PLoS ONE: nikotinreceptor β2 Bestemmer NK Cell-Dependent Metastase i en murin model af metastatisk lungekræft

abstrakt

Cigaretrøg eksponering markant kompromitterer evnen hos immunsystemet til at beskytte mod invaderende patogener og tumorigenese. Nikotin er et psykoaktivt komponent af tobaksvarer, der fungerer som gør den naturlige neurotransmitter, acetylcholin, på nikotinreceptorer (nAChRs). Her demonstrerer vi, at naturlige dræberceller (NK-celler) stærkt udtrykker nAChR β2. Nikotin eksponering påvirker evnen af ​​NK-celler til at dræbe målceller og frigive cytokiner, en proces, der i vid udstrækning ophævet af nAChR β2 mangel. Yderligere, nikotinsyre undertrykkelse af NF-KB-induceret transkriptionel aktivitet i NK-celler er afhængig af nAChR β2. Dette nAChR subtype spiller også en stor rolle i NK-celle-medierede kontrol af melanom lunge metastase, i en murin lunge metastase udsættes for nikotin. Vores resultater tyder på nAChR β2 som en fremtrædende vej for nikotin induceret svækkelse af NK celle funktioner, som bidrager til forekomsten af ​​ryge-relaterede patologier

Henvisning:. Hao J, Shi FD, Abdelwahab M, Shi SX, Simard A , Whiteaker P, et al. (2013) nikotinreceptor β2 Bestemmer NK Cell-Dependent Metastase i en murin model af metastatisk lungekræft. PLoS ONE 8 (2): e57495. doi: 10,1371 /journal.pone.0057495

Redaktør: Fabrizio Mattei, Istituto Superiore di Sanità, Italien

Modtaget: 28 oktober, 2012; Accepteret: 21 januar 2013; Publiceret: 28 feb 2013

Copyright: © 2013 Hao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse understøttes delvist af International Science Cooperative Project Kinas 2006DFB32330 til QHZ; National Basic Research Program i Kina 2013CB966900 til FDS; Program for New Century Fremragende Talenter i University of China (NCET 111.067 til JWH); NFSC 2010CB529405 til QHZ, 81.100.887 og 81.273.287 til JWH; det amerikanske National Institute of Health (R01AI083294 til FDS); Key Project of Natural Science Foundation of Tianjin-provinsen 12JCZDJC24200 til JWH, og Key Project kinesiske undervisningsministerium (212.005 til JWH). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

ryger relaterede lidelser, såsom infektion og tumorigenese er knyttet til de kompromitterede funktioner i immunsystemet hos rygere [1], [2]. Blandt de mange immun-modificerende komponenter i tobaksrøg, er nikotin vist sig at have en dybtgående indvirkning på en række nicotinacetylcholinreceptor (nAChR) -fyldt leukocytter fra både medfødte og adaptive immunforsvar. Ekspression af nAChR α7 på makrofager og monocytter, og dets evne til at inhibere immunresponset under systemisk inflammation og i organspecifikke sygdomme er blevet relativt godt beskrevet [3], [4], [5], [6], [7] , [8]. Resultater antyder, at nikotin regulerer intensiteten af ​​endotoksæmi og sepsis [3], [4], [5], og dæmper -specifikke autoimmune responser i en nAChR α7-afhængig måde [6], [7], [8]. På den anden side er det for nylig blevet påvist, at andre nAChR subtyper kan spille en rolle i nikotin anti-inflammatoriske virkninger [3], [4], [5], [6], [7], [8]. I denne sammenhæng ekspressionsprofilen af ​​yderligere nAChRs på leukocytter og deres rolle i sygdom er relativt mindre udforsket. Salg

NK-celler er store, granulære lymfocytter, der opererer gennem cytolytisk aktivitet og cytokinsekretion. Disse to funktioner bemyndige NK-celler i medfødte vært forsvar mod visse mikrobielle midler og celler undergår malign transformation. Flere undersøgelser har vist, at NK numre og aktiviteter celle er nedsat hos rygere end hos ikke-rygere [1], [2]. Udsættelse for cigaretrøg dæmper den cytotoksiske aktivitet og cytokinproduktion af NK-celler hos mennesker og mus [9], [10], [11], hvorved der forbinder NK-celle defekter til øget infektion og cancer. Rygning har været særligt forbundet med meget malign småcellet lungecancer. Selv efter kirurgisk fjernelse på et tidligt tidspunkt, næsten halvdelen af ​​patienterne dør fra en sekundær tumormetastase. Det påstås, at dette skyldes til dels defekte NK cellemedieret immun overvågning, fordi afvigende NK celle funktion hos rygere øger genopstod livmoderhalskræft metastaser [12].

