PLoS ONE: Udvikling af en meget følsom og specifik metode til påvisning af cirkulerende tumorceller huser somatiske mutationer i ikke-småcellet lungekræft Patients

Abstrakt

Baggrund

Onkogene mutationer er stærke prædiktive biomarkører for molekylært målrettede behandlinger mod kræft. For mutation detection patienter skal underkastes invasive tumor biopsier. Alternativt arkivalier prøver bruges der ikke længere svarer til de faktiske tumor status. Cirkulerende tumorceller (CTC) kunne tjene som en alternativ platform til påvisning somatiske mutationer hos cancerpatienter. Vi søgte at udvikle en følsom og specifik analyse til at påvise mutationer i

EGFR

gen i CTC fra patienter med lungecancer.

Metoder

Vi har udviklet en ny analyse baseret på virkelige -tids polymerasekædereaktion (PCR) og smeltekurveanalyse at detektere aktivering

EGFR

mutationer i blodet cellefraktioner beriget med CTC. Ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) blev valgt som sygdomsmodel med sigende meget lave CTC tæller. Analysen blev prospektivt valideret i prøver fra patienter med

EGFR

-mutant og

EGFR

-Wild typen NSCLC behandles inden for en randomiseret klinisk forsøg. Sekventielle analyser blev udført for at overvåge CTC signaler under behandlingen og korrelere mutation opdagelse i CTC med resultatet behandling.

Resultater

analysens sensitivitet blev optimeret til at muliggøre påvisning af en enkelt

EGFR

-mutant CTC /ml perifert blod. CTC blev påvist i forbehandling blodprøver fra alle 8

EGFR

-mutant lungekræftpatienter undersøgt. Tab af

EGFR

-mutant CTC signaler korreleret med behandlingsrespons, og dens gentagelse forud tilbagefald.

Konklusioner

På trods af lav overflod af CTC i NSCLC onkogene mutationer kan reproducerbart detekteres ved at anvende en neutral CTC berigelse strategi og meget følsomme PCR og smeltekurveanalyse. Denne strategi kan gøre det muligt ikke-invasive, specifikke biomarkør diagnostik og monitorering i patienter, der gennemgår målrettede behandlinger mod kræft

Henvisning:. Breitenbuecher F, Hoffarth S, Worm K, Cortes-Incio D, Gauler TC, Köhler J, et al . (2014) Udvikling af en meget følsom og specifik metode til påvisning af cirkulerende tumorceller huser somatiske mutationer i ikke-småcellet kræftpatienter. PLoS ONE 9 (1): e85350. doi: 10,1371 /journal.pone.0085350

Redaktør: Javier S. Castresana, Navarra Universitet, Spanien

Modtaget: Oktober 1, 2013; Accepteret: December 4, 2013; Udgivet: 21 Jan 2014

Copyright: © 2014 Breitenbuecher et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af en Oncology center of Excellence giver fra den tyske Cancer Aid (Deutsche Krebshilfe, www.krebshilfe.de) til den vesttyske Cancer center, murene forskningsmidler fra det medicinske fakultet ved universitetet Duisburg-Essen (IFORES til MS ), og en institutionel forskningsbevilling fra Boehringer Ingelheim (www.boehringer-ingelheim.com) til FB og M.S.). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har læst tidsskriftets politik og har følgende konflikter. FB: Institutionel forskningsmidler (Boehringer Ingelheim). TG: Travel support, honorarer og konsulenthonorarer (Boehringer Ingelheim, Pfizer, Roche, Lilly). JK: Honorarer, rejser support (Boehringer Ingelheim, Amgen, Roche). SK: Rådgivning gebyrer, honorarer, rejser support (Merck-Serono, Amgen, Roche). MS: Institutionel forskning finansiering, rådgivning gebyrer (Boehringer Ingelheim). Alle resterende forfattere har erklæret nogen interessekonflikter. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Aktivering

EGFR

mutationer definerer en gruppe af genetisk afhængige pulmonale adenocarcinomer , som er stærkt følsomt overfor EGFR tyrosinkinaseinhibitorer (EGFR-TKI). Terapeutiske beslutninger i patienter med metastatisk NSCLC er styret af den

