PLoS ONE: JS-K, et nitrogenoxid Prodrug, Har Enhanced Cytotoksicitet i Colon Cancer Cells med Knockdown af Thioredoxin reduktase 1

Abstrakt

Baggrund

selenoenzyme thioredoxin reduktase 1 har en kompleks rolle vedrørende cellevækst. Det induceres som en bestanddel af det cellulære respons på potentielt mutagene oxidanter, men også synes at tilvejebringe vækst fordele til transformerede celler ved at hæmme apoptose. Desuden har selenocystein-deficiente eller alkylerede former for thioredoxin reduktase 1 også vist oxidativ, pro-apoptotisk aktivitet. Derfor er en større forståelse af den rolle, thioredoxin reduktase i redox indledt apoptotiske processer berettiget.

Metode

rolle thioredoxin reduktase 1 i RKO celler blev evalueret ved at dæmpe endogene thioredoxin reduktase 1-ekspression med siRNA og derefter enten inducere et selen-deficient thioredoxin reduktase eller behandling med distinkte redox udfordringer, herunder, hydrogenperoxid, et oxideret lipid, 4-hydroxy-2-nonenol, og en nitrogenoxid donerende prodrug. Thioredoxin redox-status, cellulær levedygtighed, og effektor caspaseaktivitet blev målt.

Konklusioner /Signifikans

I celler med svækket endogen thioredoxin reduktase 1, et stabilt integreret selenocystein-deficient form af enzymet blev induceret men ikke ændre hverken thioredoxin redox status eller de cellulære vækst kinetik. Det oxiderede lipid og nitrogenoxiddonoren vist bedre cytotoksicitet når thioredoxin reduktase 1 blev slået ned; Men virkningen var mere udtalt med nitrogenoxid prodrug. Disse resultater er konsistente med den hypotese, at dæmpningen af ​​thioredoxin-systemet kan fremme apoptose i en nitrogenoxid-afhængig måde

Henvisning:. Edes K, Cassidy P, Shami PJ, Moos PJ (2010) JS-K en nitrogenoxid prodrug, har Forbedret cytotoksicitet i Colon Cancer Cells med Knockdown af Thioredoxin reduktase 1. PLoS ONE 5 (1): e8786. doi: 10,1371 /journal.pone.0008786

Redaktør: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, USA

Modtaget: September 18, 2009; Accepteret: December 30, 2009; Udgivet: 20 jan 2010

Copyright: © 2010 Edes et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette projekt blev understøttet af en USPHS Grant CA115616 (PJM). Vi anerkender også brugen af ​​centrale anlæg, der understøttes af P30 CA042014 tildelt den Huntsman Cancer Institute. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling af data og analyse, beslutning om at offentliggøre eller tilberedning af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Dr. Moos er støttet af NIH men projektering og udførelse er hans egen. Dr. Shami er en af ​​stifterne af og holder bestanden i JSK Therapeutics, Inc. Dr. Cassidy og Ms. Edes erklære ingen potentielle interessekonflikter.

Introduktion

pattedyr thioredoxin består af selenoprotein thioredoxin reduktase (TR), thioredoxin (Trx), og elektrondonor NADPH. TR-Trx systemet deltager i forskellige redoxreaktioner i celler [1], fra støtte til DNA-syntese [2] til at redox-afhængig celle-signaleringsveje [3] – [6]. TRX og TR kan lette vækst og /eller overlevelse af maligne celler som deres udtryk er forhøjet i nogle tumorer [7], [8]. Thioredoxin reduktase enzymatisk aktivitet er ikke begrænset til thioredoxin stedet, er blevet identificeret mange substrater, herunder; selenocompounds, ascorbat, lipoate og oxiderede lipider [9] – [11]. Dog i nogen oxiderede lipider funktion inhiberer TR1 aktivitet ved at reagere med den nukleofile C-terminus, der omfatter Sec rest [12] – [14].