Her har vi omfattende undersøgt det cellulære og molekylære virkninger af nikotin som en af ​​komponenterne i cigaretrøgen på NK-celler. Vi profileret nAChR udtryk på NK-celler og identificeret nAChR β2 som en afgørende faktor for nikotin-medieret svækkelse af NK cellefunktioner. Desuden viser vi, at nikotinsyre hæmning af NK-funktioner celle via nAChR P2 øger melanom metastase i en xenogen model.

Materialer og metoder

Dyr

Kvindelige C57BL /6 mus (6-8 uger gamle), rag2

– /-, rag2

– /- γ

c

– /-, alle på en C57BL /6 baggrund, blev indkøbt fra Taconic Farms. α7 og p2 KO mus [13], også krydset til C57BL /6 baggrund, blev venligst stillet til rådighed af Dr. Allan C. Collins. Mus blev holdt under patogenfrie betingelser. The Animal Research Ethics Board of Tianjin Medical University og St. Josephs Hospital og Medical Center godkendt alle eksperimenter beskrevet i denne undersøgelse.

mRNA Rensning og Reverse-transskription PCR

mRNA blev oprenset fra frisk akut -isolated celler (~1.5 × 10

6 celler pr prøve) ved hjælp af μMACS mRNA isolation kit (Miltenyi Biotec), som pr den medfølgende protokol. Revers transskription blev udført med Superscript III First Strand cDNA Synthesis kit (Invitrogen, USA) ved at følge den medfølgende protokol. Oligo-dT-sekvenser blev anvendt til at prime den reverse transkriptase. PCR blev dernæst udført følgende etablerede protokoller, ved hjælp af forskellige primere, der er specifikke for hvert mål-mRNA (tabel 1). Primerpar blev konstrueret ved anvendelse af PubMed s “Primer-blast” værktøj (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). For hvert par, fremadrettede og reverse primere var specifikke for de forskellige exoner, således at potentielle DNA-kontaminering kunne udelukkes. PCR blev udført under anvendelse af RedTaq PCR-kittet (Sigma, USA), ifølge den medfølgende protokol. Primere blev altid testet med total hjerne-cDNA (positiv kontrol), og den optimale annealingstemperatur (Tm) blev bestemt empirisk (med anvendelse af en temperaturgradient thermocycler) og stadig opretholde høje stringensbetingelser. En negativ kontrol (intet cDNA template), blev inkluderet i hvert sæt af reaktioner. PCR-produkter til hver primer par fra positive kontroller blev sekventeret for at sikre nøjagtigheden af ​​vores resultater.

Samlet nAChR Expression Vurderet af Radioligand Mætning Binding

Epibatidin, der er selektiv for β2- og p4-holdige nAChRs (som kan samles med α4, α5, α6 og p3 underenheder), blev anvendt til at vurdere størrelsen af ​​p2-holdige nAChRs, som gjort tidligere [14], [15]. For at maksimere assay følsomhed, brugte vi høj specifik aktivitet [

125I] epibatidin (I-Epi, 2200 Ci mmol

-1, PE Life Sciences, Waltham, MA). Til dette formål blev rensede NK-celler anvendes straks efter isolering. Cellerne blev resuspenderet i isotonisk bindingsbuffer (mM: NaCl, 144; KCl, 2; CaCI

2, 2; MgSO

4, 1, HEPES 20, pH = 7,5) suppleret med bovint serumalbumin (0,1% (vægt /volumen)). Inkubationer blev udført ved 22 ° C i 2 timer i 96-brønds plader. Prøver blev inkuberet med en række på otte koncentrationer (6,25 – 800 pm) i I-Epi i et samlet volumen på 30 pi suppleret isotonisk bindingsbuffer. Total (uden tilsat peptid) og ikke-specifik binding (defineret ved hjælp af 100 mM carbamycholine) blev målt ved hver koncentration i tre eksemplarer. For at adskille β2- fra p4-holdige nAChRs blev 10 nM A85380 tilsat i conjuncton med 200 pM I-Epi [14]. Bindingsreaktioner blev afsluttet og vasket ved filtrering under anvendelse af en 96-sted manifold. Partikler blev opsamlet på enkelte lag af Inotech 0,75 um fastholdelse glasfiberfiltre gennemvædet med 0,5% polyethylenimin. Bundet radioligand blev kvantificeret ved hjælp af en Microbeta plade tæller (PerkinElmer Life Sciences, Wellesley, MA).