EGFR

mutation status, som bestemmes i tumorbiopsier [1]. Erhvervelse af disse biopsier kan være farligt for patienten. Desuden kan en enkelt tumor biopsi ikke fuldt ud afspejler status for en metastatisk cancer. Ikke-invasive metoder til gentagne bestemmelse af prognostiske og prædiktive genetiske biomarkører kan lette personlig cancerterapi. Salg

Cirkulerende tumorceller (CTC) er blevet beskrevet i adskillige cancer enheder. Optælling af CTC er blevet korreleret med kliniske resultater og behandlingsrespons [2] – [6]. Disse undersøgelser har anvendt immuncytokemisk detektion af proteinmarkører, for det meste forsømme genomiske biomarkører såsom

EGFR

mutation status. I modsætning til leukæmier, hvor maligne celler er rigeligt til stede i perifert blod, CTC er sjældne hos patienter med solide tumorer og en stor variation af CTC tællinger er blevet observeret [3], [5], [7] – [9]. CTC påvisning baseret på epitel markører, såsom EpCAM eller cytokeratiner (CK) kan overse tumorceller undergår epitel-mesenkymale overgang (EMT) [10].

Her beskriver vi en hidtil ukendt yderst følsom og specifik strategi til påvisning CTC skjult somatiske mutationer i NSCLC patienter. Som en proof-of-concept-model har vi brugt i-frame sletninger i

EGFR

exon 19 (DelEx19), der omfatter ca. 48% af alle

EGFR

mutationer [11]. Vi var i stand til at opdage

EGFR

DelEx19-muteret CTC før behandling til alle patienter med

EGFR

mutationsstatus kendt fra tumorbiopsier der blev vurderet. Desuden clearance af mutation-positive CTC korreleret med behandlingsrespons og sygdomsbekæmpelse.

Materialer og metoder

Genomisk DNA forberedelse

Genomisk DNA blev isoleret fra PBMNC og cellelinjer hjælp den NucleoSpin® Blood Kit (Macherey-Nagel, Duren, Tyskland). Hvis det er nødvendigt, genomisk DNA blev amplificeret under anvendelse af Repli-g Midi Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland). Genomisk DNA fra cellelinier eller plasmid-DNA (pcDNA3.1V5 /HisTOPO, Clontech, Mountain View, USA), der koder for et menneske

EGFR

Exon 19-cDNA-sekvens huser en 15 bp deletion (delE746-A750) blev seriefortyndet. Cellelinjer A431 (

EGFR

vildtype, wt) og NCI-HCC-827 (

EGFR

delE746-A750) blev opnået fra DSMZ (Braunschweig, Tyskland) og

EGFR

mutation status blev bekræftet ved Sanger sekventering.

PCR-amplifikation og

EGFR

DelEx19 mutation afsløring

EGFR

DelEx19 mutationer blev påvist ved at smelte kurve analyse på en LightCycler 480 (Roche, Mannheim, Tyskland). Optimal mutationsdetektion følsomhed blev opnået ved en kombination af specielt designet hybridiseringsprober ufuldkomment binding til EGFR Exon 19 sekvenser indeholdende en deletion i aminosyreposition 746 eller 747, låst-nukleinsyrer (LNA) undertrykke forstærkning af wildtypic

EGFR

sekvenser og forebyggelse hybridisering af prober til wildtypic

EGFR Salg Exon 19 sekvenser og endelig anvender asymmetriske PCR-betingelser fortrinsvis amplificerer DNA-strengen hybridiseringsprober binder til. Alle parametre blev empirisk optimeret for at opnå optimal assay følsomhed. Hver reaktion (20 pi) indeholdt 50 ng genomisk DNA, 2 pmol fremad og 2 pmol revers primer (Eurofins MWG, Ebersberg, Tyskland; Ex19S: 5′-GTCTTCCTTCTCTCTCTGTCATAGGG-3 ‘, Ex19R: 5′-GGGCCTGAGGTTCAGAGC-3′), 2 pi LightCyclerFastStart DNA Master HybProbe (Roche, Mannheim, Tyskland), 3 pmol hybridiseringsprobe 1 ( “anker”: 5′- LC640-ATTTTAACTTTCTCACCTTCTGGGATCCAG-PH) og 3 pmol hybridiseringsprobe 2 ( “sensor”: 5′- TAATTCCTTGATAGCGACGGG-FL) (TIBMolbiol, Berlin, Tyskland). Alle PCR-reaktioner blev udført med og uden tilsætning af 6 pmol låst-nukleinsyre (LNA: 5’-TAATTCCTTGATAG-NH2; TIBMolbiol, Berlin, Tyskland).

