PLoS ONE: En Fluorescens-Coupled Assay for Gaba (GABA) Afslører metabolisk stress-induceret Modulation af GABA Indhold i Neuroendokrine Cancer

Abstrakt

Pathways er involveret i syntesen af ​​neurotransmitteren gamma-aminosmørsyre ( GABA) er blevet impliceret i patogenesen af ​​høj kvalitet neuroendokrine (NE) neoplasmer samt neoplasmer fra en ikke-NE afstamning. Brug af Cancer Genome Atlas, overekspression af GABA syntetisk enzym, glutamat decarboxylase 1 (

GAD1

), viste sig at være forbundet med nedsat sygdomsfri overlevelse i prostata adenokarcinom og nedsat samlet overlevelse i klare celle renal cell carcinomer . Desuden

GAD1

blev fundet, at blive udtrykt i kastrationsniveauer-resistent prostatacancer cellelinier, men ikke androgen-responsive cellelinier. Ved hjælp af en hidtil ukendt fluorescens-koblet enzymatisk mikroplade assay for GABA medieres gennem reduktion af resazurin i en prostata neuroendokrine karcinom (PNEC) cellelinie, syre mikromiljø-induceret stress forøgede GABA niveauer, mens alkalisk mikromiljø-induceret stress faldt GABA gennem modulation af GAD1 og glutaminsyntetase (GLUL) aktiviteter. Desuden glutamin, men ikke glukose afsavn faldt GABA gennem modulation af GLUL. Overens med vidnesbyrd i prokaryote og eukaryote organismer, som GABA-syntese medieret gennem GAD1 kan spille en afgørende rolle i overlevende stress, kan GABA være en vigtig mediator af stress overlevelse i neoplasmer. Disse resultater identificerer GABA-syntese og metabolisme som en potentielt vigtig vej til regulering kræftcellen stress respons samt et potentielt mål for terapeutiske strategier

Henvisning:. Ippolito JE, Piwnica-Worms D (2014) En Fluorescens-Koblet Assay for Gaba (GABA) afslører metabolisk stress-induceret Modulation af GABA Indhold i Neuroendokrine Cancer. PLoS ONE 9 (2): e88667. doi: 10,1371 /journal.pone.0088667

Redaktør: Domenico Coppola, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA

Modtaget: 22 oktober, 2013; Accepteret: 15 januar 2014; Publiceret: 13. februar 2014

Copyright: © 2014 Ippolito, Piwnica-Worms. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev finansieret af tilskud fra Radiologisk Society of North America (RR1031, https://www.rsna.org) og National Institutes of Health (P50 CA94056). Den HTS kerne er delvist understøttet af et tilskud til Siteman Cancer Center (P30 CA091842). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

neuroendokrine (NE) system er en diffus netværk af celler, der distribueres gennem de forskellige væv og organer, der kan producere lokale eller systemiske virkninger på fysiologi gennem sekretion af hormoner eller neurotransmittere. Selv om nogle celler skyldes neurale våbenskjold, er de fleste stammer fra multipotentielle epiteliale stamceller [1]. Neuroendokrine (NE) carcinomer, som menes at stamme fra den NE-systemet, forekommer i stort set alle anatomiske steder og vise et bredt spektrum af fænotypiske adfærd fra godartede til metastatisk [2], [3]. For eksempel, “klassiske” carcinoide tumorer eller lav kvalitet NE karcinomer er godt differentierede, har et lavt mitotisk indeks, og ligner NE celle hyperplasi [2], [3], mens små celle karcinomer eller høj kvalitet NE carcinomer er aggressive og dårligt differentieret [4] – [9]. High Grade NE karcinomer karakteristisk har en lang række områder af nekrose, en høj mitotisk indeks [2], [3], og en dårlig prognose. Konventionelle behandlinger ikke forbedrer patientens overlevelse hos patienter med høj kvalitet NE karcinom [10].

adenocarcinomer, der er langt mere almindelige, skyldes en epitelial oprindelse og vise en kirtel vækstmønster [11]. Interessant, kan adenokarcinomer udstille NE funktioner karakteriseret molekylært som udtryk for genprodukter associeret med NE celle afstamning. Dette fænomen er blevet påvist i mange typer adenocarcinom, herunder fra lunge-, prostata- og colon og korrelerer med tumor aggressivitet, metastase, og afkortet overlevelse [12] – [19]. Specifikt i tilfælde af prostatacancer, ekspressionen af ​​NE har positivt korrelerer med metastatisk potentiale og kastrationsresistent vækst [19] – [21]. Desværre forbliver biologi NE celler såvel som deres bidrag til orgel homeostase ufuldstændigt defineret, delvis på grund af manglen af ​​disse celler i normale organer [22].