Nikotin Behandling in vivo og in vitro

Til in vivo levering, en 100 mg /ml opløsning indeholdende (-) nicotin bitartrat (Sigma, St. Louis, MO, USA) i phosphatbufret saltvand (PBS) eller en opløsning af PBS alene blev frisk fremstillet 24 timer før pumpen implantation og indlæses i Alzet® osmotiske minipumper (model 2006 Durect Corporation, Cupertino, CA, USA). Pumperne blev implanteret subkutant på højre side af ryggen af ​​musen og kontinuerligt leveret enten PBS eller nikotin salt på 3,6 pl /d i 6 uger, og derefter pumperne blev fjernet. Dette svarede til levering af 0,39 mg nikotin fri base pr mus per dag. For en -30 gm mus, hvilket er i den øvre ende af vægt for dyr, der anvendes i undersøgelsen, svarer dette til ~13 mg nikotin fri base /kg /d eller ~0.54 mg nikotin fri base /kg /time. Plasma nikotin niveauer i mus ~100-200 ng /ml (~0.6-1.2 mM) efter infusion af ~2-4 mg /kg /time af narkotika og ~45 ng /ml (~280 nM) efter infusion på -0,5 mg /kg /time. Til sammenligning humane rygere har peak plasma nikotin niveauer af 10-50 ng /ml (~60-310 nM). Således nikotin i plasma (ekstrapoleret til at være ~49 ng /ml eller ~300 nM) af mus anvendt i undersøgelserne er sammenlignelige med dem i plasma hos humane rygere. Nogle kontrol mus modtog PBS via direkte injektioner snarere end gennem minipumper, men enten leveringsmetode produceret lignende resultater. Til in vitro eksperimenter blev 0,1-100 pM /ml nikotin tilsat til cellekulturerne.

B16 melanomcellelinje og tumorbelastning

B16-F10-luc2 (B16) er en luciferase-udtrykkende cellelinie fra mus melanom (Caliper Life Sciences, Alameda, CA, USA). Mus fra de angivne genotyper blev provokeret i.v. med B16-celler i 0,2 ml PBS via halevenen. Cell referencenumrene og tidspunkter for ofre omtales tidligere etablerede protokoller [9], [15], [16] og er angivet i resultatafsnittet. Dyrene blev bedøvet og aflivet via forblødning gennem abdominal venepunktur. Lunger blev fjernet og anbragt i PBS. Tumorknuder blev talt under anvendelse af et dissektionsmikroskop af en forsker blindet for behandlingsgrupperne. I nogle tilfælde blev lunger nedsænket i en 67% ethanol, 9% formaldehyd, og 4% iseddikesyre opløsning og antallet af tumor foci blev optalt 24-48 timer senere.

Isolering af Lung mononukleære celler

Lung mononukleære celler blev isoleret som tidligere [17] beskrevne. Kort fortalt blev lunger perfunderet med forvarmet HBSS fra den højre ventrikel. Cellesuspensioner fra udskårne organer blev dannet ved collagenase fordøjelse og efterfulgt af mekanisk hakning. Cellerester blev fjernet ved passage gennem nylonnet. Celler blev vasket og resuspenderet i HBSS. Parenkymale celler blev isoleret ved densitetsgradient centrifugering med Lympholyte-M (Cedarlane Laboratories).

NK Cell cytotoksicitetsassays

NK-cellers cytotoksicitet blev vurderet af chromfrigivelsesassay med

51Cr- mærket YAC-1 murin lymfom cellelinie [18] eller B16-tumorceller. Frisk rensede NK-celler blev inkuberet med

51Cr-mærkede målceller (5 x 10

3) ved forskellige effektor-celle /målcelle-forhold. Efter 4 timers inkubation blev supernatanterne høstet og

51Cr-frigivelse blev målt med en γ-tæller (PerkinElmer, Waltham, MA). Procentdelen af ​​specifik lyse blev beregnet efter følgende formel: (forsøgsudsætning – spontan frigivelse) /(maksimal frigivelse – spontan frigivelse) × 100. Cytotoksicitetsassays blev udført tre gange [18]

