt med det skriftligt informeret samtykke fra den berørte patient under Dana Farber /Partnere Cancer Center protokol 2004-P002170. En brystkræft microarray indeholder tredobbelt negative tumorer (negative for østrogen-receptor, progesteron receptor, og

HER2

forstærkning) blev konstrueret med væv fra patienter, der forudsat skriftligt informeret samtykke under Dana Farber Cancer Institute IRB-protokol 93-085.

Anvendelse af mus i xenografundersøgelser

REC-1 og KOPT-K1 celle subkutane xenografundersøgelser blev udført under Dana Farber Cancer Institute IACUC protokol 04-111. HCC1599, HCC1587, og MB-157 celle subkutane xenografundersøgelser blev udført under en protokol godkendt af IACUC på Merck Oncology. Animal arbejde blev udført i overensstemmelse med NIH retningslinjer. Alle xenograft-bærende dyr blev overvåget dagligt af veterinære personale for unormale adfærd /forhold, der kan kræve opmærksomhed for at minimere lidelse. Dyrene blev aflivet ved CO

2 kvælning pr anbefalingerne fra American Veterinary Medical Association. Alle dyr blev holdt i CO

2 i mindst 5 minutter efter ophør af respiratoriske bevægelser.

Cellelinier

cellelinier blev opnået fra American Tissue Culture Collection (REC-1, MAVER-1, HCC1599, HCC1587, og MB-157 celler) eller Leibniz-instituttet DSMZ-tyske samling af mikroorganismer og cellelinier (KOPT-K1).

Test udvikling og valideringsundersøgelser

Disse undersøgelser har påberåbt sig: 1) cellelinjer med mutationer i

NOTCH1 Hoteller, som producerer enten gevinst eller tab af NOTCH1 funktion, der blev dyrket som xenografter hos mus ; 2) normal human squamous slimhinder og thymus, hvor de anatomiske fordelinger af celler med aktiverede NOTCH1 kendes; og 3) en primær human T-ALL af kendt

NOTCH1

genotype (beskrevet nedenfor). Xenotransplanterede cellelinier og tilhørende

NOTCH1

genotyper er givet i tabel 1. Alle xenotransplanterede tumorer blev fikseret i en phosphatbufret opløsning indeholdende 10% formalin eller 4% paraformaldehyd (pladecellecarcinomer) og indlejret i paraffin, og blev hentet fra vævet arkiver enkelte laboratorier, hvor xenografundersøgelser blev gennemført som en del af andre undersøgelser. Knogler blev afkalkes efter formalin fiksering ved hjælp RDO Rapid Afkalkning Solution (Sigma, St. Louis, MO).

Cell Linje

tumortype

NOTCH1 Mutation

Effekt på NOTCH1 Signaling

reference

KOPT-K1T-LLL1600P /del (P) * Gain [3] REC-1MCLdel (ECN1) /del (P) * Gainthis papir /[7] MAVER-1MCLNoneN.A. [7] HCC1599Breast Carcinomadel (ECN1) Gain [10] MB-157Breast Carcinomadel (ECN1) GainUnpublished dataHCC1587Breast CarcinomaNoneN.A. [10] Tabel 1. Kræft implanteret og tilhørende forstærkning-of-funktion mutationer i NOTCH1.

* X /Y angiver parrede mutationer skabt af afvigelser i

cis

i samme

NOTCH1

alleledel (ECN1) angiver den nuværende af en deletion, der fjerner den kodende sekvens for det ekstracellulære domæne af NOTCH1del (P) angiver tilstedeværelsen af ​​rammeskift eller stopkodon mutationer, der fjerner den C-terminale NOTCH1 PEST degron domainT-LL, T lymfoblastisk leukæmi /lymfom; MCL, kappecellelymfom; N.A., ikke anvendelig CSV Hent CSV

Archival menneskelig kræft prøver

Alle FPE prøver blev anvendt efter godkendelsen af ​​institutionelle anmeldelse boards (se etiske udsagn). En primær T-ALL prøve kendt for at bære aktiverende mutationer i