Immunomagnetisk berigelse af cirkulerende tumorceller fra perifert blod

Perifert blod (20 ml) blev opsamlet i natriumcitrat rør (Sarstedt, Nümbrecht, Tyskland). PBMNC blev isoleret ved densitetsgradientcentrifugering. Medianen berigelse af WBC ved densitetsgradientcentrifugering var ca. tredoblet. EpCAM-positive celler og CD45-negative celler blev beriget i to parallelle reaktioner ved anvendelse af anti-EpCAM (CD326) og anti-CD45 mikroperler (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Tyskland). Genomisk DNA blev isoleret fra de resulterende fire prøve fraktioner (CD45

+, CD45

-, CD326

+ og CD326

-) og udsat for real time-PCR og smeltekurveanalyse

.

Mutation detektion ved sekvensanalyse

i sekvensanalyse, genomisk DNA fra udvalgte prøver blev amplificeret ved hele genomet amplifikation (WGA) under anvendelse af Repli-g Midi Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. Alle sekvens læser blev genereret af en kommerciel sekventering tjeneste (LGC Genomics, Berlin, Tyskland) på et Roche 454 GS FLX + Titanium (Roche, Branford, USA) og analyseres ved hjælp af CLC genomforskning arbejdsbord (CLCbio, Århus, Danmark). Læser blev importeret til CLC genomics arbejdsbord (ved hjælp af * .fna og * .qual data), trimmes og kortlagt til en reference, herunder

EGFR

exon 19 sekvens samt 50 bp up- og downstream intronsekvenser. Medianen dækning for exon 19 sekvenser var 7316 læser (interval 3,717-17,368).

Patientprøver /Etik erklæring

Perifere blodprøver blev opnået fra patienter med

EGFR

mutant og

EGFR

vægt NSCLC efter skriftlig informeret samtykke. Undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité i det medicinske fakultet ved universitetet Duisburg-Essen (AZ. 10-4359).

Statistik

sonderende statistiske analyser blev udført ved hjælp af GraphPad Prism 4 (GraphPad Software, La Jolla, USA) og IBM SPSS Statistics-version 19 (IBM, Armonk, USA).

Resultater

Følsomhed og specificitet af mutation afsløring

for at bestemme tærsklen for

EGFR

DelEx19 mutation afsløring ved at smelte kurve analyse, vi oprindeligt studerede serielle fortyndinger af genomisk DNA fra

EGFR

wt A431 celler og NIC-HCC-827 celler, der huser en

EGFR

DelEx19 mutation (figur 1a). Ved optimering af PCR-parametre og inddragelse af vægt

EGFR

-specifik LNA følsomheden af ​​detektion blev forbedret til 0,1%

EGFR

DelEx19-mutant sekvenser (figur 1b). I yderligere serielle fortyndinger af plasmid-DNA (pcDNA3.1.EGFRdelE746-A750) tærsklen mutationen afsløring var så lav som 0,01% (data ikke vist).

A)

EGFR

DelEx19 mutation afsløring i seriefortyndet DNA (50 ng /reaktion) fra A431-celler (

EGFR

-Wild typen kontrol) og NCI-HCC-827 celler (

EGFR

DelEx19 mutant kontrol 1). Smeltende toppe indikerer

EGFR

-Wild-DNA (højre) og

EGFR

DelEx19 (til venstre) klart kan udskilles. Real-time PCR reaktioner blev udført uden tilsætning af låste nukleinsyrer (LNA) og i serielle DNA fortyndinger af op til 01:16. Vand (H

2O, nederste linje) og og 50 ng af ufortyndet genomisk DNA

EGFR

-Wild type (A431) og

EGFR

-mutant celler (NCI-HCC-827) blev inkluderet som kontroller (repræsentative eksempler på identiske reaktioner). B) Reaktioner blev udført som i (A), men med tilsætning af LNA (6 pmol). Bemærk undertrykkelse af