NK Cell Proliferation. assays Salg

NK-celler blev isoleret fra milten fra mus, som blev behandlet med nikotin eller PBS. Celler blev suspenderet i dyrkningsmedium indeholdende Dulbeccos modifikation af Eagles medium (Gibco, Paisley, UK) suppleret med 1% (vol /vol) minimal essential medium (Gibco), 2 mM glutamin (Flow Laboratory, Irvine, CA, USA), 50 IU /ml penicillin, 50 mg /ml streptomycin, og med 10% (v /v) FCS (alle fra Gibco). 4 × 10

5-celler i 200 pi kulturmedium blev anbragt i hver brønd af 96-brønds rundbundet mikrotiterplader (Nunc, København, Danmark). For vitro-forsøg eksponering i nikotin, blev nikotin (0,1-100 uM) tilsat til dyrkningsmediet ud over LPS (10 ug /ml). Efter 3 dages inkubation blev cellerne pulseret i 18 timer med 10 pi alikvoter indeholdende 1 pCi

3H-methylthymidine (specifik aktivitet på 42 Ci /mmol; MP Biomedicals, Irvine, CA, USA) pr. Celler blev høstet på glasfiberfiltre og inkorporering af thymidin proportional med graden af ​​celleproliferation blev derefter målt. Resultaterne udtrykkes som tællinger per minut (cpm).

FACS-analyse

Enkeltcellesuspensioner (10

6 celler) blev fremstillet fra milt eller lymfeknuder, og farvet med fluorochrome- konjugerede antistoffer. Alle antistoffer blev indkøbt fra BD Biosciences eller eBioscience medmindre andet er angivet. Antistoffer blev direkte mærket med en af ​​følgende fluorescerende tags: FITC, PE, PerCP, allophycocyanin (APC), PC5, eller PC7. Følgende anti-mus antistoffer blev anvendt: CD3 (145-2C11), NKG2A (20d5), NKG2D (CX5), Ly49 I (YLI-90), NK1.1 (PK136), perforin (eBioOMAK-D) og granzym B (16G6). Flowcytometrisk data blev indsamlet på en FACSAria

TM flowcytometer (Becton Dickinson, Mountain View, MD) og analyseret med Diva

TM software. Isotype-matchede negative kontrol-mAb’er blev anvendt til alle pletter. For at bestemme procentdelen af ​​celler, der producerer udvalgte cytokiner, blev værdier opnået med isotypekontroller subtraheres fra dem med specifikke mAb.

Tumor in vivo Imaging

bioluminescens billeder blev opnået under anvendelse af et IVIS Imaging System 200-serien (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). For

in vitro

billeddannelse blev bioluminescerende celler serielt fortyndet fra 10

5-celler i komplet medie i sort, klar fladbundede plader med 24 brønde (Costar, Acton, MA, USA). D-luciferin (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA.) Ved 150 ug /ml i medium blev tilsat til hver brønd 5-10 min før billeddannelse. Imaging var 1 min /plade. For

in vivo

imaging, Mus modtog en intraperitoneal injektion af D-Luciferin 150-mg /kg (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). Mus blev derefter anbragt på den opvarmede fase inde i lystæt kamera kasse med vedvarende udsættelse for 1-2% isofluran. Imaging gange varierede fra 1 s til 3 pastiller. Regioner af interesse fra de viste billeder blev identificeret omkring tumor websteder og blev kvantificeret som total fotontællinger eller fotoner /s ved hjælp af Living Image® software (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA).

Tumor udfordring forsøg blev udført med melanom B16-celler, der udtrykker luciferase. Til kvantificering af tumorbelastning, ved 10 minutter efter intraperitoneal injektion af 3 mg /mus D-luciferin (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA), mus blev bedøvet og anbragt i lystæt kammer af et IVIS 200 bioluminescens imaging system (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). Der blev indsamlet data som fotoner /sek /cm

2 ved hjælp af Living Image® software (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA).