NOTCH1

blev indsamlet som led i et klinisk forsøg af gamma-sekretase hæmmer MK-0754 hos patienter med recidiverende /refraktær T-ALL [22]. Archival “kasseret” T-LL, CLL, MCL, angiosarkom, og normale vævsprøver blev udvalgt fra paraffinindlejrede væv arkiver Brigham og kvinders Hospital udelukkende baseret på tilgængeligheden af ​​væv fikseret i 10% formalin eller B +, en buffer fiksativ med 3,7% formaldehyd og zinkchlorid, der er meget brugt til væv, der er involveret med lymfoide neoplasmer. FPE ikke-småcellet lungekræft [23], diffust storcellet B-celle lymfom [24], angiosarcom [25], og ovariecancer [26] prøver blev undersøgt ved farvning tidligere beskrevne væv microarrays. Et nyt væv microarray indeholdende et sæt af 78 triple negative brystcancere blev samlet som følger. Archival formalinfikserede, paraffinindlejrede brystkræft blev indsamlet og bedste blokke og bedste områder for udkerning blev identificeret og udvalgt af et bryst patolog (DD). Resultater af immunhistokemiske undersøgelser for østrogen (ER) og progesteron receptor (PR) og HER2 og FISH analyseresultater for HER2 blev udvundet fra patologi rapporter. Halvfjerds-otte triple negative (ER /PR /HER2 negative) invasive brystkræft blev identificeret med tilstrækkelig tumorvæv for væv microarray (TMA) bygning, som blev gennemført i Dana Farber /Harvard Cancer Center Tissue Microarray Core Facility. Tre 0,6 mm borekerner blev taget fra markerede områder og anbragt i en modtager blok ved hjælp af en manuel arrayer (Beecher Instruments).

Immunhistokemi

Standard 4-micron paraffinindlejret væv snit blev farvet ved hjælp af Ventana Benchmark XT platform (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ.) med udvidet varmeinduceret epitopgenfinding (CC1 Buffer). Slides blev inkuberet i 1 time ved stuetemperatur med anti-NICD1 kanin-monoklonalt antistof (klon D3B8, katalog # 4147, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, slutkoncentration, 8.5microgram /ml). Signaler blev derefter forstærket (Ventana Amplification Kit, # 760-080) og visualiseres (Ventana Ultraview Universal DAB afsløring kit, # 760-500) pr producentens anvisninger. Alle farvningskørsler omfattede to positive kontrolprøver (REC-1 celle xenograft og tonsillar slimhinder). Scoring blev udført ved to patologer (MJK, JCA). Farvning resultater blev også revideret med patologer med subspecialty ekspertise i hematopathology (MJK, JCA, GP, DD, EAM, EFM), lunge patologi (LC), gynækologisk patologi (MH), bryst patologi (DD), og blødt væv patologi (JH , aL), som alle også bidraget til sag udvælgelse.

NOTCH1

sekventering

DNA blev tilberedt af friske frosne prøver ved hjælp af QIAamp DNA Mini (Qiagen, Valencia, CA). Sanger sekventering af

NOTCH1

mutationsmønstre hotspots i et tilfælde af T-lymfoblastisk lymfom blev udført som beskrevet [3]; sekventering spor med analyseret med Mutation Surveyor Software (Softgenetics, State College, PA). Dyb sekventering af

NOTCH1

mutationsmønstre hotspots blev udført som følger. Primere er designet og valideret af Fluidigm (Fluidigm Corporation, San Francisco, CA) for exon 25-28 og 34 i

NOTCH1

pr anbefalede retningslinjer for Roche Titanium sekventering (Roche, Mannheim, Tyskland). I alt 2304 amplikoner der repræsenterer 48 unikke prøver amplificeret med 48 målspecifikke primerpar blev frembragt i hver sekventering løb. Hver primer inkluderet sample-specifikke Fluidigm 454 stregkode primer og adapter sekvenser. Reaktioner indeholdt 50 ng genomisk DNA, forlæns og baglæns mærkede amplifikationsprimere (1microM), forlæns og baglæns stregkode primere (400 nm), 1x Access Array indlæses Reagens, 1x FastStart High Fidelity Reaction Buffer, 4,5 mM MgCl

