PLoS ONE: Den Aktivering af ERK1 /2 og JNK MAPK signalering ved Insulin /IGF-1 er Ansvarlig for udvikling af tyktarmskræft med type 2 diabetes mellitus

Abstrakt

Tidligere undersøgelser viste, at type 2-diabetes mellitus (T2DM) er knyttet til øget risiko for at udvikle tyktarmskræft. Insulin og insulin-lignende vækstfaktor 1 (IGF-1) er øget hos patienter med T2DM. Den øgede insulin og IGF-1 kan være ansvarlig for udviklingslandene for tyktarmskræft. I denne undersøgelse undersøgte vi effekten og mekanismer af insulin og IGF-1 i udvikling tyktarmskræft

in vitro

in vivo

. Insulin og IGF-1 alene eller sammen forhøjet proliferation og reduceret apoptose i tyktarmskræft MC38 celler. I mellemtiden, insulin og IGF-1 fremmet phosphorylering af ekstracellulær-signal reguleret kinase 1/2 (ERK1 /2) og c-Jun N-terminal kinase (JNK). Behandling med ERK1 /2 eller JNK-inhibitor i nærvær af insulin og IGF-1 signifikant reduceret B-cellelymfom 2 (Bcl-2) og øget Bcl-2-associeret X protein (Bax) ekspression og endelig øget apoptose og hæmmede proliferationen . Accelererende colon tumorvækst blev fundet i en musemodel for T2DM med

db /db

mus, der fik høje endogen insulin og IGF-1. Endvidere inhibering af ERK1 /2 eller JNK undertrykt udvikling af colon tumor

in vivo

. Disse resultater antyder, at aktiveringen af ​​ERK1 /2 og JNK signalering af insulin og IGF-1, i det mindste delvis, er ansvarlig for udviklingen af ​​tyktarmskræft med T2DM

Henvisning:. Teng JA, Wu SG, Chen JX, Li Q, Peng F, Zhu Z, et al. (2016) Den Aktivering af ERK1 /2 og JNK MAPK signalering ved Insulin /IGF-1 er Ansvarlig for udvikling af tyktarmskræft med type 2 diabetes mellitus. PLoS ONE 11 (2): e0149822. doi: 10,1371 /journal.pone.0149822

Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: April 27, 2015; Accepteret: 4 februar 2016; Publiceret: 22 feb 2016

Copyright: © 2016 Teng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse er støttet af National Natural Science Foundation of China (nr 81.160.107, JAT), Guangxi Science Forskning og Teknik udviklingsplan Foundation (No. 1104003B-69, JQ), og Guangxi Natural Science Foundation (nr 2010GXNSFB013083, JAT). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i de seneste årtier på grund af den hurtige økonomiske vækst og ændringer i livsstil i Kina, forekomsten og tilfælde af diabetes er hastigt stigende. I Kina, forekomsten af ​​diabetes var 9,7%, svarende til 92,4 millioner mennesker lever med diabetes, primært type 2 diabetes mellitus (T2DM) [1]. T2DM er forbundet med en øget forekomst af kræft dødelighed [2, 3]. Især risikoen for brystkræft [4], pancreas [5], lever [6] og colon [7, 8] kræft er øget hos patienter med T2DM. T2DM øger levetiden risikoen for tyktarmskræft med op til tre gange end den generelle befolkning, hvilket gør tyktarmskræft en af ​​de mest almindelige kræftformer hos patienter med T2DM [9].