Den tilstødende selenocystein (SEC) og cystein (Cys) rester i C-terminalen af ​​mammale TR’er er nødvendige for reduktaseaktivitet når TRX substratet; kan dog Sec-mangelfuld TR1 har biokemiske [15] og biologiske [16] aktiviteter adskiller sig fra Sec-tilstrækkelig TR1, der kan være relevant i kræft eller andre sygdomme. Sec-deficient TR1 har vist pro-apoptotisk aktivitet i studier, der evaluerer rolle TR1 i interferon og retinsyre-induceret apoptose [17], samt nyere understøttende data, der har påvist sec-deficient TR1 arter (udpegede SecTRAPs) er ved selv potente initiativtagere apoptose i menneskelige kræftceller [16]. Apoptose i disse tilfælde hypotese at være medieret af forøget oxidativt stress i cellerne. Disse eksempler antyder, at afbrydelse af den C-terminale ende af TR1 resulterer i en forstærkning af funktion protein, der kunne være en nyttig pro-apoptotisk middel, hvis det kunne målrettes til maligne celler.

I denne undersøgelse har vi undersøgte virkningerne på tyktarmskræft celler fra to scenarier, hvor kanonisk TR1 aktivitet (dvs. evnen til at reducere Trx) er imødegået enten ved siRNA behandling eller mutation af de C-terminale Sec og Cys-rester. Vi begyndte ved at evaluere redox status Trx i RKO kolon kræftceller hvor endogene TR1 niveauer blev svækket med siRNA. I disse samme celler deficiente i vildtype TR1, vi derefter induceret det udtrykte en Sec-deficient TR1 og fandt, at dette protein ændrede hverken TRX redox status eller de cellulære vækstkinetik. Kun i celler under oxidativt stress fra behandling med diamid gjorde vi finde forskelle i TR1-comprimised celler. Dette førte os til at undersøge effekten af ​​TR1 knockdown på en række oxidative stressfaktorer herunder reaktive ilt arter, en elektrofil lipid og en nitrogenoxid (NO) -prodrug. Virkningerne af TR1 udtømning var mest udtalt i kombination med sidstnævnte behandling.

NO har et bredt spektrum af fysiologiske virkninger, herunder udtalte virkninger i kar- og nervesystemet [18], [19]. Det er også lovende som et antineoplastisk farmakologisk middel på grund af dets cytotoksicitet; imidlertid optimale kliniske respons kræver nye leveringsmekanismer af NO til tumoren frem for systemisk indgivelse at undgå de vaskulære bivirkninger [20].

O

2- (2,4-dinitrophenyl) 1 – [(4-ethoxycarbonyl) piperazin-1-yl] diazen-1-ium-1,2-diolat (JS-K) er en prodrug designet til at frigive NO intracellulært [21] derfor undgå generaliserede virkninger på vaskulaturen. Frigivelsen af ​​NO fra JS-K er afhængig af metabolisme ved glutathion S-transferaser (GST’er), og denne afhængighed kan give yderligere neoplastisk selektivitet, da GST’er ofte overudtrykt i kræft [22]. JS-K har vist antineoplastisk effekt i både menneskelige kræftceller samt dyrs modelsystemer [23].

NO kan have forskellige effekter i celler. Fungerer som en oxidant, kan det reagere med metalioner, eller direkte modificere proteiner på cysteinrester danner S-nitrosothioler. Denne modifikation kan modulere protein funktion [24]. Den cellulære redox styring af cystein nitrosylering er et aktivt forskningsområde, og TR-Trx systemet er blevet identificeret som en regulator af dette fænomen [25]. Især har apoptotiske proteiner blevet identificeret som målproteiner modificeret ved nitrosylering [26]. Faktisk er effektoren caspase, caspase-3, er målet for nitrosylering der moduleres ved cytosolisk og mitochondriske Trx systemer [27]. Derfor NO og TR-Trx systemet er integrerende elementer i cellulære processer i programmeret celledød. I den nuværende arbejde strækker vi studiet af denne interaktion til omfatte virkningerne af TR1 på aktiviteten af ​​en vigtig ny kandidat kræft terapeutisk middel, JS-K.

