PLoS ONE: Påvisning af Novel Amplikoner i prostatakræft ved Omfattende Genomisk profilering af prostatakræft-cellelinier Brug Oligonucleotid-Based ArrayCGH

Abstrakt

Baggrund

Formålet med denne undersøgelse var at bevise gennemførligheden af ​​en longmer oligonukleotid microarray platform til at profilere genkopiantallet ændringer i prostata cancer cellelinjer og hurtigt angive nye kandidatgener, som kan spille en rolle i carcinogenese.

Metoder /Resultater og Fund

genom-dækkende screening for regioner af genetiske gevinster og tab på ni prostata kræft cellelinier (PC3, DU145, LNCaP, CWR22, og afledte underlinjer) blev udført ved hjælp af komparativ genomisk hybridisering på en 35.000 funktion oligonukleotid microarray (arrayCGH). Sammenlignet med konventionel kromosomal CGH, flere deletioner og små områder af gevinster, især i pericentromeric regioner og regioner siden af ​​telomerer, blev opdaget. Som validering af høj opløsning af arrayCGH vi yderligere analyseret en lille amplikon på 1,7 MB på 9p13.3, som blev fundet i CWR22 og CWR22-RV1. Øget kopi nummer blev bekræftet ved fluorescens

in situ

hybridisering ved hjælp af BAC-klon RP11-165H19 fra den forstærkede område, der omfatter de to gener interleukin 11 receptor alpha (

IL11-RA

) og dynactin 3 (

DCTN3

). Brug kvantitativ real time PCR (qPCR) kunne vi vise, at

IL11-RA

er genet med det højeste antal kopier gevinst i cellelinjer sammenlignet med

DCTN3

tyder

IL11-RA

at være amplifikationen målet. Screening af 20 primære prostata carcinomer ved qPCR afslørede en

IL11-RA

kopi nummer gevinst i 75% af de analyserede tumorer. Gain af

DCTN3

blev kun fundet i to tilfælde sammen med en gevinst på

IL11-RA

.

Konklusioner /Betydning

ArrayCGH hjælp longmer oligonucleotid microarrays er muligt for høj opløsning analyse af chomosomal ubalancer. Karakterisering af en lille vundet region ved 9p13.3 i prostatakræft-cellelinjer og primære prostatakræft prøver ved fluorescens

in situ

hybridisering og kvantitativ PCR har afsløret interleukin 11 receptor alpha-gen som en kandidat mål for forstærkning med en forstærkning frekvens på 75% i prostata karcinomer. Hyppig forstærkning af

IL11-RA

i prostatakræft er en potentiel mekanisme af

IL11-RA

overekspression i denne tumortype

Henvisning:. Kamradt J, Jung V, Wahrheit K, Tolosi L, Rahnenfuehrer J, Schilling M, et al. (2007) Påvisning af Novel Amplikoner i prostatakræft ved Omfattende Genomisk profilering af prostatakræft-cellelinier Brug Oligonucleotid-Based ArrayCGH. PLoS ONE 2 (8): e769. doi: 10,1371 /journal.pone.0000769

Academic Redaktør: Stefan Maas, Lehigh University, USA

Modtaget: Juli 5, 2007; Accepteret: 18 Juli 2007; Udgivet: 22 August, 2007

Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Public Domain erklæring hvori det hedder, at når det først er i det offentlige rum, dette arbejde kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål

Finansiering:. Deutsche Forschungsgemeinschaft indrømme nummer KA1793 /1-1, Bundesministerium für Bildung und Forschung, tildele nummer 01GR0453, BioSapiens Network of Excellence EU kontrakt nummer LSHG-CT-2003-503265

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Genetiske ændringer menes at være nøglen begivenheder i udviklingen af ​​de fleste tumorer, herunder prostatacancer [1]. Tumor progression synes at afhænge af den successive køb af kromosomafvigelser, der fører til gevinster eller tab af en del af tumor celle genom. Karakterisering af disse genomiske abnormiteter i prostatakræft kan derfor bidrage til at forstå den molekylære patogenese og kan afsløre genetiske markører for progression.