EGFR

-Wild typen signal, som tillod diskrimination af

EGFR

DelEx19 mutation signal op til en fortynding på 1:1,024 ( 0,1%). C, D) Normale perifere blodprøver blev tilsat definerede numre (0, 1, 10, 100 celler /ml) af

EGFR

DelEx19 mutant NCI-HCC-827 celler. Efter genomisk immunomagnetisk berigelse DNA blev ekstraheret og underkastet realtids-PCR og smeltekurveanalyse herunder kontrol som i (B). Repræsentative resultater af genomisk DNA isoleret fra leukocyt-udtømte cellefraktioner (CD45

-, C) eller CD326-beriget cellefraktioner (CD326

+, D) er vist. I begge celle fraktioner

EGFR

DelEx19 mutation signaler kan være klart adskilt fra den

EGFR

-Wild typen baggrund op til en følsomhed tærskelværdi på 1 celle /ml. Ingen mutation signaler blev påvist i CD45

+ eller CD326

– celle fraktioner (data ikke vist)

Næste, vi spiked blodprøver fra raske frivillige med definerede celle antal NCI. HCC-827 celler. Prøver blev behandlet som beskrevet til at berige spidse tumorceller og alle deraf cellefraktioner blev underkastet genomisk DNA-isolering, real time PCR og smeltekurveanalyse. I disse forsøg var den reproducerbar nedre detektionsgrænse 1

EGFR

-mutant celle pr 1 ml perifert blod (figur 1 c, d). Denne protokol blev derefter sat på blodprøver fra tre NSCLC patienter med

EGFR

wildtypic tumorer og to raske frivillige. DNA isoleret fra alle celle fraktioner testet negativ for

EGFR

DelEx19 mutationer (Suppl. Figur S1 a-e).

Validering i kliniske prøver

For at validere vores strategi for CTC-berigelse og mutation afsløring vi fremadrettet opnåede perifere blodprøver fra 8 patienter med metastatisk NSCLC huser

EGFR

DelEx19 mutationer, behandlet på vores center i LUX-Lung 3 studie (EudraCT-nr. 2008-005615-18 [12]). Per inklusionskriterier undersøgelse alle patienter havde histologisk bekræftet, medicinsk ubehandlet stadie IIIB /IV pulmonal adenocarcinom (tabel 1). Alle

EGFR

mutationer blev bekræftet ved central analyse.

En blodprøve blev betegnet “negativ” for

EGFR

-mutant CTC hvis ingen mutation signal blev opnået ved real time PCR-analyse af genomisk DNA isoleret fra alle celle fraktioner (CD45

+, CD45

-, CD326

+ og CD326

-) opnået på det respektive tidspunkt. Baseret på vores titreringsforsøg dette indikerede, at

EGFR

-mutant CTC faldt til under en celle /ml blod. Hvis en

EGFR

DelEx19 mutation blev påvist i genomisk DNA fra mindst én celle fraktion prøven blev erklæret “positive” for

EGFR

-mutant CTC.

Base line prøver blev opnået inden for 7 dage før at studere terapi, blev sekventielle blodprøver taget med regelmæssige intervaller under behandling og opfølgning. Ved klinisk progression og /eller slutningen af ​​terapien blev opnået en ekstra blodprøve. I alt 148 blodprøver blev indsamlet over en periode på 36 måneder og analyseret for tilstedeværelsen af ​​

EGFR

-mutant CTC (median: 12 prøver /patient, interval 7-56). Base line blodprøver fra 8 af 8 patienter (100%) var “positive” for

EGFR

-mutant CTC. Interessant, sekventielle prøver fra 4 af 8 patienter vendte “negativ” for

EGFR

-mutant CTC inden en median på 34 dage (interval: 20-84 dage) studier behandling (figur 2 a-j). “CTC negativitet” (dvs. mindre end en

EGFR

DelEx19-muteret celle per milliliter blod) varet ved i en median på 109 dage (interval: 35-199 dage). Genomisk DNA fra prøver udviser en stærk

EGFR

DelEx19 mutation signal i vores nyudviklede assay (vist i figur 2A-2C og 2F), blev analyseret på en Roche 454 GS FLX + Titanium sequencer. Til vores overraskelse, i ingen af ​​disse prøver en sletning i

EGFR

kunne detekteres Exon 19 (data ikke vist).