Resultater

pattedyr thioredoxin reduktase uden en Sec mentes at have minimal aktivitet; Men nylige rapporter tyder på, at Sec-mangel thioredoxin reduktase kan have andre redox aktiviteter. Derfor har vi konstrueret en inducerbar cellelinie hvor vi kunne udtrykke et C-terminalt mutant af TR1, der var resistent over for siRNA knockdown. Vi målte ekspressionen af ​​TR1 ved Western blotting og målte TR aktivitet baseret på insulin reduktion samt liponsyre reduktion (figur 1). SiRNA effektivt vælte det endogene TR1 ved -70%, og tetracyclin induktion af stabilt integreret i den C-terminale mutant var -75% af niveauet af det endogene TR1 (figur 1A). Derudover knockdown medførte -70% reduktion af TR-aktivitet som målt ved biokemiske assay af NADPH oxidation med Trx som mellemproduktet og insulin tjener på den endelige elektronacceptor (figur 1B). Da TR1 kan reducere alternative substrater til Trx

in vitro

, vi også vurderet evnen af ​​C-terminale mutant af TR1 at reducere liponsyre i en cellebaseret assay (figur 1C). Adskillige cellulære enzymer kan reducere lipoate men vi observere en ~ 40% formindskelse af lipoate reduktion i RKO celler med endogen TR1 svækket af siRNA og i celler, der udtrykker den C-terminale mutant TR1.

Celler blev eksponeret til siRNA rettet mod TR1 for i alt 96 timer, og en Sec-deficient C-terminale mutant TR1 blev induceret i de sidste 24 timer. A) Immunblotanalyse af TR1 protein ekspression efter siRNA behandlinger og induktion af Sec-deficiente mutant TR1. B) TR biokemisk aktivitet målt i cellelysater ved at overvåge NADPH oxidation i et assay, der er afhængig af Trx og bruger insulin er den endelige elektronacceptor. Den første søjle til venstre repræsenterer aktiviteten af ​​kontrollen (si-Scramble) uden Trx tilsat til reaktionsblandingen, hvilket indikerer baggrundssignal. C) Cell-baserede TR-aktivitet som målt ved liponsyre reduktion i et kolorimetrisk assay under anvendelse af Ellmans reagens. Den første søjle til venstre repræsenterer aktiviteten af ​​kontrollen (si-Scramble) uden liponsyre tilsat til reaktionsblandingen. Lysaterne fra celler med TR1 slået ned viser betydelige reduktioner i aktivitet i sammenligning med kontrolgruppen (si-Scramble) i begge analyser (***, s 0,001).

Da Trx er en primær substrat af TR1 og eftersom andre Sec-deficient TR1 har vist oxidativt stress, målte vi Trx redox status at bestemme, om Sec-deficiente C-terminale mutant TR1 ændret redox status Trx. Vurdering af Trx redox status blev udført ved alkylering med iodeddikesyre, reduktion af oxideret Cys med DTT, og derefter iodacetamid alkylering, som det er blevet beskrevet [28]. Ingen ændringer i Trx redox status observeredes hos cellerne med endogen TR1, celler med TR1 bankede-down, og celler med endogen TR1 bankede-down plus induktion af Sec-deficiente C-terminale mutant TR1 (eksempel datasæt i figur 2 og resumé af flere eksperimenter i tabel 1). Hvis cellerne blev belastet med 1 mM diamid, der blev observeret ændringer i redox status Trx, og en forskel mellem de si-TR1 behandlede celler og si-Scramble var tydeligt antyder, at assayet detekterer ændringer i redox-status efter en oxidativ udfordring .

i celler uden stimulation (venstre tre baner), Trx er primært i reduceret tilstand, selv med TR1 bankede ned og C-terminale mutant TR1 udtryk. Med 1 mM diamid stimulation i 30 min (højre tre baner), celler med endogen TR1 demonstrerer mere reduceret Trx end celler med endogen TR1 bankede-ned med siRNA.