Tidligere brugte vi en kombination af genekspression profilering, massespektrometri og kernemagnetisk resonansspektroskopi at belyse en række metaboliske netværk impliceret i aggressive NE cancere under anvendelse af en genetisk manipuleret musemodel af metastatisk prostatacancer NE carcinom og et derivat prostata NE carcinoma (PNEC) cellelinie, hvori cryptdin 2 promotor drev udtryk for onkogen stort T-antigen (CR2-tag) [13], [23] – [25]. Resultaterne af disse analyser identificeret syntesen og metabolisme af gamma-aminosmørsyre (GABA) afledt fra både tricarboxylsyre (TCA) cyklus mellemprodukter og polyaminer (samlet benævnt GABA shunt) som en metabolisk netværk fremtrædende op reguleret i aggressive NE karcinomer [ ,,,0],13].

Moderne specialiserede instrumentering, der anvendes til metaboliske analyser, såsom massespektrometri (MS) og nuklear magnetisk resonans (NMR) er dyre, kræver betydelig træning til at fungere, og kan ikke være let tilgængelige for mange akademiske laboratorier . Klassisk enzymatisk-baserede metabolit kvantificering, på den anden side, giver en omkostningseffektiv, let tilgængelige, følsomme midler til kvantitativ analyse af metabolitter [26]. Selv ikke give samtidig oplysninger om de mængder af flere metabolitter, enzymatisk kvantificering giver mulighed for at samtidigt kvantificere en given metabolit på tværs af mange prøver på en high-throughput platform [27] – [29].

Pyridin nucleotide- baserede enzymatiske assays, der kobler produktionen af ​​NADH eller NADPH (samlet benævnt NAD (P) H) til et biokemisk reaktion er attraktive, da disse reducerede nucleotider fluorescerer og kan derfor anvendes til kvantitativ udlæsning af enzymaktivitet eller metabolitter. baggrundsfluorescens i biologiske væv, kan imidlertid begrænse følsomhed NAD (P) H detektion [26].

Flere strategier for at øge den fotoniske output og forbedre følsomheden af ​​enzymatiske reaktioner er blevet udviklet [26], [ ,,,0],30] – [32]. En strategi involverer kobling af NAD (P) H-syntese til mitokondrie lipoyl dehydrogenase (diaphorase), som aktiverer kemiske substrater til kromogene eller fluorescens assays. Resazurin er en sådan forbindelse, der kan anvendes til enzymatisk koblede og cellelevedygtighedsassays [27], [33], [34]. Her rapporterer vi en hidtil ukendt enzymatisk assay til kvantificering af GABA og kunne bruge dette assay at karakterisere ændringer i cellulær GABA i PNEC celler under metabolisk stress.

Materialer og metoder

Reagenser

Alle kemiske og enzymatiske reagenser blev købt fra Sigma.

Cell Culture

Alle cellelinjer rutinemæssigt testet mycoplasma negativt. Alle cellelinier blev dyrket ved lav passage under traditionelle betingelser ifølge ATCC protokoller en O 95%

2/5% CO

2 inkubator ved 37 ° C. En selvstændig fastgørelse subklon af prostata Neuroendokrine Cancer (PNEC) cellelinie [35] blev dyrket som tidligere beskrevet [36]. Kort fortalt blev DMEM /F12-medium (Invitrogen) suppleret med 10% varmeinaktiveret FBS (Gibco), 1% ikke-essentielle aminosyrer (NEAA, Gibco), B27 serum supplement (Invitrogen), 5 ng /ml EGF (BDBiosciences), 5 ng /ml bFGF (Sigma), og 15 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsyre (HEPES) puffer (Gibco). Alle celler blev dyrket til maksimalt 75% konfluens. Celler blev trypsinbehandlet, neutraliseret med vækstmedie og passeret. Cellepellets for RNA eller biokemiske assays blev spundet ned ved 125 x g i 5 min ved 4 ° C. Celler blev vasket med iskold phosphatpufret saltopløsning og centrifugeret igen. Supernatanter blev aspireret og pellets lynfrosset i flydende nitrogen. Alle prøver blev opbevaret ved -80 ° C indtil yderligere anvendelse.