2, 5% DMSO , 0.05U FastStart High Fidelity Enzyme Blend og PCR-grade nukleotid mix (200microM, Roche). Termisk cykling blev udført på Fluidigm FC1 Cycler ifølge producentens retningslinjer. De resulterende biblioteker blev høstet og opsamlet på en mikrotiterplade, hvor de blev kvantificeret ved hjælp af Qubit® dsDNA BR Assay Kit på en Qubit® 2,0 Fluorometer (Invitrogen, UK). Biblioteker blev normaliseret og puljet før oprensning ved anvendelse Agencourt AMPure XP-system (Beckman, UK) ifølge producentens protokol. komponenter biblioteket blev klonalt opformeret ved anvendelse af GS Junior emPCR Lib-A Kit (Roche) ved at indtaste 1 molekyle bibliotek DNA pr capture bead. Pyrosequencing blev udført ved hjælp af GS Junior-systemet (Roche /454 Life Sciences).

For selektivt detektere codon 2514 del (CT) mutation i

NOTCH1

, en pyrosekventering assay blev udviklet. Kort beskrevet

NOTCH1

exon 34 målsekvens blev amplificeret i en PCR indeholdende 30 ng af genomisk DNA, et biotinyleret forward primer (5′-CTCCTCGCCTGTGGACAA) og en revers primer (5′-GGGACGAGCTGGACCACT) under anvendelse af følgende cyklusparametre: 94 ° C x 2 minutter efterfulgt 94 ° C x 30 sekunder, 62 ° C x 30 sekunder, 72 ° C x 30 sekunder i 45 cykler, efterfulgt af en endelig ekstension ved 72 ° C i 10 minutter. PCR-amplifikationsproduktet blev indfanget på streptavidin Sepharose-perler, denatureret, overføres til en pyrosekventering plade, annealet til en revers sekventeringsprimer (5 ‘CACTGGTCAGGGGACT 3’), og sekventeret pr en standardprotokol (PyroMark Q96 MD, Qiagen, Germantown, MD) . Beslutningen om at bruge en omvendt sekventeringsprimer var baseret på tilfældige tilstedeværelse af en kørsel af 3 G-rester umiddelbart 3 ‘for AG antisense codon 2514 mutation, der virker til at øge følsomheden af ​​assayet omtrent 3 gange. I tråd med denne forudsigelse, kontrol- undersøgelser under anvendelse cellelinien KOPT-K1, en T-LL-cellelinie med en heterozygot del (CT) kodon 2514 mutation [3], viste pålidelig detektering af denne sekvens variant ved fortynding ned til et niveau på 2,5% muterede alleler med DNA, der indeholder vildtype

NOTCH1

alleler.

Molekylær karakterisering af en intrageniske NOTCH1 Sletning i REC-1 celler

5 ‘ hurtig amplifikation af cDNA-ender (RACE) blev udført på RNA fremstillet fra REC-1-celler og kontrol DND-41 T-ALL-celler som beskrevet [27]. Genomisk DNA blev isoleret fra REC-1-celler under anvendelse af QIAamp genomisk DNA isolation kit (Qiagen, Valencia, CA). Exon1 sense (5′-CCTGCTCTGCCTGGCGCTG) og exon 28 (5’-CCACGAAGAACAGAAGCACA) antisense primere blev anvendt til amplifikation af intrageniske Notch1 deletion fra 100 ng af genomisk DNA under anvendelse af Expand Long Template PCR-systemet (Roche, Branford, CT). PCR-amplifikationen var 94 ° C x 2 minutter efterfulgt af 94 ° C x 15 sekunder, 60 ° C x 30 sekunder og 68 ° C x 45 sekunder i 30 cykler, efterfulgt af en 68 ° C forlængelse i 7 minutter. Det resulterende PCR-produkt blev oprenset, klonet ind i pCR2.1-TOPO-plasmid (Invitrogen, Carlsbad, CA), og Sanger sekventeret.