Siden Sec-mangel TR1 har vist øget cytotoksicitet i andre systemer og så en mulighed var, at celler med inducerbare Sec-mangel TR1 ikke breder med samme hastighed som celler med endogen TR1. Vi målte hastigheden af ​​cellevækst efter siRNA knockdown og induktion af ekspression Sec deficient TR1 ved at tælle celle befolkningstal (figur 3). Den cellulære fordoblingstid for alle tre betingelser var ~24 timer, efter en indledende indkøringsperiode. Derfor har denne Sec-mangel TR1 mutant ikke at ændre vækst kinetik de RKO celler som ingen signifikante forskelle i skråningerne af vækstkurver blev målt (0,35 ± 0,004 celler /time i si-Scramble, 0,36 ± 0,006 celler /hr til si-TR1, og 0,33 ± 0,008 celler /time i si-TR1 plus induktion af C-terminale mutant TR1).

a scrambled siRNA blev anvendt som en kontrol for at måle basal vækstrate (fyldt firkant) TR1 blev slået ned af siRNA (udfyldt cirkel) og med induktion af Sec-mangelfuld, C-terminal mutant TR1 (fyldt trekant). Ingen signifikante forskelle i vækstraterne blev observeret som de fuldt optrukne linjer anvendes til beregning af vækstrater for disse betingelser er næsten parallelle.

Da den inducerede ekspression af Sec-mangelfuld C-terminale mutant TR1 konstruktion gjorde ikke fremkalder en ændring i redox status Trx, evaluerede vi den cytotoksiske respons af RKO-celler med endogen TR1 samt celler, hvor det TR1 var svækket med siRNA til reaktivt oxygen og nitrogen i form af H

2O

2 er den oxiderede lipid 4-HNE eller NO-donor JS-K (figur 4). Levedygtighed efter H

2O

2 eksponering var ikke forskellig (figur 4A); 4-HNE eksponering viste en beskeden, ca. 2 gange øget følsomhed i cellerne med TR1 bankede-down med en LC

50 forskel på 10,6 ± 0,7 pM i cellerne med TR1 slået ned mod 24 ± 3,4 uM i cellerne med endogen TR1 (figur 4B); NO donor, JS-K, demonstrerede -6 gange øget følsomhed i cellerne med TR1 svækkede af siRNA med en LC

50 forskel på 3,1 ± 0,5 uM i cellerne med TR1 bankede ned mod 19 ± 2 uM i cellerne med endogen TR1, som målt med en MTT assay (figur 4C).

celler med endogen TR1 (si-Scramble, fyldt firkant), og celler med TR1 bankede ned af siRNA (si-TR1, udfyldt cirkel) blev sammenlignet ved ækvivalente doser af redox modulatorer. A) RKO-celler blev behandlet med stigende koncentrationer af H

2O

2 og levedygtigheden blev målt efter 24 timers eksponering. Der blev ikke påvist signifikante forskelle. B) RKO-celler blev behandlet med stigende koncentrationer af 4-HNE og levedygtigheden blev målt efter 24 timers eksponering. Si-TR1 celler udviste ~ 2-fold øget følsomhed over for 4-HNE. C) RKO-celler blev behandlet med stigende koncentrationer af JS-K og levedygtigheden blev målt efter 24 timers eksponering. SI-TR1 celler vises -6 gange øget følsomhed over for JS-K.

Da NO-donor fremmet en mere fremtrædende forskel i levedygtighed mellem RKO celler med endogen TR1 sammenlignet med cellerne med TR1 bankede-down, yderligere vurdering af cellulær redox-status blev udført for at evaluere den mekanisme af NO-medieret forøget cytotoksicitet. Første, baseret på de store forskelle i cellelevedygtighed observeret i MTT-assayet, blev TRX redox status vurderes efter 5 uM JS-K inkubation. JS-K behandlede TR1 Knockdown celler udviste en mere oxideret fordeling af Trx redoxtilstande efter 90 minutters inkubation med NO prodrug (tabel 2). Dernæst blev en mere generel vurdering af den oxidative cellernes tilstand vurderes efter 5 uM JS-K-behandling i 24 timer ved at måle forholdet mellem reduceret GSH til de samlede GSH-indholdet. Ingen signifikante forskelle i reduceret GSH til de samlede GSH blev observeret (figur 5). Disse data antyder, at en global ændring i redox-status ikke blev observeret, men at vælge proteiner kunne målrettes. Salg

GSH målinger blev foretaget efter behandling med 5 um JS-K i 24 timer., Og forholdet mellem den reducerede GSH til den samlede GSH blev målt. Ingen signifikante forskelle blev observeret blandt behandlingsgrupperne.