Siden sin første beskrivelse af Kallioniemi et al. (1992) [2] kromosomal komparativ genomisk hybridisering (cCGH) er blevet den mest anvendte teknik til at detektere DNA kopital ændringer i tumor genomer. Vi og andre har analyseret genomet af prostatakræft-cellelinier og primære prostatacancer prøver med denne teknik [3] – [5]. Fluorescens

in situ

DNA-hybridisering (FISH) og kvantitativ realtids-PCR har vist sig at være værdifulde værktøjer til målgen opdagelse inden identificerede kromosomale regioner af forstærkning, f.eks

TLOC1 /sec62

gen ved 3q26.2 i prostatakræft [6]. Anvendelse af avancerede bioinformatiske modeller på cCGH data viste, at mønstrene for kromosomafvigelser indeholder værdifulde prognostisk information af en tumor [7].

På grund af den relativt lave rumlig opløsning (~20MB) af cCGH og dens unøjagtighed i centromerregionen som samt telomere regioner denne teknik er hverken i stand til i tilstrækkelig grad at detektere små områder af gevinster eller taber heller genomiske ændringer siden centromeren eller telomer. Også for target gen identifikation i vundet regioner findes ved cCGH, fin-kortlægning med teknikker som FISH er besværlig og tidskrævende.

I forhold til cCGH, microarray-baserede CGH, kaldet matrix CGH (aCGH ) eller matrix CGH [8] – [9], har en nogenlunde 1.000 gange højere opløsning (eller endnu højere) og tillader analyse af kromosomale områder nær centromeren og telomer. Forskellige tilgange af aCGH blevet fulgt gennem årene. Flere grupper udnyttede genomiske BAC arrays [10], mens andre har valgt cDNA eller oligonucleotid arrays, der oprindeligt var designet til udtryk analyse [9], [11]. Arrays konstrueret til genekspression er fordelagtige til direkte sammenligning af genomiske ændringer og genekspression på samme platform. Flere undersøgelser har vist, at denne fremgangsmåde viser en signifikant sammenhæng mellem genkopital og ekspressionsniveauet [12], [13]. Sidst, brug af oligonucleotid arrays specielt til aCGH designede længere blev rapporteret [14] og er nu købes som en aCGH platform. For aCGH analyser af prostatakræft-cellelinier samt kliniske prøver enten BAC eller cDNA arrays er blevet anvendt [12], [13], [15] – [20].

Her præsenterer vi den første undersøgelse udnytte en 35.000 funktion 70-mer oligonucleotid array, oprindeligt designet til udtryk analyse, for detaljeret genomisk karakterisering af ni prostata cancer cellelinjer. Resulterende aCGH profiler er sammenlignet med cCGH resultater. Forekomsten af ​​en nyligt opdaget lille amplikon i pericentromeric 9p13.3 underbånd i forskellige cellelinjer er valideret af FISH og kvantitativ real time PCR og bekræftes også i primære prostatakræft prøver.

Materiale og metoder

tumorcellelinjer samt DNA-isolering

human prostatacancer-cellelinier DU145, PC3, LNCaP, CWR22 og CWR22-RV1 blev opnået fra American Type Cell Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA) og dyrket ifølge protokollerne anbefalet af ATCC. Fra PC3 og DU145, to forskellige grene var til rådighed, den ene holdt i laboratoriet for Cancer Genetic Branch, NHGRI, NIH (PC3

NIH

, DU145

NIH

) , den anden i den urologiske laboratorium i Homburg (PC3

HOM

, DU145

HOM

). PC3-N, PC-125-1L, og DU145-MN1 blev etableret som beskrevet tidligere [21], [22]. LNCaP-CN4-2 blev venligst stillet til rådighed af Z. Culig, Urologisk afdeling, Medical University, Innsbruck, Østrig.