De mekanismer der ligger til grund for tilslutning af T2DM med tyktarmskræft er komplicerede og endnu ikke fuldt belyst. T2DM er forbundet med hyperinsulinæmi og forhøjet insulin-lignende vækstfaktor 1 (IGF-1). Insulin, en vigtig vækstfaktor fungerer som en celle mitogen, når ved høje koncentrationer øger risikoen for tyktarmskræft ved at fremme væksten af ​​tumorer [10]. Og insulin-behandling kan yderligere løfte risiko for coloncancer hos patienter med T2DM [11]. Insulin stimulerer celleproliferation gennem direkte binding til insulinreceptorer eller IGF-1-receptorer, eller ved inhibering af IGF-bindende proteiner, som forøger IGF-1 tilgængelighed til IGF-receptoren [12]. Insulinet eller IGF-1-signalering er bevist som en potent vækstregulator forbundet med carcinogenese i forskellige cellelinier [13]. Tidligere undersøgelser viste en sammenhæng mellem forhøjet IGF-1 og risikoen for tyktarmskræft [14, 15]. Sammenhængen mellem insulin eller IGF-1 og risikoen for tyktarmskræft hos patienter med T2DM accepteres bredt [16, 17]. Mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) signal indeholder 3 store veje: ekstracellulære regulerede proteinkinaser 1/2 (ERK1 /2), c-Jun N-terminal kinase (JNK) og P38 signaler. Tidligere undersøgelser har vist, at MAPK signal, der fungerer som nedstrøms for insulin og IGF-1 proliferativ signalering, spiller en rolle i proliferationen af ​​forskellige kræftformer, herunder bryst-, tyktarms- og prostatakræft [18-20]. Men på grund af manglen på ideelle tyktarmskræft model med T2DM, er det stadig ikke klart, hvordan dette signal regulere proliferationen af ​​coloncancer i et T2DM miljø.

Denne undersøgelse havde til formål at bestemme mekanismen af ​​insulin /IGF-1 i vækst coloncancer i et T2DM miljø. Til dette formål blev en mus afledt coloncancercellelinie-MC38 celler med insulin /IGF-1 behandling og en mus spontan T2DM model med tumor allotransplantater bruges til at efterligne T2DM miljø

in vitro

i vivo

. Insulin /IGF-1 forhøjet proliferation og reduceret apoptose i MC38-celler. I mellemtiden virkningerne af insulin /IGF-1 i MC38-celler blev ERK1 /2 og JNK afhængig. Accelererende colon tumorvækst blev fundet i en musemodel for T2DM som fik høje insulin og IGF-1. Foreslår således vi, at aktiveringen af ​​ERK1 /2 og JNK signalering ved insulin og IGF-1, i det mindste delvis, er ansvarlig for at regulere udviklingen og dannelsen af ​​tyktarmskræft med T2DM.

Materialer og metoder

Cellekultur

Tyktarmskræft MC38 cellelinje blev oprindeligt afledt af C57BL /6 mus behandlet med kræftfremkaldende 1,2-dimethylhydrazin [21], blev det købt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) og dyrket i DMEM medium suppleret med 10% føtalt bovint serum, 1% glutamin og 1% penicillin /streptomycin. Cellerne blev holdt ved 37 ° C og 5% CO

2 i et fugtigt miljø. Medium blev udskiftet hver 48 timer, og celler blev trypsinbehandlet når nåede 80% konfluens. Cellerne blev serumudsultet natten over og derefter behandlet med 5 ng /ml eller 50 ng /ml koncentrationer af insulin (Sigma, St. Louis, MO) og IGF-1 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) opløst i phosphatbufret saltvand (PBS). I ERK1 /2-eller JNK-inhiberende assays blev 40 uM ERK1 /2-inhibitor PD98059 (Sigma, St. Louis, MO) eller 20 uM JNK inhibitor SP600125 (Sigma, St. Louis, MO) opløst i dimethylsulfoxid (DMSO) tilsat til dyrkede celler.

Celleproliferationsassay

Celleproliferation blev bestemt ved anvendelse af en celletælling kit-8 (CCK-8) (Dojindo, Kumamoto, Japan) ifølge fabrikantens protokol. Kort fortalt blev MC38-celler podet på plader med 96 brønde med 8000 celler pr. Efter inkubation natten over blev cellerne behandlet med 50 ng /ml insulin og 50 ng /ml IGF-1 med eller uden 40 pM ERK1 /2-inhibitor PD98059 eller 20 uM JNK inhibitor SP600125 i 24, 48 eller 72 timer. Derefter 10 pi 2- (2-methoxy-4-nitrophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium-mononatriumsalt (WST-8) blev tilsat til hver brønd og inkuberet ved 37 ° C i yderligere 2 timer. Så den optiske absorbans ved bølgelængde 450 nm blev målt under anvendelse af en mikropladelæser (Thermo Scientific, Waltham, MA).

Cellecyklusanalyse

I

in vitro

cellecyklus analyse, MC38-celler med forskellige behandlinger for 72 timer høstedes og fikseret med 70% iskold ethanol i 4 timer. Så de fikserede celler blev inkuberet med 400 pi 0,5 mg /ml propidiumiodid (PI) i 30 minutter ved 4 ° C. De farvede celler blev analyseret med et FACS Calibur (BD, Franklin Lakes, NJ). Kvantificering af fluorescens blev udført ved flowcytometri til bestemmelse af cellecykluskinetikken af ​​MC38-celler i G0 /G1-fasen, S-fase og G2 /M-fase.