For at bestemme mekanismen bag ændringerne i cellulær levedygtighed som bestemt ved MTT-assayet, immunoblotanalyse af caspase 3 og den DNA-reparation protein poly ADP ribose polymerase (PARP) blev evalueret (figur 6). Spaltet caspase 3 er i overensstemmelse med indledningen af ​​apoptose og mængden af ​​caspase 3 spaltning syntes at være mere omfattende, når TR1 blev slået ned. Spaltet PARP blev også observeret i disse eksperimenter på en dosisafhængig måde.

RKO-celler behandlet med vehikel, 1,5 eller 5 uM JS-K i 24 timer. Protein blev separeret ved SDS-PAGE og påvist med immunoblotanalyse. En dosis-afhængig stigning i spaltet PARP og caspase 3 (CASP3) blev observeret med mere spaltede materiale i TR1 knockdown. GAPDH blev evalueret som en belastning kontrol

Bevis for apoptose indledning blev observeret ved både 1,5 og 5 uM JS-K i immunoblotanalyse.; derfor, det cellulære levedygtighed og cytotoksicitet, hvor re-evalueres efter 1,5 uM JS-K inkubation (hvor cellerne stadig vises 75% levedygtige, figur 4) er baseret på protease-aktivitet ved hjælp af MultiTox analysen. This assays syntes at være mere følsomme end MTT-assayet, da selv ved denne lave dosis, JS-K i signifikant cytotoksicitet og /eller tab af levedygtighed i de TR1 Knockdown celler (~45% levedygtige) sammenlignet med celler med endogene niveauer af TR1 (~68% levedygtige, figur 7A og 7B). Næste den relative caspase-3/7-aktivitet blev målt og i overensstemmelse med cytotoksicitetsdata, var der en signifikant forøgelse af caspaseaktivitet i cellerne med TR1 bankede-down (Figur 7C). I separate eksperimenter, det brede spektrum konkurrencedygtig caspaseinhibitor, Z-Asp-CH

2-DCB, blev medtaget under inkubationen med JS-K bekræfter den enzymatiske aktivitet tidligere observerede var caspase-afhængig aktivitet.

RKO-celler behandlet med 1,5 pm JS-K i 24 timer. blev bedømt for A) levedygtighed, B) cytotoksicitet, og C) caspase-3/7-aktivitet. I separate eksperimenter blev celler inkuberet med Z-Asp-CH

2-DCB, et bredt spektrum, konkurrencedygtig caspaseinhibitor, at fastslå, at caspase-assayet faktisk blev demonstrerer effektor caspaseaktivitet (C). RKO celler med TR1 bankede ned demonstrerer signifikant større tab i levedygtighed, øget cytotoksicitet og øget caspase-3/7 aktivitet efter JS-K behandling end RKO celler med endogen TR1 (**, p 0,01, ***, s 0,001, †††, s. 0,001)

diskussion

Mens selenoprotein niveauer er generelt afhængige af selen og selen-mangel synes at resultere i øget risiko for dødelighed af kræft [29] kan TR1-Trx systemet være usædvanligt blandt selenoenzymes i sin evne til at fremme kræft [8], [30]. Faktisk TRX ofte overudtrykt i mange tumorer kan have anti-apoptotiske egenskaber, og kan bidrage til nogle former for terapi resistens [7], [31] – [34]. Ud fra dette perspektiv, inhibering af TR1 er et fremragende mål til at inhibere reduktionen af ​​thioredoxin i nærvær af yderligere oxidativ stress. Også flere almindeligt anvendte terapeutiske midler, som cisplatin, cyclophosphamid, doxorubicin og synes at målrette thioredoxin reduktase samt DNA [35] – [39]. Vores resultater tyder på, at svækkelse af TR1 er utilstrækkelig til at ændre væksten status af celler, men at passende redox stress efter svækkelse af TR1 kan være det mest effektive middel til at nå et cytotoksisk reaktion.