Primær prostatakræft prøver

Kvantitative genkopital målinger blev udført på 20 primære prostataadenocarcinom prøver, som blev opnået efter radikal prostatektomi fra tidligere ubehandlede patienter med prostatacancer. Efter prostatektomi blev prøverne dissekeret af en patolog, hurtigt nedfrosset og opbevaret ved -80 ° C. Kun prøver indeholdende . 50% tumorceller indgik i undersøgelsen

DNA isolation og kvantificering

DNA blev isoleret ved hjælp af Qiamp DNA isolation (Qiagen, Hilden, Tyskland) og efterfølgende kvantificeres ved en fluorometrisk assay (Quant-iT Pico Green dsDNA Kit, Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland). Fluorescens blev målt under anvendelse af en TECAN (Salzburg, Østrig) SpectrafluorPLUS mikroplade fluorescenslæser med en excitationsbølgelængde på 485 nm og en emissionsbølgelængde på 535 nm. DNA-koncentrationer blev beregnet fra en standardkurve af dobbeltstrenget kontrol-DNA tilvejebragt med kittet, der blev målt i tre eksemplarer ved koncentrationerne 30, 3, 0,3 og 0,03 ng /pl (målt ved fluorometri).

Whole genomamplifikation og oprensning

Et volumen på 2,5 pi ud af 4 ng /pl fortyndinger fra cellelinier og kontrol DNA blev anvendt som udgangsmateriale til amplifikation. Den phi29-amplifikation blev udført ifølge den Repli-G kit producentens instruktioner (Qiagen) under anvendelse af en inkubationstid på 16 timer. Repli-G reaktioner blev kontrolleret af en real time baseret intra

Alu

-PCR assay. Derudover DNA-koncentrationen blev fluorimetrisk kvantificeret med Quant-iT Pico Green dsDNA Kit (Invitrogen) og lå på mellem 10-30 ug.

Alu-PCR assay

På grund af en ofte observeret baggrund syntese i Repli-G amplificerede kontrol uden template, udførte vi en ekstra kvalitetskontrol af 1 pi (1:50 fortynding) af urenset phi29-amplificeret DNA. En

Alu

specifikt bånd bør være til stede i alle Repli-G forstærkede prøver og fraværende i Repli-G forstærkede kontrol uden template. Hver 2 pi prøve blev sammenlignet med 1 pi seriefortyndinger af mandlig kontrol-DNA (Promega, WI, USA) (10, 5, 2, 1, 0,5, 0,1, 0,01, 0,001 ng /pl). De 25 pi reaktioner indeholdt 1 × Hot starte SYBR grøn mester mix (Qiagen), 1,5 mM MgCl

2, 0,2 mM dNTP’er Mix, 400 nm primere hver (

Alu

-forw: 5′-GTGGGCTGAAAAGCTCCCGATTAT- 3 ‘og

Alu

endnu dybere: 5′-ATTCAAAGGGTATCTGGGC TCTGG-3′). Cykliseringsbetingelserne var som følger: 1 min ved 94 ° C; 35 cykler af 20 sekunder ved 94 ° C, 20 s ved 55 ° C og 20 sekunder ved 72 ° C; 10 min ved 72 ° C. Amplifikationsprodukterne blev kontrolleret ved at smelte kurve analyse ved anvendelse af LightCycler ™ kvantificering software 3.5 (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) og gelelektroforese. Amplifikation blev betragtet som en succes, når mængden af ​​human

Alu

sekvenser i phi29 genereret DNA-fragmenter var i området fra 10-30%, og når en udstrygning af DNA-fragmenter, der spænder fra 1 til 20 kb, var synligt ved gelelektroforese.

ArrayCGH

10 ug amplificeret og oprenset DNA blev mærket ved anvendelse af BioPrime Array CGH Genomisk Labeling-kit (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner i et volumen på 50 pi med en modificeret dNTP-blanding indeholdende 120 pM hver af dATP, dGTP og dCTP; 60 pM dTTP; og 60 uM Cy5-dUTP eller Cy3-dUTP. Mærkede DNA blev oprenset under anvendelse af QIAquick PCR Purification søjler (Qiagen). Tumor og reference-DNA blev samlet, blandet med 50 ug Cot-1-DNA (Invitrogen) og koncentreret til et volumen på 20 pi i en vakuum centrifuge. DNA blev derefter blandet med en lige mængde på 2 × formamid buffer, denatureret ved 95 ° C i 5 minutter og præinkuberet ved 37 ° C i 30 minutter i vandbad.