Cell apoptose analyse

Apoptose sats blev vurderet på 7

th dag i kultur ved Annexin V-FITC Apoptose Detektion Kit i (BD, San Diego, CA) ifølge fabrikantens protokol. Kort fortalt, 1 x 10

6 trypsinerede celler blev vasket af PBS og resuspenderet i Annexin V-bindingsbuffer. Cellerne blev farvet med 5 pi FITC Annexin V og 5 pi PI i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke. De farvede celler blev analyseret ved FACS Calibur (BD, Franklin Lakes, NJ) inden for 1 time.

Western Blot-analyse

MC38-celler eller tumorvæv lysater blev fremstillet ved anvendelse vestlige lysepuffer indeholdende protease og phosphataseinhibitorer på is. Celleekstrakter blev centrifugeret ved 12.000 rpm i 15 minutter ved 4 ° C og supernatanten blev anvendt til Western blotting. Proteinkoncentration blev målt ved Bio-Rad-assay under anvendelse af fabrikantens protokol (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Tyve ug supernatantproteiner blev separeret i 10% SDS-PAGE og overført til polyvinyliden fluorid membraner (Millipore, Billerica, MA) i 1 time. Membranerne blev blokeret med 5% fedtfri tørmælk i Tris-bufret saltvand indeholdende 0,05% Tween-20 i 2 timer, efterfulgt af inkubation med primære antistoffer natten over ved 4 ° C. De primære antistoffer af GAPDH (Cat # 4695s), ERK1 /2 (Cat # 5174), p-ERK1 /2 Thr202 /Tyr204 (Cat # 4370), JNK (Cat # 9252), p-JNK Thr183 /Tyr185 (Cat # 9251), P38 (Cat # 8690), p-P38 Thr180 /Tyr182 (Cat # 4511) og Caspase3 (Cat # 9664) var fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA), Bcl-2 (Cat # sc-509), Bax (Cat # sc-20067) og cyclin D1 (Cat # sc-753) var fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Membranen blev derefter inkuberet med peberrodsperoxidase-konjugeret kanin eller mus sekundære antistoffer i 1 time ved stuetemperatur. Immunoreaktive bånd blev påvist ved hjælp af Super Signal West Pico kemiluminescerende substrat (Thermo Scientific, Rockford, IL).

tumorvækst studier i musemodel af type 2 diabetes

Dette projekt blev godkendt af Animal Care og brug Udvalg for Folkets Hospital i Guangxi Zhuang autonome Region, Nanning, Kina (# 2011-005). Mandlige B6.BKS-Lepr

db mus (

db /db

) og deres heterozygote kuld (

db /+

) blev købt fra The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Alle procedurer fulgt National Institutes of Health retningslinjer for pasning og anvendelse af forsøgsdyr. Mus blev opstaldet i en specifik patogen fri facilitet under standard 12 timers lys /mørke cyklus og fodres standard gnaverfoder og vand

ad libitum

. Otte uger gamle

db /db

mus blev anvendt som type 2-diabetes-model, mens de

db /+

mus som raske kontrolpersoner. MC38-celler blev ekspanderet i DMEM medium suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin /streptomycin

in vitro

. 2 × 10

6 MC38-celler suspenderet i 0,1 ml PBS blev injiceret subkutant i den højre flanke af hver mus at initiere tumorvækst. For

in vivo

ERK1 /2-og JNK blokerende studier, 10 mg /kg PD98059 eller 30 mg /kg SP600125 blev administreret intraperitonealt (ip) hver 3 dage, hvor tumor volumen nåede 100mm

3 (7- 8 dage efter tumorinitiering) og varede i yderligere 2 uger. 1% DMSO blev anvendt som kontrol behandling. Størrelserne af tumorer blev målt hver 3. dag med passere, når tumorerne begyndte at vokse. Enhver en dimension af tumoren oversteg 20 mm eller tumorbelastning var større end 10% af kropsvægten blev betragtet som endepunkter observation. Tumorvolumen blev beregnet ved formlen: tumorvolumen = bredde

2 × længde × π /6 [22]. CO

2 og cervikal dislokation blev anvendt til mus eutanasi. Tumorer blev udskåret og tumorvægt blev registreret ved slutningen af ​​forsøgene. En del af tumorerne fra begge grupper blev anvendt til tumor lysat i Western blot eksperimenter.