Western blot-analyse

Hele celle detergentlysater af cellelinier fremstillet som beskrevet [27] blev farvet for NICD1 (katalog # 4147), total NOTCH1 (katalog # 4380), eller actin (katalog # 4970) under anvendelse af antistoffer opnået fra cellesignalering Technologies (Beverly, MA).

xenografundersøgelser

REC-1 celler og MAVER-1 celler blev podet subkutant i 6 uger gamle SCID /beige mus (Charles River Laboratory, Wilmington, MA) (1×10

7-celler per mus) i 30% Matrigel basalmembranmatrix (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Tumorvolumen blev bestemt ved tykkelsesmålinger. Når tumorerne nåede et volumen på 100-200 mm

3, mus blev behandlet med gamma-sekretase hæmmer diaminobenzidin (DBZ) ved 10microM /kg ved intraperitoneal injektion eller med vehikel (DMSO) i 3 dage. Væv blev høstet 2 timer efter den sidste dosis lægemiddel. KOPT-K1-celler transduceret med et lentivirus, der udtrykker ildflueluciferase blev injiceret ved halevene i NOD /SCID /gamma-kæde (NSG) mus avlet i Lurie Family Imaging Center (Dana Farber Cancer Institute). Mus blev overvåget for udvikling af leukæmi ved bioluminescens og derefter behandlet med DBZ eller DMSO som ovenfor. HCC1587 og HCC1599 human brystcancer cellelinje xenotransplantater blev udviklet i CB17 mus som beskrevet [10], mens MB157 cellelinje xenotransplantater blev udviklet i Swiss nu /nu (nøgne) mus, alle på Merck Oncology. Dyreforsøg blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health.

Resultater

Udvikling af en immunhistokemisk Stain for Aktiveret NOTCH1

Selvom kanonisk Notch signalering afhængig nuklear translokation af sit intracellulære domæne (NiCd), påvisning af nukleare NICD

in situ

i humane væv har været svært. Polyklonale antistoffer, som detekterer neoepitop skabt ved amino-terminalen af ​​NICD1 ved spaltning af NOTCH1 på konserveret site inden dets transmembrane domæne er ofte blevet brugt til at identificere NICD1 i cellelysater, men har ikke givet pålidelige IHC tests. Nylig udvikling af en kanin monoklonalt antistof mod NICD1 neoepitop tilskyndet os til at revidere muligheden for at anvende IHC til påvisning NICD1 i FPE væv. For at begrænse run-to-run farvning variation og for at muliggøre eventuel klinisk oversættelse, vi evalueret farvning på to udbredte automatiserede Immunofarvning platforme, Ventana Discovery XT og Leica Bond. Begge udføres på lignende måde, men vi bemærkede, at farvning fortolkes specifik (som pr nedenfor) viste sig stærkere på Ventana platform (data ikke vist), som blev anvendt til alle undersøgelserne rapporteret heri.

At udvikle en pålidelig farvning fremgangsmåde til NICD1, vi gjort brug af kontrol- FPE væv fra mus xenotransplanteret med humane tumorcellelinier forsynet onkogen

NOTCH1

mutationer, der resulterer i ligand-uafhængig generering af NICD1 (tabel 1). Tumorer undersøgt med gain-of-function

NOTCH1

mutationer omfattede en T-LL-cellelinie, KOPT-K1, som har en aktiverende punkt substitution i NOTCH1 negative regulatoriske region på linie i

cis

med en kodon 2514 del (CT) mutation, der resulterer i deletion af den C-terminale NOTCH1 PEST degron domæne [3]; MCL cellelinien REC-1, der bærer en