Hybridiseringer blev udført på brugerdefinerede (trykt på de NHGRI /NIH Microarray Core Facility) objektglas indeholdende operonet 70mer oligonukleotidsæt version 3 med 34.580 oligonukleotider. Oligonukleotiderne blev oprindeligt udviklet til ekspressionsanalyse. For arrayCGH alle oligonukleotider blev sekvens justeret mod det humane genom (bygge 34), Ensembl, RefSeq, dbest og UCSC kendte gener resulterer i 29.383 oligonukleotider med en specifik kromosomal kortlægning.

DNA-prøver blev hybridiseret på array til 16 -18 timer ved 42 ° C udnytte den MAUI 4-bay hybridisering systemet og MAUI Mixer A0 (BioMicro system, Salt Lake City, UT, USA). Efter hybridisering arrays og MAUI Mixer blev skilt ad i 42 ° C 1 x SSC og 0,05% SDS (vaskeopløsning 1) og efterfølgende vasket to gange i vaskeopløsning 1 i 5 minutter efterfulgt af to vaske i 0,1 x SSC (vaskeopløsning 2) til 5 minutter. Tørrede array-objektglas blev scannet under anvendelse af et ScanLite Express microarray scanner (Perkin Elmer, Wellesley, MA, USA). Rå billedfiler af arrays blev behandlet ved hjælp DeArray software [23] og deraf billeddata blev importeret til R miljøet ved hjælp BioConductor pakker [24] til yderligere analyse.

databehandling og statistisk analyse af microarray data

Den statistiske analyse til at identificere kromosomale regioner med ændrede kopi numre i enkelte arrays bestod af to trin. Først, efter at kortlægge de målte genkopital log-forhold til deres respektive kromosom steder, udjævning blev anvendt. De adaptive vægte udjævning-baserede algoritme GLAD [25] til at identificere områder med konstant kopi nummer blev brugt. Denne algoritme passer en stykvis konstant funktion langs kromosomet til log-forhold. Så for blev identificeret hver prøve regioner, som er amplificeret eller slettet. Her blev normalfordelinger monteret på en robust måde til de udglattede log-forhold af hver opstilling. Især blev medianen og interkvartile område beregnes, samt en normalfordeling blev tilpasset til disse parametre. Endelig blev konstante regioner med værdier over eller under bestemte cutoffs detekteret som vundet eller tabt regioner hhv. For at skelne mellem svage og stærke signaler, medianen plus eller minus én eller to standardafvigelser blev udvalgt som cutoffs for svage og stærke afvigelser, hhv. Algoritmerne blev gennemført på det sprog, R programmering (www.r-project.org). Resultaterne blev opnået ved hjælp af R-version 2.3 og GLAD bibliotek leveres af BioConductor projektet (www.bioconductor.org), version 1.7.

Kromosomal CGH

Hybridisering blev udført som beskrevet tidligere med mindre modifikationer [26]. 500 ng biotin mærket probe-DNA, 500 ng digoxigenin-mærket reference-dna (human mandlig henvisning DNA, Promega, WI, USA) og 50 ug humant umærket cot-DNA (Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland) blev udfældet med 0,3 M natriumacetat i 2,5 fold volumen ethanol og opløst i 2,5 pi deioniseret formamid. Efter 30 minutter blev 2,5 pi af den dobbelte hybridiseringsblanding (100 mM natriumphosphatpuffer, 4 x SSC og 20% ​​dextransulfat, pH 7,0) tilsat, og denatureret i 5 minutter ved 75 ° C efterfulgt af 15 min preannealing ved 37 ° C. Hybridiseringen blev udført under forseglede dækglas i 3 dage ved 37 ° C i et fugtigt kammer. Efter hybridisering blev objektglassene vasket tre gange i 5 minutter i en vaskeopløsning (50% formamid i 2 x SSC, pH 7,0) ved 45 ° C, to gange i 2 x SSC (pH 7,0) ved 45 ° C, og en gang i 0,1 × SSC (pH 7,0) ved 45 ° C.