MRI blev udført ved hjælp af en 7T lille dyr, 30-cm horisontal-boring magnet og Biospec Avance III spektrometer (Bruker, Billerica, MA) med en 116 mm høj effekt gradient sæt (600 mT /m) og en 72 mm hele kroppen mus sende /overflade modtager coil konfiguration. Axial og koronale T1-vægtet (MSME; TE 10.5 ms, TR 322 ms, skivetykkelse 0,5 mm, matrix 256 x 256, synsfelt (FOV) 2,8 cm, otte gennemsnit, 40 koronale skiver, scan tid 22 minutter, og 20 aksiale skiver, scan tid 16 min) og fedt undertrykt turbo spin-ekko T2-vægtede (RARE; TE1 14,5 ms, TE2 65,5 ms, TR 4500 ms, 0,5 mm skive tykkelse, Matrix 256 × 256, FOV 2,8 cm, otte gennemsnit, 40 koronale skiver, scan tid 28 minutter og 20 aksiale skiver, scan tid 28 minutter) billeder blev erhvervet, der dækker mængden af ​​hjernen fra lugtekolben /frontallappen revne til den cervikale rygmarv. MRI data blev analyseret ved hjælp af MEDx3.4.3 softwarepakke (Medical Numerics, Virginia, USA) på en Linux arbejdsstation.

Cytokine Kvantificering

Standard ELISA til vurdering af cytokinfrigørelse fra NK-celler (IFN -γ, MIP1α, og GM-CSF) blev udført under anvendelse BD OptEIA ELISA-kit (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA) som tidligere beskrevet [18]. Resultater blev udtrykt som gennemsnit cytokin-koncentration (pg /ml) ± SEM.

I intracellulær cytokin farvning blev enkeltcellesuspensioner fremstillet og inkuberet ved 37 ° C i fire dage i rundbundede plader (2 × 10

6 celler /brønd), og stimuleret med en blanding af PMA (20 ng /ml), ionomycin (1 pg /ml), og brefeldin a (5 ug /ml) i yderligere 5 timer ved 37 ° C. Efter høstning blev cellerne farvet for overflademarkører, fikseret og permeabiliseret med Cytofix /Cytoperm Kit (BD Biosciences), derefter farvet med anti-IFN-γ-mAb (XMG1.2) konjugeret med Alexa 647. Alle prøver blev analyseret på en FACSAria

TM hjælp Diva

TM software.

QRT-PCR

Total RNA blev ekstraheret fra celle suspensioner af rygmarv hjælp TRIzol (Invitrogen). Første-streng cDNA af hver prøve blev syntetiseret under anvendelse af en revers transkription-kit (Invitrogen). RT-PCR blev udført som tidligere beskrevet, under anvendelse af en ABI Prism 7900-HT sekvens systemet (Applied Biosystems) med QuantiTect SYBR Green PCR-kittet (QIAGEN) i overensstemmelse med producentens anvisninger. Følgende primere blev anvendt: NF-kB fremad, 5′-ATTTGAAACACTGGAAGCACGG-3 ‘; NF-kB omvendt, 5’CCGCCTTCTGCTTGTAGATAGG -3 ‘; IKKα fremad, 5’-TGCACACCGTGCAGAGTCA 3 ‘; IKKα omvendt, 5’TGCTTGCAGCCCAACAACT -3 « hypoxanthin-guanin-phosphoribosyltransferase (HPRT) fremad, 5’-AGCCTAAGATGAGCGCAAGT-3 ‘; og HPRT omvendt, 5’-TTACTAGGCAGATGGCCACA-3 ‘. HPRT-genet blev amplificeret og tjente som en endogen kontrol. 1 pi første streng cDNA-produktet blev amplificeret med platin Taq polymerase (Invitrogen) og gen-specifikke primerpar. Hver prøve blev analyseret tredobbelt og forsøg blev gentaget to gange. De relative mængder af mRNA blev beregnet ved at afbilde den Ct (cyklusnummer), og betyde relative ekspression blev bestemt ved 2

-ΔΔCt sammenligningsmetoden.

Resultater Salg

nAChR Expression Profile på NK-celler og bekræftelse af ligandbindingsassays

for at bestemme nAChR mRNA ekspression på NK-celler, vi sorteret NK-celler fra puljede splenocytter af rag2

– /- C57BL /6 mus, der mangler T-celler, NKT celler og B-celler. mRNA blev ekstraheret fra højt oprensede NK-celler (figur 1A) og nAChR ekspressionsprofil blev bestemt ved PCR. Vores resultater viser, at NK-celler udtrykker nAChR α4, α5, α6, β2 og β3, men ikke α3, α7, α9; heller β4. Endvidere ekspression af β2 var særlig stærk (figur 1B). Vi undersøgte derefter, om nAChR proteiner stand til at udføre nikotinsyre radioligandbinding er samlet i NK-celler ved anvendelse af en