Målinger af blodglucose, insulin og IGF-1

Mus blev fastet i 6 timer, og blodglucose koncentration blev overvåget i veneblod fra halevenen under anvendelse af en glucometer (Roche, Basel, Schweiz). Ved aflivning udtoges blodprøver for at måle serumkoncentrationerne af insulin og IGF-1. Serum insulin og IGF-1 blev bestemt ved et enzymimmunoassay ifølge fabrikantens protokol (R 0,05 blev betragtet som signifikante

Resultater

Insulin /IGF-1 fremmer kolon kræftceller spredning og cellecyklusprogression

in vitro

tidligere undersøgelser har vist, at insulin og IGF-1 har pro-spredning virkninger i forskellige cancerceller [13]. Vi spekulerede at insulin eller IGF-1 fik de samme effekter på MC38 celler, en mus afledt tyktarmskræft cellelinje. Da blod insulin og IGF-1-niveauer steg i T2DM patienter, kombination af insulin og IGF-1 (insulin /IGF-1) også blev anvendt til at efterligne dette miljø

in vitro

. Faktisk fandt vi, at enten insulin eller IGF-1 fremmet udvidelse af MC38 celler

in vitro

(Fig 1A). For at bestemme de pro-proliferative virkninger af insulin og IGF-1 blev en CCK-8 assay anvendes til påvisning cellelevedygtigheden. Som vi forventede, enten insulin eller IGF-1 fremmet proliferationen af ​​MC38-celler på en dosisafhængig måde. Endvidere kombinationen af ​​insulin og IGF-1 viste en additiv virkning i proliferation (Fig 1B). Salg

MC38-celler blev dyrket med forskellige koncentrationer af insulin og IGF-1 i 72 timer. Kontrolgrupper blev behandlet med PBS. blev observeret (A) Cell morfologi. (B) Celler blev høstet for proliferation analyse med CCK-8 assay. * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001 versus kontrol,

# P 0,05;

## P 0,01 mellem de angivne to grupper, n = 3 per gruppe. (C) Cellecyklusanalyse af insulin /IGF-1-behandlede celler. DNA-indhold blev målt ved PI farvning på flowcytometri. Procentdelene af cellecyklusfaser er vist i hvert panel. De viste data er repræsentative for tre separate eksperimenter.

Vi næste behandlet spørgsmålet om insulin /IGF-1 forfremmet cellecyklusprogression i MC38 celler. For cellecyklusanalyse blev DNA-indhold målt ved PI farvning på flowcytometri efter 72 timers insulin og IGF-1 behandling. Celle cyklus analyse viste, at insulin /IGF-1 reducerede signifikant andel af MC38-celler i G0 /1-fase, og øget andelen af ​​MC38-celler i S-fasen (figur 1C). viste således disse data, at insulin /IGF-1 fremmer tyktarmskræft celledeling og cellecyklus progression

in vitro

.

Insulin /IGF-1 hæmmer kolon kræftceller apoptose

in vitro

Apoptose spiller en vigtig rolle under vækst kræft. At vurdere, om insulin /IGF-1 påvirkede apoptose af MC38-celler

in vitro

blev celler dyrket med insulin og IGF-1 alene eller begge sammen i 72 timer. Celler blev høstet for apoptose analyse ved Annexin V og PI farvning på flowcytometri. Den apoptose assay viste, at insulin og IGF-1 alene eller begge sammen faldt de samlede apoptotiske celler (Fig 2A og 2B). For yderligere at identificere den fase af apoptose, blev den tidlige fase og sene fase apoptotiske celler målt også. Som forventet, alle behandlinger faldt tidligt apoptose og sent apoptose, undtagen IGF-1 alene kunne ikke påvirke sent apoptose (Fig 2A og 2C). Resultaterne viste, at insulin /IGF-1 inhiberer coloncancerceller apoptose

in vitro

.