Biotinyleret probe DNA blev påvist med FITC-mærket streptavidin (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Den digoxigenized kontrol-DNA blev påvist med rhodamin mærket anti-digoxigenin antistoffer (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland). Endelig blev objektglassene kontrastfarvet, og en antifade opløsning anvendes på samme trin (Vectashield med DAPI, Vector Laboratories).

Objektglas blev analyseret under anvendelse af et digitalt billedanalysesystem (MetaSystems, Altlussheim, Tyskland), baseret på en Olympus AX 70 mikroskop udstyret med et afkølet CCD-kamera (Photometrics, Tucson, AZ, USA). For at analysere forskellen fluorescens data brugte vi MetaSystems ISIS 3 software. De tre-farvebilleder med rød, grøn og blå blev erhvervet fra 15-20 metafaser. blev påvist kromosom ubalancer på grundlag af fluorescensforholdet profil, der afviger fra den balancerede værdi (FITC: rhodamin = 1). For hvert kromosom Det endelige forhold værdier blev fremstillet ud fra middelværdier af mindst ti kromosom homologer fra separate metafasespredninger. CGH resultater blev afbildet som en serie af grøn til rød forholdet profiler, og fortolkningen af ​​resultater fulgte tidligere beskrevne protokoller [3].

Fluorescens in situ hybridisering

FISH blev udført på kerner og metafase spreads af cellelinier CWR22 og CWR22-RV1. Metafasespredninger af lymfocytter fra en rask donor blev anvendt som kontrol. BAC klon RP11-165H19 (9p13.3, Genbank AQ382511) blev opnået fra BacPac Ressourcecenter Børnehospital (Oakland Research Institute, Oakland, CA, USA) og cohybridized med en probe specifik for centromeren af ​​kromosom 9 (D9Z1; ONCOR, Gaithersburg, MD, USA). Bakteriekulturer og DNA isolation blev udført i henhold til den BacPac Miniprep protokollen (https://www.biologia.uniba.it/rmc).

Alu

-PCR produkter af BAC blev brugt som prober og blev biotinyleret hjælp nick translation. Dual farve fluorescens

in situ

hybridisering og påvisning af fluorescenssignaler blev udført som tidligere beskrevet [6].

Kvantitativ realtids-PCR

Kvantitativ real time PCR for genkopital måling var baseret på en nyligt beskrevet fremgangsmåde [27]. I den foreliggende undersøgelse, brugte vi forhåndsudformede og validerede SNP-analyser (Applied Biosystems, CA, USA) med AB 7900-systemet (Applied Biosystems). Til validering af 9p13.3 amplikon to gener i amplikon (IL-11RA, AssayID: C__11340987_10 og DCTN3, AssayID: C__25472566_10) og et gen på på 3p24.2 beliggende i en ikke ændret region i prostatakræft (TOP2B, AssayID :. C__8063527_10) blev analyseret

i et første trin, alle SNP assays anvendt i denne undersøgelse blev kørt på en fortyndingsserie af normalt blod DNA for at bestemme PCR effektivitet (E) af hvert primersæt ved formlen E = 10

-1 /s, hvor s betegner den absolutte værdi af hældningen i en afbildning af tærskelcyklus (C

T) mod logaritmen af ​​input beløb. Alle primere blev vist at have en samme effektivitet på ca. E = 2 og i relative effektivitet plots sammenligning af de forskellige primere (log over input beløb

vs.

ΔC

T) den absolutte værdi af hældningen var mindre end 0,1. Relativ genkopital blev derefter beregnet efter equitation: 2

-ΔΔCT (Bruger bulletin # 2, Applied Biosystems). Til kalibrering normalt blod DNA blev tilsat i hver PCR-kørsel. For gener med begge alleler påvises ved assayet C

T værdi blev subtraheret fra 1 baseret på den viste effektiviteten af ​​2. For at bestemme om resultater opnået ved real time PCR analyse af prostatacancer prøverne var signifikant forskellige fra dem, der opnås for prøver fra raske individer, vi bestemt en tolerance interval (TI) for de relative gen kopiantal, ved hjælp af standardafvigelsen (SD) C

T-værdier for mål- og referencepunkter gener i 8 raske individer efter ligningen: TI = 2 ± (SDΔC

T × 2). TI varierede fra 1,62 til 3,17 for

DCTN3

1,77-2,94 for

IL11-RA

.