antiapoptotisk aktivitet Trx har blevet placeret som begrundelse for at målrette TR-Trx systemet i human cancer [40], [41]. Den seneste observation, at TR-Trx systemet modulerer aktiviteten af ​​caspase-3 i en nitrosylering-afhængig måde [27] foreslår en fremtrædende rolle for TR-Trx systemet i NO-medieret apoptotisk aktivitet. I dette arbejde, vi observerer også, at NO prodrug, JS-K, øger apoptose når TR1 er slået ned med siRNA (figur 4 og 6). Denne mekanisme er i overensstemmelse med tidligere mekanistisk data demonstrerer øget caspase aktivitet i akut myeloid leukæmi celler [42]. Desuden NO-donere aspirin demonstreret synergi, når det kombineres med guld forbindelser, der menes at primært målrette TR-Trx-systemet [43].

rolle TR1 i apoptose har været genstand for undersøgelse siden det blev identificeret som en “GRIM” gen (dvs. gener associeret med retinoid-IFN-induceret mortalitet Grim 12) i en screening for gener relateret til retinoid-IFN-induceret apoptose [17]. For nylig er det blevet påvist, at TR1 protein uden et funktionelt Sec rest skyldes alkyleringen eller trunkering, når den indføres til celler med

BioPORTER

, apoptose [16], [44]. Men mekanismerne i TR-medieret apoptose efter TR1 SecTRAPs fortsat ukendt. Mutanten TR1 vi udnyttet, med C-terminus Gly-Ser-Ser-Gly, var ikke en funktionel thioredoxin reduktase som målt ved NADPH oxidation /insulin reduktion samt liponsyre reduktion (figur 1); Men det heller ikke ud til at fungere som en SecTRAP apoptotisk initiator som beskrevet af Arner og kolleger [16]. Svarende til en tidligere rapport [45], var vi i stand til at identificere basale ændringer i Trx eller cellulær redox status, når TR1 blev slået ned med siRNA (figur 2, tabel 1), men gjorde observere ændret Trx redox status efter JS-K behandling ( tabel 2). Derudover er ekspressionen af ​​denne Sec-deficient mutant TR1 ændrede ikke den oxidative status Trx. Derfor ser det ud til, at ikke alle Sec-mangelfulde TR proteiner fremmer oxidativt stress og apoptose.

Målretning TR1 for kræftbehandling kan ikke være uden uønskede bivirkninger, hvis det ikke er rettet mod tumoren. For eksempel tumor suppressor, p53, er en vigtig regulator af cellevækst og apoptose, og TR1 forbedrer p53-funktion, formentlig ved at bidrage reducerende ækvivalenter gennem Trx til den nukleare redox regulator Ref-1 [12], [13], [46 ], [47]. Flere almindeligt anvendte terapeutiske midler, som cisplatin, cyclophosphamid, og doxorubicin synes at målrette TR1 samt DNA [35] – [39], men måske en årsag til nogle af de negative virkninger observeret med disse fælles terapeutiske midler, kan være den ” off-target “hæmning af TR1. En anden redox modulerende stof, der er blevet evalueret i kræft kliniske forsøg motexafin gadolinium, blev anset for at specifikt at målrette TR1 [7]. Imidlertid synes motexafin gadolinium at være et substrat for TR1 og genererer reaktive oxygenarter gennem denne interaktion samt være en inhibitor af ribonukleotidreduktase [48]. Hvis dette stof kliniske aktivitet er virkelig grund af dets interaktioner med TR1, er det stadig uklart, hvilke tumorer bør målrettes, da dette stof har vist blandede resultater i kliniske forsøg til dato [49] – [51], men det ser ud til at holde særligt løfte som en stråling sensibilisator [52], [53].

Selv med potentielle komplikationer af målretning TR1 i kræft, resultaterne heri tyder på, at narkotika kombination tilgange, ligesom NO-donor, JS-K, måske mest effektiv, hvis den kombineres med midler, der er målrettet mod TR1.