MC38-celler blev dyrket med insulin og IGF-1 alene eller begge sammen i 72 timer. Kontrolgrupper blev behandlet med PBS. (A) Celler blev høstet for apoptose analyse ved Annexin V og PI farvning på flowcytometri. Den tidlige fase (Annexin V + /PI-) og sent (Annexin V + /PI +) apoptotiske hændelser blev gated. De viste data er repræsentative for tre separate forsøg. Kvantificering af total procentdel (B) og procent tidlig /sen fase (B) af apoptotiske celler efter behandlingerne. * P 0,05; ** P. 0,01 versus kontrol, n = 3 per gruppe

Insulin /IGF-1 aktiverer ERK1 /2 og JNK signalering af tyktarmskræft celler

in vitro

tidligere undersøgelse viste, at Ras-Raf-MAPK signal, der fungerer som nedstrøms for insulin /IGF-1-signalering spiller en rolle i proliferationen af ​​forskellige kræftformer [18-20]. For at bestemme om Ras-Raf-MAPK signal involveret i insulin /IFG-1sinaling transduktion, vi har registreret de 3 vigtigste downstream molekyler (ERK1 /2, JNK og P38) i Ras-Raf-MAPK signalvej. MC38-celler blev dyrket i 72 timer med forskellige behandlinger og høstet til Western blot-analyse (Fig 3A). Vi fandt, at insulin, IGF-1 og insulin /IGF-1 forøgede phosphorylering af ERK1 /2 og JNK, undtagen P38 (fig 3B-3D). Endvidere var der additiv effekt, når insulin og IGF-1 blev anvendt sammen (fig 3B og 3C). Således viste disse data, at insulin /IGF-1 aktiverer ERK1 /2 og JNK signalering af tyktarmskræft celler

in vitro

.

MC38-celler blev dyrket med insulin og IGF-1 alene eller begge sammen i 72 timer og derefter opsamlet for western blotting-analyse. Kontrolgrupper blev behandlet med PBS. (A) Western blotting-analyse af p-ERK1 /2, ERK1 /2, p-JNK, JNK, p-P38 og P38 proteinekspression i behandlede celler. GAPDH tjente som en belastning kontrol. De viste blots er repræsentative for tre separate forsøg. Semi-kvantitering for udtrykkene for (B) ERK1 /2 og pErk1 /2, (C) JNK og p-JNK, (D) P38 og p-P38 proteiner. Fold ændringer blev normaliseret ved kontrolgrupper. * P 0,05; ** P 0,01; *** P. 0,001 versus kontrol, n = 3 per gruppe

Hæmning af ERK1 /2 eller JNK signalering afskaffer de proliferative og anti-apoptotiske virkninger af insulin /IGF-1

i vitro

Vi næste vurderet, om virkningerne af insulin /IGF-1-signalet var ERK1 /2 og JNK afhængige. MC38-celler blev behandlet med insulin /IGF-1 med eller uden 40 pM ERK1 /2-inhibitor PD98059 eller 20 uM JNK inhibitor SP600125 i 24, 48 eller 72 timer. Proliferationen blev målt ved anvendelse af CCK-8 kit. Som vist i fig 4A, den proliferative virkning af insulin /IGF-1 blev afskaffet ved enten PD98059 eller SP600125. Vi har registreret også virkningerne af ERK1 /2-inhibitor (fig 4B) og JNK-inhibitor (Fig 4C) i phosphorylering, apoptose og proliferation med western blot. Den kombinerede insulin /IGF-1 dramatisk forøget ekspression af anti-apoptotisk protein Bcl-2, proliferativ protein cyclin D1 og faldt ekspressionen af ​​apoptotiske protein Bax og caspase 3. Behandlet med enten PD98059 eller SP600125 kunne vende disse virkninger. Resultaterne viste, at inhibering af ERK1 /2 eller JNK signalering ophæver de proliferative og anti-apoptotiske virkninger af insulin /IGF-1

in vitro

.

MC38-celler blev dyrket med insulin og IGF 1 alene eller begge sammen i 72 timer. ERK1 /2-inhibitor PD98059 (B), JNK inhibitor SP600125 (C) eller deres køretøj DMSO tilsat til kulturerne når MC38-celler blev behandlet med både insulin og IGF-1. (A) Celler blev opsamlet for proliferation analyse med CCK-8 assay ved 24, 48 og 72 time. ** P 0,01; *** P 0,001 mellem de angivne to grupper, n = 3 per gruppe. (B og C) Western blotting-analyse for p-ERK1 /2, ERK1 /2, p-JNK, JNK, cyklin D1, Bcl2, Bax og Caspase3 proteinekspression i de behandlede MC38-celler. GAPDH tjente som en belastning kontrol. De viste blots er repræsentative for tre separate eksperimenter.