Resultater

Minimal tilbagevendende regioner af ændringer

på grund af deres yderst ændrede genomer og den store mængde af data genereret ved matrix-analyser, simpel visuel inspektion af ændret loci viste sig ineffektivt at identificere minimale tilbagevendende regioner aberration. For at analysere datasættet, vi kombineret automatisk aberration identifikation med en modificeret frekvens plot procedure. Anvendelse af vægtet frekvens analyse til de autosomer af prostatakræft-cellelinier afslørede flere områder af højt tilbagevendende ændringer. I forhold til vores cCGH analyserer flere små amplifikationer og sletning enheder kun blev opdaget af aCGH, især i pericentromeric regioner og regioner nær telomerer (fig. 1). Størrelsen af ​​de mindste regioner i aberration kunne bestemmes til 110 kb til tab på 19q13.41 i cellelinjer DU145

NIH

, DU145-MN1, PC3 125-1L og CWR22-RV1, og 760 kb for gevinster på 14q32.11-q32.12 i PC3

HOM

, PC3-N og PC3-125-1L. De fleste kromosomafvigelser som påvist af cCGH blev også set i aCGH. Imidlertid blev opdaget flere tab med microarrays og flere store områder af gevinster med metafase teknik. For de almindeligt fundne regioner af afvigelser, blev nogen uoverensstemmelse mellem de to metoder i tildele gevinster eller tab for den enkelte region observeret (tabel 1).

En lille område af gevinst på 9p tæt på Centromer (B, pilespids) og en lille sletning på 14q (D, pilespids) kun opdaget af arrayCGH.

Cytogenetisk forfatning forskellige grene af prostatakræft-cellelinier og forældrenes cellelinie vs. sublinie sammenligning

aCGH resultaterne af forældrenes cellelinjer PC3

HOM

, DU145

HOM

, LNCaP og CWR22 og deres underlinjer er sammenfattet i figur 2. for PC3 og DU145, kunne to forskellige grene sammenlignes (

HOM vs. NIH

). Mest forbløffende, det cytogenetiske forfatning PC3

HOM

afveg markant fra PC3

NIH

. Fra i alt 54 afvigelser i begge cellelinier, kunne kun seks stærke afvigelser findes i fælles: tab ved 1q, 8 p, 10p og 13, og gevinster på 10Q og 17q. Gevinsten af ​​8q11.2-8q24.3 i PC3

HOM

blev også observeret i PC3

NIH

viser en minimal størrelse variation af 100 kb. For DU145

HOM

og DU145

NIH

blev et godt samlet konkordans af den genetiske sammensætning fundet.

Tal over plottet indikerer kromosom tal og lodrette linjer grænserne mellem kromosomer.

Sammenligning cellelinjer PC3

HOM

, DU145

HOM

, LNCaP og CWR22 med deres afledte underlinjer PC3 -N, PC3-125-1L, DU145-N, LNCaP-CN4-2 og CWR22-RV1 henholdsvis en høj kongruens af de cytogenetiske aberrationer mellem de tilsvarende cellelinier blev givet af aCGH. Det er værd at nævne, at ud over mindre ændringer af antallet af ekstra områder med gevinster eller tab af genetisk materiale forskelle mellem forældrenes cellelinjer og underlinjer overvejende vedrørte omfanget af tilsvarende regioner med kopi nummer ændringer, som for eksempel blev observeret for regionerne med gevinster ved 12q og 15q i PC3

HOM vs.

PC3-N og for regionerne med tab ved 2q, 4q, 6Q og 13q21.33 i LNCaP

vs

. LNCaP-CN4-2.