125I-mærket epibatidin (I-Epi) bindingsassay (200 pM I-Epi +/- 100 mM carbamylcholin), som beskrevet andetsteds [14], [19], [20], [21]. NK-celler (~ 1 mio) blev oprenset ved FACS, og musehjerne cortex homogenat blev anvendt som en positiv kontrol. Specifik I-Epi binding var 99 fmol /mg protein i NK-celler, ca. lig med specifikke bindende niveauer i muse hele hjernen (figur 1C). Disse data viser, at NK-celler udtrykker et betydeligt antal af samlede nAChRs (samt nAChR underenheds mRNA’er som vist tidligere) på niveauer, som kan kvantificeres med denne analyse. Da jeg-Epi binder sig til både β2- og p4-holdige nAChR’er [14], konkurrencedygtig bindende med nAChR β2-selektive sammensatte A85380 blev anvendt til at skelne mellem disse to receptorundertyper. Vi fandt, at A85380 stort set ophævet I-Epi-binding, hvilket viser, at langt størstedelen af ​​nAChR’er stede på NK celler indeholder β2-underenheden (figur 1C). Kollektivt vores resultater viser, at NK-celler udtrykker en matrix af nAChR mRNA’er og at de fleste af disse underenheder samles til p2-holdige nAChRs. Den stærke ekspression af nAChR β2 i NK-celler, både på mRNA og protein niveauer tyder på, at p2-holdige nAChRs er kandidater til mediering af nikotin virkninger på NK-celle aktivitet.

Spleen eller lymfeknude cellesuspensioner opnåedes rag2

– /- mus, og FACS blev udført som beskrevet i

Materialer og metoder

sektion. A. Repræsentative dot plots af cellepopulationer før og efter sortering er vist i venstre og højre hånd paneler hhv. Renheden af ​​NK-celler nås 98% renhed efter sortering. B. mRNA blev oprenset fra de sorterede NK-celler, og cDNA blev syntetiseret ved revers transkription. PCR blev derefter udført under anvendelse af primere specifikke for hver mus nAChR underenhed. En positiv kontrol (+) ved anvendelse hel musehjerne-cDNA, og en negativ kontrol (-), uden cDNA, blev inkluderet i hver reaktion. For hver nAChR underenhed blev bands fra den positive kontrol og mindst én prøve fra hver celletype sekventeret og bekræftet som korrekte PCR-produkt. C. nAChR ekspression vurderet ved radioligand mætningsbinding. Data afbildet er repræsentative fra 2 til 3 separate eksperimenter med lignende resultater.

Indflydelse af nAChR β2 Mangel på ekspression af NK cellereceptorer og effektormolekyler

NK cellefunktioner dikteres af stimulerende og inhibitoriske receptorer på NK-celler. Aktivering signaler genereres gennem NK gruppe 2 medlem (NKG2D), der anerkender de stress-inducerbare molekyler MHC klasse I kæde-relaterede proteiner (glimmer samt MICB) og UL-16-bindende proteiner 1-4 (ULBP1-4), også kendt som RAET proteiner eller gennem naturlige cytotoksiske receptorer (NCRs), der genkender viral hemagglutinin og endnu udefineret tumor-associeret ligand. De inhibitoriske signaler genereres ved binding af MHC klasse I molekyler til killer celle immunoglobulinlignende receptorer (KIR’er) hos mennesker, eller til Ly49 i mus, der ud over CD94 /NKG2A heterodimer i begge arter [22], [23]. Vi sammenlignede ekspressionen af ​​flere af disse receptorer på milt NK-celler isoleret fra nicotine- eller PBS-eksponerede mus og undersøgt indflydelsen, om nogen, af nAChR β2-mangel. Ekspression af inhibitorisk receptor NKG2A ændres ikke signifikant på NK-celler ved nikotin; hvorimod udtryk for NKG2D og Ly49I blev reduceret i mus, som fik nikotin, og sådanne reduktioner er stort set ophævet i nAChR β2

– /- mus (figur 2A) [13]. Lignende resultater blev opnået med hensyn til udtryk NK celle effektor molekylære Granzyme B og perforin (figur 2B). Vi observerede også, at nikotin har en tilsvarende virkning på lunge-afledte NK-celler receptorprofil og effektormolekyler (data ikke vist).