Endogen insulin og IGF-1 er steget i mus type 2-diabetes model

Otte uger gammel mand

db /db

mus blev anvendt til at etablere en spontan type 2-diabetes model. Mens deres

db /+

søskende blev brugt som normale kontroller. I begyndelsen af ​​eksperimenterne blev kropsvægten og blodglucose testet til confirme hvorvidt den diabetiske model var vellykket. Vi fandt, at

db /db

mus var overvægtige i forhold til deres

db /+

søskende, der fik den normale vægt (Fig 5A). Den fastende blodglucose i

db /db

mus blev dramatisk forhøjet (Fig 5B). Vi derefter afgøres, om serum insulin og IGF-1 blev ændret i disse mus. Serum insulin blev forøget i

db /db

mus som forventet (Fig 5C). Hvad mere er, serum IGF-1 i

db /db

mus blev også steget markant (figur 5D). Disse resultater viste, at

db /db

mus er ideelle modeller for type 2-diabetes med højt niveau af insulin og IGF-1.

Mand

db /db

mus blev anvendt som mus type 2-diabetes-modeller, mens

db /+

kuldsøskende som normale kontroller. Kropsvægt (A), blodglucose (B), insulin (C) og IGF-1 (D) blev bestemt før MC38-celler injektion i 8

th uge. * P 0,05; *** P. 0,001, n = 5 pr gruppe

Endogen insulin /IGF-1 accelererer kolon tumorvækst i mus type 2-diabetes model

For yderligere at validere effekten af endogen insulin /IGF-1 i væksten af ​​colon tumor, blev MC38-celler subkutant injiceret i

db /db

eller

db /+ Salg mus at initiere tumorvækst. Tumorvolumener måltes på forskellige tidspunkter efter inokulering, og tumorvægte blev målt efter aflivning. Vi fandt, at tumorvækst var hurtigere, og tumorvægt var tungere hos

db /db

mus end

db /+

mus (Fig 6A og 6B). Næste vi opdaget phosphorylering af ERK1 /2 og JNK, cyklin D1, Bcl-2, caspase 3 og Bax i tumorvæv. Både p-ERK1 /2 og p-JNK udtryk var højere i

db /db

mus (Fig 6C og 6D). Udtrykkene af cyclin D1 og Bd-2 blev forøget, mens udtryk for Bax og caspase 3 blev nedsat i

db /db

mus, der var i overensstemmelse med observationerne

in vitro

(Fig 6E og 6F). Resultaterne viste, at endogen insulin /IGF-1 accelererer colon tumorvækst i en mus type 2-diabetes model.

2 × 10

6 MC38 celler suspenderet i 0,1 ml PBS blev subkutant injiceret i

db /db

db /+

mus at initiere tumorvækst

in vivo

. (A) Tumor size blev målt hver 3. dag. * P 0,05; *** P 0,001. (B) Tumorerne blev udskåret og vejet 3 uger efter celleinjektion. *** P 0,001. En repræsentativ tumormasse fra hver gruppe blev vist i det indsatte (skala bar = 1cm). (C og E) Western blotting-analyse af p-ERK1 /2, ERK1 /2, p-JNK, JNK, cyklin D1, Bcl-2, Bax og Caspase3 proteinekspression i tumorer. GAPDH tjente som en belastning kontrol. De viste blots er repræsentative for tre separate forsøg. (D og F) Semi-kvantificering for udtryk for ERK1 /2 og pErk1 /2, JNK og p-JNK, cyklin D1, Bcl-2, Bax og Caspase3 protein. Fold ændringer blev normaliseret ved kontrolgrupper. * P 0,05; ** P. 0,01 versus kontrol, n = 3 per gruppe

Hæmning af ERK1 /2 eller JNK signalering undertrykker udviklingen af ​​tyktarmen tumor i mus type 2-diabetes model

På afslutningen af ​​denne undersøgelse, at finde ud af, om udviklingen af ​​colon tumor i

db /db

mus blev ERK1 /2 eller JNK afhængig, vi anvendte ERK1 /2 eller JNK-inhibitor til behandling af tyktarmen tumorbærende

db /db

mus. Vi fandt, at virkningen af ​​ERK1 /2 eller JNK-inhibitor var dosisafhængig og 10 mg /kg PD98059 eller 30 mg /kg SP600125 viste en bedre virkning til blokering tumorøse ERK1 /2 eller JNK signalering henholdsvis

in vivo

(S1 fig). Som vi forventede, PD98059 eller SP600125 viste en signifikant undertrykkelse i tyktarmen tumorvækst

in vivo

, hvilket var i overensstemmelse med de resultater

in vitro

(Fig 7A). Tumormassen målinger ved slutningen af ​​eksperimenter viste de samme resultater (fig 7B).