Validering af den forstærkede pericentromeric region 9p13.3 hjælp FISH analyse og kvantitativ real time PCR

En roman 1.7 Mb region med kopi nummer gevinster blev konsekvent anerkendt i cellen linjer CWR22 og CWR22-RV1 og blev kortlagt til den pericentromeric 9p13.3 underbånd. Tilstedeværelsen af ​​denne amplikon i cellelinier CWR22 og CWR22-RV1 blev bekræftet ved metafase FISH under anvendelse af en BAC-klon (RP11-165H19) fra den amplificerede region og en probe specifik for centromeren af ​​kromosom 9 (fig. 3A og B). Optimal signal og mangel på krydshybridisering blev verificeret ved hjælp af normale metafasespredninger (fig. 3C). Denne BAC klon indeholdt to gener,

IL-11RA

DCTN3

, som allerede blev anset for at spille en rolle i væksten af ​​prostatacancer [13].

Identifikation af øget kopier af signaler af BAC-klonen RP11-165H19 kortlagt til 9p13.3 amplikon i cellelinie CWR22 og CWR22-RV1 (A og B). C Optimal signal og manglende krydshybridisering blev verificeret under anvendelse af normale metafasespredninger viser to signaler for hver probe. BAC klon RP11-165H19 signaler er grønne; røde signaler indikerer kromosom 9 centromer (D9Z1).

Baseret på gen-lokalisering og kommenteret genfunktion, vi har valgt disse to kandidatgener for genkopitallet målinger i prostatakræft cellelinjer og 20 primære prostata karcinom prøver under anvendelse kvantitativ real time PCR.

IL-11RA

viste en betydelig stigning i genkopitallet over normal i CWR22 og CWR22-RV1 og i 15 ud af 20 (75%) primær prostatacancer tumorprøver (fig. 4). For

DCTN3

blev der ikke kopiantal gevinst detekteret i nogen cellelinie og i kun 2 ud af de 20 (10%) prostatacancer tumorprøver. Styringen gen

TOP2B dele på 3p24.2 blev bevist uændret i forhold til normalt blod (data ikke vist).

IL-11RA

viste en signifikant stigning i genkopital over det normale i CWR22, CWR22-RV1, DU145

HOM

og DU145-MN1 og i 15 ud af de 20 (75%) prostatakræft prøver. For

DCTN3

, blev der ikke kopiantals gevinst påvises i en cellelinje og i kun to ud af de 20 (10%) prostatakræft prøver. Værdier over afskåret linje tildeles som øget gen kopi antal i forhold til det normale.

Diskussion

Selvom prostatakræft-cellelinier er tidligere analyseret af aCGH udnytte cDNA microarray platforme [12] [13], [15] – [20], viser vi i denne undersøgelse gennemførligheden af ​​en longmer oligonukleotidsæt, oprindeligt designet til udtryk analyse, for en høj opløsning genomisk profilering af ni prostata cancer cellelinjer. De microarray data for denne undersøgelse er blevet forelagt for NCBI GEO med tiltrædelsen GSE7376. Sammenlignet med cCGH, vi har registreret flere sletninger og små områder af gevinster med aCGH, især i pericentromeric og regioner tæt telomerer, hvor cCGH vides ikke at levere pålidelige informationer om DNA-ubalancer. På den anden side, blev store områder i fortjenesten, som afsløret af cCGH omfattende næsten hele armen af ​​kromosomer overset af aCGH. Lignende observationer blev også rapporteret af Saramaki et al. (2006) [13] anvendelse af cDNA-baserede aCGH. Udover normalisering artefakter kunne man argumentere for, at disse forskelle kan resultere fra DNA-amplifikation skridt for aCGH i vores undersøgelse, mens ikke-amplificeret DNA blev brugt til cCGH. Selvom hel-genom forstærkning af phi29 polymerase kan tilføje nogle fordomme og øge baggrundsstøj, er det betragtes den mest fordomsfri tilgang i forhold til PCR-baserede DNA-forstærkning procedurer [28]. Som helst DNA amplifikationstrin synes uundgåeligt i studiet af primær prostatacancer prøver, anvendte vi et amplifikationstrin vores undersøgelse, selvom DNA mængde ikke var en begrænsende faktor, når man arbejder med cellelinier.

Vores aCGH fund er i god overensstemmelse med de data, der er rapporteret i litteraturen for PC3, DU145, LNCaP, og CWR22 [12], [13], [15] – [20]. Men en interessant side aspekt af vores undersøgelse er den observation af en markant cytogenetisk forskel mellem de to PC3 grene, der blev afholdt i to forskellige laboratorier (PC3

HOM vs.