Vildtype (β2

+ /+) eller nAChR p2 knock-out ( β2

– /-) mus fik nikotin (Nic) eller PBS i 21 dage, før de blev oprevne. Enkeltcellesuspensioner blev fremstillet ud fra milte. Frekvens og fænotyper af NK-celler i mononukleære celler blev analyseret ved FACS. A. Ekspression af NKG2D, NKG2A og Ly49I på gated NK1.1

+ CD3

– celler. B. Ekspression af perforin og granzym B udskilles af gated NK1.1

+ CD3

– celler. Plottet data repræsenterer resultater fra to separate eksperimenter (n = 3-4 mus /gruppe). P-værdier, Students

t

-test, * p. 0,05

nAChR β2 Mangel Vender de inhiberende virkninger af nikotin på NK cellefunktioner

For at forstå biologiske konsekvenser af ændret NK-celle-receptor-ekspression induceret af nikotin eksponering, undersøgte vi effekten af ​​nikotin på NK-celle medieret drab af målceller, samt frigivelse af cytokiner af NK-celler. NK-celler normale udgør 5-10% af perifere mononukleære blodceller hos mennesker og 1-3% af monocytter i musemilt eller lymfeknude. For NK-celler til at udføre deres funktioner, skal disse celler formere under patologiske situationer. Således har vi først vurderet indflydelse af nikotin på NK-celleproliferation og fandt, at nikotin reduceret NK-celleproliferation og tal (figur 3A, B). nAChR β2-mangel stort set genoprettet kapaciteten af ​​NK-celler til at proliferere og tal i nærvær af nikotin (figur 3A, B).

NK-celler blev sorteret fra splenocyt enkelt celle suspensioner af vildtype (β2

+ /+) eller nAChR p2 knock-out (β2

– /-). A. Celler blev derefter dyrket i nærvær af forskellige koncentrationer af nikotin (0,1, 1, 10 eller 100 uM), og [

3H] thymidin-inkorporering blev målt (10

3 cpm + SEM; ordinat). B. NK celleantal blev vurderet fra β2

+ /+ eller β2

– /- mus i nærvær eller fravær af nikotin. (N = 6-8 pr gruppe; Students

t

-test, * p 0,05). C.

51Cr-labbed målcelle YAC-1 blev inkuberet med NK-celler afledt fra β2

+ /+ eller β2

– /- mus i nærvær eller fravær af nikotin på det angivne effektor /mål- celle-forhold. Drab af målceller måles ved

51Cr frigivelsesassay. D. B16-celler blev inkuberet med NK-celler afledt fra β2

+ /+ eller β2

– /- mus i nærvær eller fravær af nikotin. D-Luciferin blev tilsat til hver brønd, og pladen blev afbildet til opnåelse fotoner /s per celle. Brønde med celler alene (ingen nikotin) eller celler (tilføjet nikotin) blev inkluderet som kontroller. Drabet på B16-celler måles via bioluminescens billeddannelse. Data fra et eksperiment ud af to udførte er vist, n = 3-4 mus /gruppe. P-værdier, Students

t

-test, * p 0,05. E. Fremstilling af IFN-γ blev målt ved intracellulær cytokin-farvning. Dot plots er repræsentative for to separate forsøg (n = 6-18 mus). F. Produktion af IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, MIP-1α og MIP-β ved sorterede NK-celler blev målt ved ELISA. P-værdier, Students

t

-test, * p. 0,05

Dernæst vurderede vi indflydelsen af ​​nikotin på NK-celle lytisk aktivitet og potentielle roller for nAChR β2. Sammenlignet med kontrolmus, der modtog PBS, NK-celler fra nikotin-behandlede mus udviste reduceret cytotoksicitet mod YAC-1, en klassisk NK målcelle med lavere MHC klasse I-ekspression (figur 3C). Primære humane og muse melanom, eller cellelinier, fælles ekspression af ligander for naturlige cytotoksiske receptorer (NCRs) og DNAX tilhørende molekyle-1 (dNAM-1), de to nye NK celle receptorer vigtige for kræft anerkendelse [15]. Endvidere har disse celler lav MHC klasse I-ekspression [15]. NK-celler er således i stand til at genkende og lysere humane og muse-melanomceller in vitro og in vivo, og for at forhindre melanom-metastase i adoptiv overførsel eksperimenter [24]. Vi anvendte derfor den murine B16-cellelinien, stammer fra spontane murine melanom, og viste, at NK-celler let dræbe B16-tumorceller, og at denne virkning var signifikant reduceret, når de udsættes for nikotin (figur 3C, D). For at undersøge bidrag nAChR β2-receptoren til at mediere virkningerne af nikotin, vi udfører disse forsøg under anvendelse af nAChR β2

– /- NK-celler (figur 3C, D). I alle eksperimenter, nAChR β2-mangel betydeligt ophævet virkningerne af nikotin.