2 × 10

6 MC38 celler suspenderet i 0,1 ml PBS blev subkutant injiceret i

db /db

mus at initiere tumorvækst

in vivo

. 10 mg /kg PD98059 eller 30 mg /kg SP600125 blev administreret intraperitonealt hver 3 dage, hvor tumorvolumen nået 100mm

3. 1% DMSO blev anvendt som kontrol behandling. (A) Tumor size blev målt hver 3. dag. * P 0,05; *** P 0,001. (B) Tumorerne blev udskåret og vejet 3 uger efter celleinjektion. *** P 0,001. En repræsentativ tumormasse fra hver gruppe blev vist i det indsatte (skala bar = 1cm). (C og E) Western blotting-analyse af p-ERK1 /2, ERK1 /2, p-JNK, JNK, cyklin D1, Bcl-2, Bax og Caspase3 proteinekspression i tumorer. GAPDH tjente som en belastning kontrol. De viste blots er repræsentative for tre separate forsøg. (D og F) Semi-kvantificering for udtryk for ERK1 /2 og pErk1 /2, JNK og p-JNK, cyklin D1, Bcl-2, Bax og Caspase3 protein. Fold ændringer blev normaliseret ved kontrolgrupper. ** P 0,01; *** P. 0,001 versus kontrol, n = 3 per gruppe

Vi har detekteret også udtryk for målrettede og nedstrøms proteiner efter PD98059 eller SP600125 behandling i denne model (Fig 7C-7F). Som vi forventede, PD98059 og SP600125 specifikt blokeret ERK1 /2 og JNK henholdsvis

in vivo

(Fig 7C og 7D). Både PD98059 og SP600125 reducerede ekspressionen af ​​cyclin D1 og Bcl-2, men forøgede ekspression af caspase 3 og Bax (fig 7E og 7F). Disse resultater bekræftede, at inhibering af ERK1 /2 eller JNK signalering undertrykker udviklingen af ​​colon tumor i mus type 2-diabetes model.

Discussion

I den foreliggende undersøgelse, observerede vi, at insulin og IGF 1, fungere som mitogener af kolon kræftceller, aktivere ERK1 /2 og JNK MAPK signalering, hvilket resulterer i cellecyklus acceleration, cellevækst og anti-apoptose i tyktarmskræft MC38 celler. Desuden har vi bekræftet disse resultater

in vivo

ved at etablere et kolon tumor allograft model med T2DM.

Diabetes er karakteriseret ved defekter i glukose homøostase og insulin funktion. T2DM, som er karakteriseret ved insulinresistens og høje insulin niveauer, udgør 90-95% diabetes mellitus [23]. Årtiers epidemiologisk dokumentation viste, at T2DM var forbundet med en øget risiko for kræft på forskellige steder, herunder colorectum, lever, bugspytkirtel, bryst og blære [24]. Vores tidligere undersøgelse viste, at T2DM kan være en af ​​de vigtigste risikofaktorer patogene for kolorektal cancer i kinesisk [25]. Der var dog også nogle forskere hævdede, at disse foreninger kan skyldes fordomme i litteraturen [26, 27]. En nylig paraply revision, som vurderede associationer mellem T2DM og risikoen for at udvikle kræft i 20 lokaliteter, viste, at kun colorectal, bryst, intrahepatisk cholangiocarcinom, og endometriecancer havde solid dokumentation for risikoen for at udvikle kræft uden antydninger af fordomme [28].