Materialer og metoder

Materialer

Avanceret DMEM, Glutamax, 5,5 ‘, 6,6’-tetrachlor-1, 1 ‘, 3,3’-tetraethylbenzimidazolyl-carbocyanin iodid (JC-1, MitoProbe JC-1 Assay Kit), 3- (4,5-dimethylthiaxol-2-yl) -2,5-diphenyltretraxolium (MTT), Hanks balancerede saltopløsning med Ca og Mg (HBSS) blev Tris-glycin 8% geler og bovint serumalbumin købt hos Invitrogen (Carlsbad, CA). Føtalt bovint serum blev indkøbt fra Hyclone (Logan, UT). The RKO-cellelinien blev erhvervet fra American Tissue Type Culture Collection (Manassas, VA). Monoklonale antistoffer rettet mod thioredoxin reduktase (B-2, SC-28321, lot # J1304); polyklonale antistoffer rettet mod thioredoxin (FL-105, SC-20146, lot # A1907), og GAPDH (FL-335, SC-25.778); æsel polyklonale anti-mus og anti-kanin-antistoffer konjugeret med peberrodsperoxidase blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Yderligere polyklonale antistoffer rettet mod caspase 3 (9661), spaltet caspase 3 (9662), og PARP (9532) blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Bovint serumalbumin standard og Coomassie Plus Protein Reagent var fra Pierce Biotechnology (Rockford, IL). Proteaseinhibitorcocktail tabletter (complete®) blev indkøbt fra Roche (Indianapolis, IN). PVDF-membran blev indkøbt fra Millipore (Burlington, MA). Caspaseinhibitoren, Z-Asp-CH

2-DCB, var fra Peptides International (Louisville, KY). Vestlige Belysning kemiluminescens reagenser var fra PerkinElmer Life Sciences (Boston, MA). JS-K blev syntetiseret som tidligere beskrevet [54]. Dimethylsulfoxid (DMSO) og fælles buffere og salte blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

Cellekultur

RKO coloncancer celler blev anvendt som en repræsentativ kolon cellelinie og blev opretholdt i Advanced DMEM suppleret med 1% Glutamax og 2% føtalt bovint serum. Tidligere beskrev vi den site-styret mutagenese af C-terminalen af ​​TR1 fra Gly-Cys-Sec-Gly til Gly-Ser-Ser-Gly plus en tavs mutation i siRNA identitet websted for at gøre dette konstrukt resistent over for siRNA rettet mod endogene TR1. Vi subklonede dette muterede TR1 konstruktion i pcDNA5 /FRT /TO og derefter indsat i de RKO celler med stabilt integrerede pcDNA6 /TR og pFRT /

lac

Zeo, hvilket gør en tetracyklin inducerbar mutant TR1 cellelinje. Disse mutationer til TR1 samt siRNA anvendes til at modulere endogen TR1 er tidligere beskrevet [13]. Eksperimentelt blev cellerne udpladet med 2-3 x 10

5 celler /brønd plade brønd i 6 og transficeret med siRNA rettet mod TR1 (si-TR1) eller kontrol genereret af scrambling Si-TR1 sekvens (SI-Scramble) i 72 timer. Derefter blev cellerne behandlet eller stimuleret med tetracyclin i 24 timer som angivet.

Immunblotanalyse

Celler i plader med 6 brønde blev anbragt på is. Medier blev opsuget, og cellerne blev derefter vasket med 1 ml kold 1 × PBS, og PBS aspireret. Cellelysater blev indsamlet som tidligere beskrevet [13]. Proteinkoncentrationer blev bestemt under anvendelse af Coomassie Plus Protein Reagent (Pierce). Absorbans ved 595 nm blev målt under anvendelse af et Perkin-Elmer Victor

3V pladelæser. Ti til 15 ug protein blev separeret på enten 8% Tris-glycin geler (for TR1) eller 10% native urinstofgeler (for Trx), overført til PVDF-membran, blokeret med 10% fedtfri tørmælk, inkuberet med primært antistof (1:200 for TR, 1:250 for Trx, 1:1000 for både caspase 3 og spaltes caspase 3, 1:1000 for PARP, og 1:500 for GAPDH) natten over ved 4 ° C, vasket 3 ×, inkuberet med sekundært antistof (1:5000) i 45 minutter ved 22 ° C, vasket 3 ×, inkuberet med kemiluminescens reagenser, og udsat for røntgenfilm.