Sidste, vi undersøge virkningen af ​​nikotin på cytokin produktion af NK-celler. Sammenlignet med kontrolmus, IFN-y, GM-CSF, MIP-1a, MIP-1 og TNF-α sekretionssignaler blev reduceret i mus modtog nikotin (figur 3E, F). Igen blev disse parametre tilbageføres i stor udstrækning i nAChR β2

– /- mus. Kollektivt vores resultater viser, at nikotin forringer NK cellefunktioner, herunder proliferation, cytotoksicitet mod YAC-1 celler og B16-tumorceller, og produktion af cytokiner. Vores resultater viser også, at trods ekspression af multiple nAChRs, nAChR β2 opstået som en nøglemediator for nicotiniske virkning på NK-celler, som mangel på nAChR α7 ikke signifikant ændrer påvirkningen af ​​nikotin på NK-celler (data ikke vist).

Nikotin inhiberer NF-KB Transaktivering i NK-celler gennem nAChR β2

Mobilisering af transskription faktor NF-KB er et vigtigt skridt for NK-celle-aktivering og fortsætter sin cytotoxicic aktivitet og produktion af cytokiner. For at evaluere virkningen af ​​nikotin på NF-KB-aktivitet i NK-celler, vi sorteret NK-celler fra milten fra rag2

– /- mus, og dyrkes de isolerede NK-celler alene eller med nikotin i 24 timer. Vi udførte en serie af real-time PCR eksperimenter ser på ændringer i transkript overflod, og så, at tilsætning af nikotin undertrykt gentranskription af NF-KB, og IKKα, en alternativ regulator af NF-KB i NK-celler (figur 4). At afgøre, om nAChR β2 er involveret, vi tværs opdrættet rag2

– /- med nAChR β2

– /- mus til at generere dobbelt knockout mus. Når NK-celler afledt fra disse mus blev anvendt, effekten af ​​nikotin på NF-KB og IKKα transkription bliver minimum (figur 4). Således nAChR β2 medierer effekten af ​​nikotin på NK-celle transskription gener, der er afgørende for deres funktioner

NK-celler blev sorteret fra splenocyt enkelt celle suspensioner af rag2

-. /- Og rag2

– /-β2

– /- mus. NF-KB og IKKα mRNA af sorterede NK-celler i β2

+ /+ eller β2

– /- mus modtog nikotin (Nic) blev målt ved QRT-PCR. Data fra et eksperiment ud af to udførte er vist, n = 3-4 mus /gruppe. P-værdier, Students

t

-test, * p. 0,05

Nikotin Eksponering Fremmer Lung metastase, en proces, der afhænger nAChR β2

Cigaretrøg har været eksperimentelt påvist at øge lunge metastatisk tumor byrde [11]. Som flere kemikalier i cigaretrøg kan have denne effekt, vi søgte at specifikt rolle nikotin eksponering i denne proces. Til dette formål har vi vedtaget den murine B16 cellelinie afledt fra spontane murine melanom. Fordi B16-tumorceller har høj lunge metastase potentiale og sådan metastase kan hæmmes af NK-celler, denne model er ideel til at omhandle den rolle, nikotin og dets receptorer i denne patologiske proces. Til dette formål, C57BL /6 rag2

– /- mus blev behandlet med nikotin eller PBS via osmotisk pumpe implantation i 14 dage og fremover. Doseringen Udvælgelsen er baseret på rygere og begrundes nærmere i afsnittet metoder og i vores tidligere publikationer [7], [8]. Disse mus blev derefter udfordret i.v. med 1 × 10

6 B16- melanom celler. Baseret på litteraturen [11], [15], [16], vi forberedelse forsøg, hvor tumor byrde og overlevelsesrater blev sammenlignet hos mus, der fik 1 × 10

5, 2,5 × 10

5, 5 × 10

5, 1 × 10

6 og 2,5 × 10

6 B16 celler.

Be the first to comment

Leave a Reply