Evaluering af overlevelseskurver fra The Cancer Genome Atlas (TCGA)

cBioPortal for Cancer Genomics [37], [38], forudsat gennem The Cancer Genome Atlas data Portal blev brugt til at få adgang til og visualisere kliniske og genekspression datasæt af human prostata adenocarcinom [39] og human klar celle renalcellecarcinom [40]. Kun “mRNA udtryk z-scores vs. Normals” valgmulighed blev kontrolleret. “Alle tumorer” blev udvalgt til forespørgslen. RNASeq data blev anvendt til de klare celle carcinom datasæt. Overlevelseskurver blev vurderet baseret på ekspression af gener i GABA-shunt. Prøver der udviser øget

GAD1

udtryk (z score 2 eller 3), og faldt

GLUL

udtryk (z -2) blev identificeret og kliniske oplysninger eksporteres. Overlevelse kurver blev konstrueret med GraphPad Prism.

Real Time PCR Primer Design

Primere for real time PCR blev designet ved hjælp PrimerBLAST.

GAD1

(NM_000817.2), men ikke 18S rRNA (

RNA18S5

, NR_003286.2), er designet på tværs af en intron-exon junction. Udvalgte primere havde ikke nogen forudsagte off-target amplifikation i det humane genom. Primer smeltetemperaturer blev udformet mellem 61 ° C og 63 ° C. Primere blev testet med PCR fra cDNA syntetiseret ud fra NCI-H660 og LNCaP-cellelinjer. Amplikoner af forventede længde (GAD1:145 bp; 18S: 182 bp) blev opnået fra cDNA-præparater og var ikke tydeligt i PCR-reaktioner under anvendelse af genomisk DNA som en skabelon eller vand alene. Smelt kurver og amplifikationseffektiviteter af alle primerpar blev udført. Primersekvenserne er som følger:

GAD1

(frem): 5′-ATGGGGTTCGCACAGGTCATCC-3 ‘,

GAD1

(omvendt): 5′-TCCATGAGGACAAACACTGGTGCA-3′;

RNA18S5

(frem): 5′-GGGCATTCGTATTGCGCCGC-3 ‘,

RNA18S5

(omvendt): 5’GAATAACGCCGCCGCATCGC-3′.

Real Time PCR

RNA blev isoleret fra lynfrosset cellepellets ved anvendelse af RNeasy kittet (Qiagen). Efter RNA-ekstraktion blev alle RNA-prøver alikvoteret og opbevaret ved -80 ° C. Alle RNA-prøver blev behandlet med TURBO Dnase (Ambion) til fjernelse af genomisk DNA. Alle RNA anvendes til kvantitativ PCR blev straks revers transkriberet med iScript kit (BioRad). Renheden af ​​cDNA’et blev vurderet med 18S rRNA PCR-amplifikation af cDNA prøve og en negativ kontrolprøve af RNA, som manglede den revers transkriptase. Alle prøver, der anvendes til efterfølgende qPCR forsøg havde ikke påviselige genomisk DNA-kontaminering, som påvist ved en mangel på et 18S amplikon efter 40 cykler af reaktionen mangler revers transkriptase. Hver prøve blev testet i triplikat ved 50 ng cDNA. Real-time PCR blev udført med SYBR green Master Mix (BioRad) og en 100-nM-koncentration af den specifikke primersæt i en Bio-Rad CFX96 PCR instrument (95 ° C i 10 minutter, derefter 40 cykler ved 95 ° C i 30 s , 61 ° C i 1 min, og 74 ° C i 1 min). 18S rRNA primere blev anvendt som en intern standard.