NOTCH1

allel med en tidligere ukarakteriseret aktiverende deletion fjerner det meste af den kodende sekvens for NOTCH1 ektodomæne på linie i

cis

med en nonsense mutation i codon 2428 (beskrevet nedenfor), der også resulterer i deletion af C-terminale PEST degron domæne; og to brystcancercellelinier, HCC1599 og MB-157, som er forsynet

NOTCH1

alleler med deletioner der fjerner det meste af NOTCH1 ektodomænet kodende sekvenser ([10] og data ikke vist). Formalin FPE dele af alle fire xenografter bærer aktivering

NOTCH1

mutationer viste stærk diffus nuklear reaktivitet når farves med NICD1-specifikt antistof (figur 1A-D). Især blev NICD1 farvning i KOPT-K1 og REC-1-xenografter tydeligt reduceret ved behandling af dyr med GSI DBZ (figur 1E, F), som blokerer dannelsen af ​​NICD1 ([3]). Desuden blev der ikke NICD1 farvning ses i dele af MCL cellelinie MAVER-1 (figur 1G), som har vildtype

NOTCH1

alleler og er blottet for NICD1 [7], eller i brystkræft celle line HCC1587 (figur 1 H), som har vildtype

NOTCH1

alleler og i stedet har en aktiverende sletning involverer

NOTCH2

[10].

Sektioner blev farvet for NICD1 ved hjælp af en IHC metode, der producerer en brun nuklear pletten og modfarvet med hæmatoxylin. A) KOPT-K1 T-ALL-celler. B) REC-1 kappecellelymfom celler. C) HCC1599 brystcarcinomceller. D) MB-157 brystcarcinomaceller. E, F) KOPT-K1 og REC-1 cellefarvning henholdsvis i væv høstet fra dyr behandlet med GSI DBZ. G) MAVER-1 kappecellelymfom celler. H) HCC1587 brystcancerceller. Genotyper af disse cellelinier er angivet i tabel 1.

For yderligere at evaluere følsomheden af ​​fremgangsmåden og stabiliteten af ​​NICD1 neoepitop i arkivering væv, udførte vi IHC for NICD1 på snit fremstillet fra en T -LL eksemplar opnået i 2004 fra en patient indskrevet i en prøveversion af Merck GSI MK-0754 [22]. Sanger sekventering af DNA isoleret fra denne prøve viste en heterozygot punktmutation, som resulterer i en L1574P substitution, samt to yderligere subclonal punktmutationer på linie i

cis

med L1574P substitution, der skaber L1600P og F1592S substitutioner (figur 2A ). Alle disse mutationer falder i exon 26 i

NOTCH1

og svarer til tidligere karakteriserede gain-of-funktion mutationer i NOTCH1 negative regulatoriske region [28], at en del af NOTCH1 ektodomænet der skal være intakte holde receptor i off-tilstand i fravær af ligand [29]. Tandem mutationer justeret i

cis

i NOTCH1 ektodomænet tidligere er blevet rapporteret sandsynligvis en manifestation af fortsat selektion for øget NOTCH1 signalering under T-ALL progression [3] og. IHC farvning af denne T-ALL produceret stærk diffus nuklear positivitet, hvilket tyder på, at NICD1 epitop detekteres af kanin monoklonale antistof er stabil i en årrække i rutinemæssigt gemt FPE prøver (figur 2B).

A) Identifikation af aktiverende mutationer involverer exon 26 af

NOTCH1

. Af 24 individuelle klonede PCR-produkter, 13 gav vildtypesekvenser, 9 viste en mutation producerer en L til P substitution i rest 1574 1 viste L1574P mutation i

cis

med en mutation producerer en F til S substitution i rest 1592 og 1 viste L1574P mutation i

cis

med en variant producerer en L til P substitution i rest 1600. B) IHC farvning for NICD1 i samme tumor, en formalinfikseret paraffinindlejret biopsi af en mediastinal masse. Der er crush artefakt, men stærke kernekraft farvning ses i intakte celler.