Repræsentative eksempler på

EGFR

-mutant CTC analyser og kliniske forløb hos patienter i den prospektive validering kohorte. Alle patienter blev behandlet i LUX-Lung 3 studie for trin IV

EGFR

-mutant NSCLC. Behandling naturligvis imaging tidspunkter (CT) og tidspunkter af CTC analyser er illustreret i E og J. Solid pile angiver “CTC positivitet”, stiplede pile “CTC negativitet”. Stjerner angiver tidspunkterne for CTC analyser /CT-scanninger er vist i A-D og F-I. (A) Base line analyse af patient 018 viste en stærk

EGFR

DelEx19 signaler i to celle fraktioner (CD326

+ og CD45

-). (B, C) Sekventiel analyser i patient 018 afslører stærk

EGFR

DelEx19 signaler i mindst én relevant celle fraktion. (D) Repræsentant CT-billeder fra patient 018 på basislinien, og på dag 84 i forsøgsbehandlingen bekræfter progressiv sygdom. (F) Base line analyse af patient 017 viser stærk

EGFR

DelEx19 signaler i to celle fraktioner (CD326

+ og CD45

-). (G, H) Sekventiel analyse i patient 017 viser faldt (G) og negative (H)

EGFR

DelEx19 signaler i både relevante celle fraktioner. (I) Repræsentant CT-billeder fra patient 017 på basislinien, og på dag 84 i forsøgsbehandlingen bekræfter en partielt respons.

Foreningen af ​​EGFR mutant CTC med kliniske resultater

Baseret på denne observation vi forespørges sammenslutningen af ​​

EGFR

-mutant CTC med behandlingsrespons og varighed i vores validering kohorte. Vi definerede en patient som “

EGFR

-mutant CTC ryddet”, hvis to på hinanden følgende blodprøver blev testet “negative”, dvs.

EGFR

-mutant CTC tæller faldt til under en celle /ml. “CTC gentagelse” blev erklæret når to på hinanden følgende blodprøver testes “positive” for

EGFR

-mutant CTC. Resultater fra CTC mutation analyse blev korreleret med radiologisk respons vurderes inden for LUX-Lung 3 studie. Alle 4 patienter, der “ryddet”

EGFR

-mutant CTC opnåede sygdomskontrol, med 3 partielle responser (PR) og en stabil sygdom (SD) pr RECIST. I 4 patienter med vedvarende CTC i deres perifere blod og som dermed ikke “klar”

EGFR

-mutant CTC kun en objektiv respons (PR) blev observeret, mens 2 patienter opnåede SD og en patient progressiv sygdom (PD ). Ved opfølgende alle 4 patienter med “clearance” af

EGFR

-mutant CTC udviklede PD.

EGFR

-mutant CTC tilbage til “positive” ved en median på 140 dage (spændvidde 0-960 dage) forud for radiologisk dokumenteret PD. Derfor er en stigning i

EGFR

-mutant CTC tæller over tærsklen på 1 celle /ml kunne være en tidlig indikator for sygdom tilbagefald og resistens hos patienter, der har “ryddet” CTC. Ved sonderende statistiske analyser observerede vi en signifikant sammenhæng (Spearman-Rho korrelationskoefficient 0,868, p 0,01) mellem varigheden af ​​”CTC negativitet”, og den tid til behandlingssvigt. Patienter, der havde “ryddet”

EGFR

-mutant CTC under niveauet for påvisning viste en signifikant længere tid til behandlingssvigt (median: 355 dage rækkevidde: 189-1,086 dage; p = 0,006, Log-rank test ) sammenlignet med patienter, som forblev “positive” for

EGFR

-mutant CTC (median: 116 dage, interval:.. 84-173 dage, fig 3)

Kaplan-Meier analyse sammenligner TTF af patientgrupper med og uden clearance af CTC under behandlingen. Patienterne blev grupperet efter “clearance” (median TTF 355 dage) eller “ikke-clearance” (median TTF 116 dage) af

EGFR

-mutant CTC under behandling med afatinib eller pemetrexed /cisplatin. Grupper blev sammenlignet ved eksplorativ Kaplan-Meier analyse (p = 0,006, log-rank test).