Thioredoxin reduktase aktivitetsassays

Cellular TrxR1 aktivitet blev målt som tidligere beskrevet [13]. Derudover målte vi liponsyre reduktion svarende til en tidligere beskrevet assay [55]. Kort beskrevet blev celler udpladet og behandlet som beskrevet. Derefter blev cellerne trypsiniseret, vasket med PBS og resuspenderet i en opløsning af 1 ml indeholdende 5 mM glucose i PBS med eller uden 1 mM liponsyre og 0,2 mM DTNB med forsigtigt at ryste ved 37 ° C i 15 minutter. Cellerne blev centrifugeret, og supernatanten prøven blev fortyndet 1:01 med vand, og absorbansen blev målt ved 412 nm. Den negative kontrol var medium uden celler. Cellepelleten blev vasket med PBS, lyseret celler i lysisbuffer og proteinet målt under anvendelse af Bradford-assayet. Det reducerede lipoate blev normaliseret ved det cellulære proteinindhold.

Redox status Trx

redox status Trx blev udført som beskrevet [28]. Kort fortalt blev cellerne lyseret i 8 M urea bufret med Tris til pH 8,9 indeholdende 30 mM iodeddikesyre, sonikeret og inkuberet i 15 minutter ved 37 ° C. Protein blev precipated med 10 volumener iskold acetone-IN HC1 (98:2, vol /vol), centrifugeret ved 11.000 x g i 5 min ved 4 ° C, vaskes med kold acetone-HCI, resuspenderet i 95 pi bufferet urinstof indeholdende 35 mM DTT, inkuberet i 30 minutter ved 37 ° C, 7,5 pi 200 mM iodacetamid var føje til hver prøve og inkuberet i 15 minutter ved 37 ° C. Proteinkoncentration blev estimeret ved hjælp af Coomassie Plus Protein Reagent.

MTT assay

Cellulær levedygtighed blev bestemt ved anvendelse af en MTT som tidligere beskrevet [56], som bygger på tetrazoliumsalt reduktion af NADH i levedygtige celler ( Berridge

et al.

, 2005).

glutathion kvantificering

Reduceret glutathion (GSH) og total GSH blev målt under anvendelse GSH-GLO reagenser (Promega). Ca. 2,5 x 10

3-celler, der var præinkuberet med siRNA rettet mod TR1 blev udpladet i hvid sidet 384 brønds plader, fik lov til at klæbe, og derefter behandlet med 0 eller 5 um JS-K i 24 timer. Mediet blev fjernet ved centrifugering blev det reducerede GSH direkte målt ifølge fremstillingsinstruktioner, og den samlede GSH blev målt ved at inkubere cellerne med 1 mM TCEP at reducere oxideret GSH. Dette assay er et glutathion-S-transferase-afhængige assay, der anvender GSH at generere luciferin som et substrat for luciferase at generere lys. Luminescens blev målt ved anvendelse af et Perkin-Elmer Victor

3V pladelæser.

MultiTox assay

levedygtighed og cytotoksicitet målinger blev vurderet ved differentiel protease aktiviteter, hvor MultiTox-Fluor Multiplex assay (Promega) . Dette assay anvender et GF-AFC substrat, som er celle gennemtrængelig at vurdere de levedygtige celler, og en bis-AAF-R110 substrat, der ikke cellepermeable at vurdere proteaseaktiviteten fra døde celler. Fluorescensen fra disse substrater blev målt ved anvendelse af et Perkin-Elmer Victor

3V pladelæser; GF-AFC levedygtighed substrat blev målt ved 405 nm excitation, 475 nm emission; og bis-AAF-R110 cytotoksicitet substrat blev målt ved 485 nm excitation, 535 nm emission.

Caspase aktivitetsassay

Effector caspase-aktivitet blev målt ved anvendelse af Caspase-GLO 3/7 Assay ( Promega) ifølge producentens instruktioner. Dette er et assay, hvor en DEVD peptidsubstratet spaltes af aktive caspaser at frigive aminoluciferin som et substrat for luciferase til at producere lys. Luminescens blev målt ved anvendelse af et Perkin-Elmer Victor

3V pladelæser.

Statistisk analyse

1-ANOVA blev anvendt til bestemmelse statistisk signifikans blandt prøver (GraphPad InStat Version 3.06). Bonferroni flere sammenligninger post hoc test blev anvendt til at etablere betydning blandt behandlingsgrupperne med p 0,05 anses for væsentlig

.