Vi har også noteret i sektioner af xenotransplanterede tumorer, murine endothelceller og spredte stromale celler viste nukleare reaktivitet med NICD1 antistof (ses bedst i figur 1G og H). Disse observationer er i overensstemmelse med data, der angiver roller for notch1 i vaskulært endotel [30] og perifere T-celler [31], og foreslog, at vores IHC metode kan detektere fysiologiske niveauer af NICD1. At evaluere denne farvede vi normale snit af human squamous mucosa, hud og thymus (figur 3). Tidligere arbejde har vist, at notch1 transient aktiveres i suprabasilar celler i pladeepitel [32], hvori det fremmer cellecyklus exit og differentiering [33], en aktivitet, der kan bidrage til NOTCH1 tumor undertrykkende roller i pladecellecarcinomer af huden og hoved og hals. Som forventet blev NICD1 farvning i pladeepitel begrænset til suprabasilar celler (figur 3A, B). I thymocytter, notch1 aktivering stiger til et maksimum i CD4 /CD8 double-negative celler undergår beta-selektion [34], som er beliggende inden for thymus cortex lige dybt til thymiske kapsel [35]. I tidligere arbejde, bemærkede vi, at cellerne i denne region af thymus har det højeste niveau af immunreaktivitet med antistoffer, der genkender total notch1, uden hensyn til dens aktivering status [36]. Som forudsagt ud fra den rapporterede mønster af NOTCH1 aktivering i thymocytter, NICD1 farvning i human thymus var mest fremtrædende i corticale thymocytter liggende umiddelbart under kapslen (figur 3C, D). Disse resultater viser, at vores IHC metoden er tilstrækkelig følsom til at påvise fysiologiske niveauer af aktiveret NOTCH1 i det mindste nogle normale væv. For yderligere at udforske NOTCH1 aktivering i normale lymfevæv blev farvning af tonsil også udført. Vi bemærkede, at germinale centre indeholdende reaktive B-celler var blottet for immunreaktivitet, mens omgivende kappe zoner viste svag farvning for NICD1 (data ikke vist).

A) Oropharyngeal skællede slimhinde. B) Hud. C, D) Thymus.

Påvisning af NOTCH1 Aktivering i Archival Cancer Prøver

Med udgangspunkt i disse valideringsstudier, vi næste brugte IHC til at screene en række FPE menneskelige kræftformer for tegn på NOTCH1 aktivering, med fokus på tumortyper, hvor

NOTCH1

gain-of-funktion mutationer er blevet beskrevet. Vi studerede også angiosarkom, baseret på den iagttagelse, at normale endotelceller ofte farves positivt for NICD1 og tidligere undersøgelser tyder på, at

notch1

har en tumor undertrykkende funktion i murine vaskulær endotel [19,20]; derfor var vi nysgerrige efter at se, om NOTCH1 aktivering kan gå tabt i humane angiosarcomer. Vi anvendte NICD1 farvning af normale endotelceller som en intern kontrol for at bedømme bevarelsen af ​​immunreaktivitet i de undersøgte væv. I forundersøgelser, vi bemærkede, at arkivering prøver er fastsat i Zenker løsning, en kviksølv fiksativ bruges på vores institution at afkalke knoglemarv biopsier, negeret NICD1 immunoreaktivitet i endotel. Tab af immunreaktivitet blev ikke forårsaget af afkalkning

per se

, da knoglemarv involveret ved xenotransplanterede KOPT-K1-celler, som blev fikseret i formalin og derefter hurtigt kalkfattige med en stærk syre beholdt immunoreaktivitet (figur 1A). På grund af denne begrænsning, vi begrænset vores studier til tumorer, der involverer bløde væv, for hvilke FPE prøver var til rådighed. Nogle lymfeknuder er involveret ved CLL prøver blev fikseret i B +, et fiksativ, der indeholder formaldehyd og zinkchlorid. Prøver fastsat i B + beholdt NICD1 farvning i normale endotelceller og således blev inkluderet i analysen.