Diskussion

I øjeblikket påvisning af genetiske afvigelser i tumorvæv er den klinisk mest kraftfuld biomarkør for lagdeling af “målrettede” farmakologiske metastatisk lungekræft [13], [14]. Behandling med gefitinib og crizotinib, samt første linje erlotinib, er betinget af, at demonstration af

EGFR

mutationer og

ALK

omlejringer. Mutation detektion ofte udføres i små og /eller arkivering tumor prøver, som måske ikke afspejler den aktuelle genomiske profil på behandlingsstart [15]. Desuden mutations spektrum af en cancer ændrer under det selektive tryk af en given terapi, som kun kan afsløres ved sekventielle biopsier. På denne baggrund har påvisning af kræft-specifikke mutationer i andre formater end tumorbiopsier vundet interesse. I NSCLC, blev vellykket påvisning af muterede DNA-sekvenser rapporteret i serum, plasma eller bronchioalveolar udskylningsvæske [16] – [19]. Ikke desto mindre er de fleste af disse rapporter viste et niveau af følsomhed under kliniske krav.

Den tidlige systemiske udbredelse af kræftceller betragtes af biologisk relevans. Med primære antistoffer mod epitelceller markører, dissemineret tumorceller og CTC er blevet påvist i knoglemarv og blod fra patienter med forskellige maligniteter. Blandt en lang række alternative strategier ansøgt om CTC-berigelse og analyse, har et automatiseret system til immunocytometric detektion og kvantificering af CTC blevet udviklet, som blev valideret i bryst-, prostata-, tyktarms- og lungekræft patienter [2], [5], [8], [20] – [23]. Interessant, den absolutte mængde af CTC påvist i avancerede stadie kræftpatienter varierede betydeligt, afhængigt af CTC-isolation teknikker. Selv om der blev påvist høje antal af CTC hos patienter med småcellet lungecancer, absolutte CTC tal og dynamikområde i NSCLC syntes for lavt til bred klinisk anvendelighed. Ikke desto mindre er det blevet mere og mere klart, at CTC populationer er fænotypisk heterogene og epitelial-markør uafhængig berigelse tilgange berettiget til at vise det fulde billede af CTC i en kræftpatient på et givet tidspunkt. Flere nylige rapporter støttede dette begreb ved konsekvent at vise højere CTC-numre, når man sammenligner epitel-markør-uafhængige CTC berigelse teknikker (f.eks berigelse af cellestørrelse) med den almindeligt anvendte CTC isolation ved valg af EpCAM og CK-positive celler ved hjælp af CellSearch systemet [5 ], [8], [24], [25].

på denne baggrund vi begrundet, om sondering for kræft-specifikke somatiske mutationer i stedet for mikroskopi-baserede parametre øger følsomheden af ​​CTC opdagelse i NSCLC. Vi har valgt

EGFR

DelEx19 mutationer som model til at udvikle en yderst følsom, specifik og robust metode til påvisning mutation i blandinger af genomisk DNA, der var ekstraheret fra CTC-berigede perifere blod cellepopulationer. Den nye metode, der anvendes i denne undersøgelse er designet til at detektere det store flertal af

EGFR

DelEx19 mutationer, især alle mulige mutant varianter forstyrre codon 746 og 747 i den

EGFR

gen. I modsætning til en tidligere undersøgelse analyserer kun EpCAM-positive blodlegemer [26] har vi valgt en fordomsfri, epitelial markør-uafhængig CTC berigelse strategi, hvor prøver blev delt og CTC berigelse blev opnået ved en dobbelt tilgang, nedbrydende leukocytter i den ene halvdel af en prøve og udvælgelse af EpCAM-positive celler i den anden halvdel. Dette tager højde for den fænotypiske variation af CTC, som kan miste en eller flere epitel markører samtidig være udgydt fra en primær tumor eller metastaser [27] – [29]. I pilotforsøg, Immunofluorescens farvning af udvalgte CTC prøver fra NSCLC patienter faktisk viste heterogene populationer af CTCs viser epitel, mesenkymale og blandede fænotyper (data ikke vist). Anvendelsen af ​​denne fordomsfri CTC-berigelse tilgang, vi opnået en opdagelse sats 100% i en pilot kohorte af 8 patienter med