mekanismerne i T2DM fremmer udviklingen af ​​kræft er endnu ikke undersøgt, herunder hyperinsulinæmi, højt niveau af IGF-1 og hyperglykæmi i T2DM [29]. Vores tidligere undersøgelser viste, at insulin glargine fremmet væksten af ​​humane coloncancer (HCT-116 og SW480 celler) og brystcancer (MCF-7-celler)

in vitro

[30, 31]. Hvad mere er, blev glargin insulin behandling menes at øge risikoen for at udvikle tyktarmskræft [32]. Derudover hyperinsulinæmi fører også til øge niveauet af bioaktive IGF-1, som er en kraftig mitogen, som kan resultere i carcinogenese [33]. Men et randomiseret kontrolleret studie understøtter ikke hypotesen om, at hyperglykæmi var relateret til øget kræftrisiko [34]. Derfor kan hyperinsulinæmi og højt niveau af IGF-1 være de vigtigste mekanismer. Resultaterne af vores undersøgelse understøtter denne hypotese. Vi fandt, at kombinationen af ​​insulin og IGF-1 signifikant fremmet vækst og celle cyklus af murine Tyktarmskræft MC38 celler end engangsbrug af insulin eller IGF-1

in vitro

. Dette resultat viste også, at insulin /IGF-1 havde en additiv effekt i MC38-celler proliferation.

MAPK signalveje, som konverterer ekstracellulære signaler til specifikke cellulære responser gennem serier af phosphoryleringsbegivenheder, spiller en vigtig rolle i colon cancerudvikling og metastase [35]. ERK1 /2, P38 og JNK er de 3 store MAPK familier fundet aktiveret i kolorektal cancer. Tidligere undersøgelser tydede på, at ERK1 /2-vejen, men ikke JNK eller p38 pathway, er en vigtig regulator af celleproliferation i colorektal cancer [36]. De to andre MAPK veje, det P38 og JNK, mægle apoptose og inflammatorisk respons [36]. virkningerne af JNK-aktivering, kan imidlertid være forskellige i regulering af apoptose når cellen modtager forskellige stimulation. For øjeblikkelig, vækstfaktorer fører til spredning og anti-apoptose via JNK, mens de inflammatoriske cytokiner (fx TNF-α) føre til apoptose [37]. Det er blevet almindeligt accepteret, at insulin eller IGF-1 fremmer udbredelsen af ​​forskellige kræftformer ved at aktivere MAPK signalings [18-20]. Vores nuværende undersøgelse viste klart, at insulin /IGF-1 aktiveret ERK1 /2 og JNK MAPK men ikke P38 MAPK signalering i proliferation af MC38-celler. Inhiberingen af ​​ERK1 /2 eller JNK viste, at begge disse MAPK signalings bidraget til proliferation og anti-apoptose. Men Carlson et al. rapporterede, at insulin ikke forbedre ERK1 /2, JNK eller P38 phosphorylering i adipocytter fra T2MD patienter [38]. Mens GOGG et al. viste, at MAPK signalering (ERK1 /2) blev øget, men insulin signalering blev svækket i subkutane mikrovaskulære endotelceller fra T2MD patienter [39]. De ovennævnte og vores resultater viste, at aktivering og virkningerne af MAPK signalering ved insulin eller IGF-1 i forskellige cellelinjer kan være forskellige.

Dernæst vi bestemt at bekræfte vores hypotese med en mus T2DM model

in vivo

. Manglen på pålidelige dyremodeller, der efterligner menneskelig T2DM har forsinket de undersøgelser af specifikke mekanismer involveret i samspillet mellem T2DM og kræft udvikling. I løbet af disse årtier blev flere mus T2DM modeller indført i diabetiske undersøgelser. Der er 2 typer af mus T2DM model: inducerede og spontane T2DM modeller [40]. kost højt fedtindhold plus lav dosis af streptozotocin er en ofte brugt metode til induceret T2DM hos mus. Men lang tid, der kræves til induktion, ustabil hyperinsulinæmi og stor variation er begrænsningerne ved denne model. [41]. De leptin receptor knockout-mus (

db /db

mus) er relativt egnet til spontan T2DM model [42]. I den aktuelle undersøgelse, fandt vi, at blodsukkeret, serum-insulin og IGF-1 var yderst højere i

db /db

mus end

db /+

mus ved 8 uger gamle. Disse parametre blev korreleret med T2DM patienter. Desuden både

db /db

mus og tyktarmskræft MC38 celler vi brugte var med C57BL /6 baggrund, hvilket gjorde det muligt for os at etablere en MC38 kolon tumor allograft i

db /db

mus. Derfor

db /db

mus blev den ideelle spontane T2DM model i vores undersøgelse. Kazuya et al.

Be the first to comment

Leave a Reply