PC3

NIH

). Den formodede genomisk instabilitet af cellelinier kan føre til genetisk afvigelse, hvad der skal overvejes, når man sammenligner resultaterne fra forskellige laboratorier på tilsyneladende de samme cellelinier. Et kvalitetsstyringssystem, der omfatter oplysninger om den genetiske sammensætning af de individuelt anvendte cellelinjer, synes fornuftigt.

Med hensyn til sammenligningen af ​​forældrenes cellelinjer og underlinjer, blev der ikke grove forskelle i cytogenetisk sammensætning findes ved aCGH. Forskelle overvejende vedrørte grænserne for tilsvarende regioner med kopi nummer ændringer. Disse fund er i modsætning til vores tidligere undersøgelser, der påviser cCGH flere ekstra områder af DNA kopital ændringer i underlinjer sammenlignet med de parentale cellelinier [4]. En forklaring kan være tekniske, da de tidligere rapporterede forskelle primært involverede store kromosomområder, der opdages med en lavere følsomhed af aCGH forhold til cCGH, som blev diskuteret ovenfor.

Som en validering af den høje opløsning på aCGH vi analyseres yderligere en lille forstærkning enhed af 1,7 MB i pericentromeric region af kromosom 9 på 9p13.3, som blev fundet i xenograft-afledte cellelinier CWR22 og CWR22-RV1 efter aCGH men ikke efter cCGH. Interessant Saramaki et al. (2006) [13] fandt også denne region ved aCGH skal amplificeres i prostatacancer xenograft LuCaP35. De bekræftede deres resultater ved BAC-FISH og demonstrerede forstærkning og overekspression af ubiquitin-konjugerende enzym gen E2R2 (

UBE2R2

), den dynactin 3-genet (

DCTN3

) og WD gentag domæne 40A gen (

WDR40A

) ved 9p13.3. Ved hjælp af en real time PCR-teknik, vi kvantificeret yderligere kopiantallet af interleukin 11 receptor alpha-gen (

IL-11RA

) og dynactin 3-genet (

DCTN3

) begge afslører den højeste log2 forhold i aCGH inden 9p13.3.

IL-11RA

blev fundet med det højeste antal kopier gevinst i CWR22, CWR22-RV1, DU145

HOM

og DU145MN1 tyder

IL-11RA

som den formodede målgen af ​​denne amplikon. Vi har derfor screenet 20 primær prostatacancer prøver og fandt 75% af tumorerne huser en

IL-11RA

kopital gevinst alene, ingen af ​​

DCTN3

alene, og 10% af begge gener . Mean kopi nummer gevinst for

IL-11RA

var ca. 4 gange. Disse data understrege vores indledende antagelse, at

IL-11RA

repræsenterer forstærkning målet i stedet for

DCTN3

. Denne hypotese er yderligere styrket af immunhistokemiske undersøgelser [29], [30] og kræft profilering database Oncomine ™ (www.oncomine.org), som begge afslører høj overekspression af

IL-11RA

i prostatakræft i forhold til normal prostatavæv.

IL-11RA

koder for en specifik receptor for IL-11 og hører til familien af ​​gp130-afhængig cytokinreceptorer, som omfatter receptorer for IL-6, leukæmi inhibitorisk faktor, ciliær neurotrofisk faktor, oncostatin M, og cardiotrophin [31]. En vigtig signalsystem aktiveres af

IL-11RA

og andre medlemmer af denne receptorfamilie er Janus kinase-signal transducer og aktivator af transkription (Jak-STAT) pathway med STAT3 har en velundersøgt betydning i prostata carcinogenese [ ,,,0],32]. Desuden aktiveres STAT3 menes at spille en nøglerolle i androgen receptor aktivering i fraværet af androgener, en forklaring af hormon refraktær vækst af prostatacancer [33]. Uanset om

IL-11RA

er sygdomsfremkaldende i væksten prostatakræft skal undersøges i yderligere undersøgelser.