EGFR

-mutant NSCLC. Mest interessant, observerede vi en sammenslutning af

EGFR

-mutant CTC med behandlingsrespons og resultat. Disse fund er størst sandsynlighed tilskrives den hidtil ukendte og meget følsomme mutation påvisningsmetode anvendt i denne undersøgelse. Det er blevet anerkendt for nogen tid, at påvisning af mutationer ved niveauer under 1% ikke er pålideligt muligt ved næste generation sekventering applikationer på grund af iboende fejlprocenter ved denne teknologi [30]. Først for ganske nylig blev rapporteret forbedrede teknologier, hvilket gør påvisning af mutationer i niveauer på 0,1% og under mulig [31], [32]. I overensstemmelse med disse resultater, vi ikke var i stand til at opdage

EGFR

Del19 mutationer ved næste generation sekventering i genomisk DNA af prøver viser entydige mutation signaler i vores nyudviklede mutation afsløring assay. Disse resultater viser, at vores nyudviklede mutation afsløring assay viser tilsyneladende højere følsomhed end standard næste generation sequencing teknikker. Et andet bemærkelsesværdigt aspekt af vores mutationsdetektion assay var den observation, at forskellige

EGFR

DelEx19 mutationer gav anledning til forskellige smeltekurver (se figur 2 og suppl. Figur S1). Dette er mest sandsynligt på grund af de særlige kendetegn ved en af ​​hybridiseringsprober, som er designet til at binde til

EGFR Salg Exon 19 wildtypic sekvenser i regionen af ​​potentielle deletioner fører til dissociation af sonden under smeltekurveanalyse på forskellige temperaturer afhængigt af sekvensen for den respektive deletion.

Mens disse resultater er lovende, er vi klar over, at patientpopulationen analyseret her er meget lille og validering i større patientpopulationer herunder yderligere mutationer er påkrævet. I øjeblikket er lige så følsomme mutation detektionsassays dækker flere terapi-relevant regioner i

EGFR

gen (f.eks codon L858 og T790) og andre onkogener udvikles.

Sammenfattende har vi beskrevet en roman strategi baseret på CTC berigelse og meget følsomme påvisning af somatiske mutationer, som kan anvendes til mutations profilering og overvågning af behandlingen effekt hos patienter med

EGFR

-mutant NSCLC. Ved analysen optimering har vi vist, at problemet med notorisk lav CTC tæller i stadie IV NSCLC kan overvindes. Dette kan være endnu et skridt i retning af visionen om en “flydende biopsi” for fare-fri molekylær diagnostik og monitorering hos patienter med metastatisk lungekræft.

Støtte oplysninger

figur S1.

EGFR

DelEx19 mutation analyse i blodprøver fra NSCLC patienter med

EGFR

-Wild typen tumorer og raske kontrolpersoner. Perifere blodprøver fra tre patienter med

EGFR

-Wild typen NSCLC (A, B, C) blev og to raske frivillige (D, E) beriget, adskilt i cellulære fraktioner og udsat for DNA-isolering som beskrevet. Mutation detekteret blev udført ved realtids-PCR og smeltekurveanalyse i nærvær af LNA. Nej

EGFR

DelEx19 signal blev opdaget. H

2O (nederste linje) og 50 ng af ufortyndet genomisk DNA af NCI-HCC-827 celler ( “

kontrol 1

“), plasmid-DNA, der indeholder en

EGFR

DelEx19 sekvens ( “kontrol 2”) og A431-celler ( “

EGFR wildtypic kontrol

“) blev inkluderet som negative og positive kontroller. For klarhedens skyld vises kun enkelte værdier af dubletter

doi:. 10,1371 /journal.pone.0085350.s001

(TIF)

Tak

Vi takker alle patienter til deltagelse i denne undersøgelse. Alle bidrager ansatte i departementerne Medicinsk Onkologi, Patologi og Neuropatologi, vesttyske Cancer Center, University Hospital Essen, og hovedgrupper i Thoracic Oncology og interventionel Pneumology, Ruhrlandklinik, takkes. Sabrina Schilling og Sarah-Luise Stergar er anerkendt for fremragende teknisk bistand og Sabine Kasimir-Bauer til nyttige diskussioner og rådgivning. Vi er taknemmelige for Ivonne Nel og Andreas-Claudius Hoffmann for rådgivning og fremragende teknisk bistand med immunofluorescens farvninger. Den tyske Research Foundation (DFG) bevilget støtte for frikøbte.

Be the first to comment

Leave a Reply