metabolisk stress Eksperimenter

I næringsberøvelse eksperimenter, DMEM /F12 medier, der mangler glucose, pyruvat og glutamin (USBiological) anvendt. Medier blev suppleret med følgende komponenter: varmeinaktiveret dialyseret serum med en 10 KDa molekylvægtsafskæring (Sigma), 1% ikke-essentielle aminosyrer (NEAA, Gibco), 5 ng /ml EGF (BDBiosciences), og 5 ng /ml bFGF (Sigma). Glucose og glutamin (Gibco) blev suppleret med de specialiserede medier, når det er nødvendigt. Glucose blev tilsat til mediet ved anvendelse af standard DMEM /F12 formulering koncentrationer af 17,5 mM. Glutamin blev anvendt ved 6 mM. Forud for metabolisk stress eksperimenter blev PNEC-celler udpladet ved en densitet på 400.000 celler per brønd i en plade 12 med 1,5 ml standard vækstmedium. Celler lodes vokse i 24 timer. Medier blev derefter udskiftet med 1,5 ml stress medier. For alle pH-stress eksperimenter blev konventionelle medier PNEC vækst anvendes uden bikarbonat eller HEPES buffere og blev ændret som følger. For syre stress, 2 – (

N

-morpholino) ethansulfonsyre (MES), pH 6,5 blev tilsat til en slutkoncentration på 20 mM. Til konventionel pH blev HEPES, pH 7,4 tilsat til en slutkoncentration på 20 mM og natriumhydrogencarbonat tilsat til en slutkoncentration på 0,34 g /L. For alkalisk stress, blev tris (hydroxymethyl) aminomethan (Tris), pH 8,5 tilsat til en slutkoncentration på 20 mM og natriumhydrogencarbonat tilsat til en slutkoncentration på 0,34 g /L. Celler blev derefter inkuberet i et fugtigt kammer uden CO

2 ved 37 ° C i 24 timer.

Prøveforberedelse

Prøveforberedelse til enzymatisk assay blev modificeret fra tidligere beskrevne fremgangsmåder [13 ], [26]. For stress eksperimenter blev mediet hurtigt aspireret fra brøndene, og celler blev skyllet med 1 ml PBS. For syre og base stress eksperimenter blev brønde skyllet med saltvand bufret til en passende pH med 20 mM MES eller HEPES som ovenfor. Celler blev derefter lyseret i 200 pi iskold lysis-opløsning (50 mM natriumhydroxid og 1 mM EDTA) og forsigtigt omrystet i 30 sek. Et tilsvarende volumen af ​​100 mM saltsyre blev derefter tilsat til forsure lysat. Pladerne blev tildækket med klæbemiddel PCR film forsegling og inkuberet i et vandbad ved 60 ° C i 30 minutter for at ødelægge endogent enzymaktivitet samt endogen NADH. Efter inkubation blev pladerne kortvarigt centrifugeret ved 100 x g (Allegra 6R; Beckman-Coulter) for at udelukke kondensat. Filmen blev fjernet og 100 pi 400 mM Tris Base sattes til hver brønd til et samlet volumen på 500 pi lysat i hver brønd (endelig pH ca. 8). Lysater blev centrifugeret ved 15.000 x g i 5 minutter for at pelletere snavs og supernatanter blev opsamlet og nedfrosset ved -80 ° C indtil yderligere anvendelse.

Resazurin-baseret assay for GABA og succinylsemialdehyd Bestemmelse

efter reagens optimering, mastermiksen til kvantificering GABA og succinylsemialdehyd (SSAL) i prøver bestod af 0,063 U /ml GABase, 0,063 U /ml diaphorase, 6,25 pM resazurin, 100 uM nicotinamidadenindinucleotidphosphat (NADP), 5 mM alpha-ketoglutarat og 3,125 pM dithiothreitol (DTT) i 100 mM Tris-base, pH 8,8. Mastermiksen blev lavet frisk før hvert eksperiment.

A Mastermixen for kun kvantificering SSAL inkluderet ovennævnte reagenser samt 50 mM 2-aminoethyl hydrogensulfat, en inhibitor af GABA-transaminase komponent af GABase enzympræparat. Inhibitoren blev tilsat til mastermiksen i 10 minutter ved stuetemperatur før tilsætning af mastermiksens til prøverne. En frisk fremstilling af inhibitoren blev fremstillet før alle forsøg.

Alikvoter af prøven (10 pi) blev tilsat til brønde i en 96-brønds klar nederste sorte dyrkningsplade (Costar) efterfulgt af tilsætning af 90 pi MasterMix med en elektronisk multikanalpipette. To portioner af den samme prøve blev anvendt til bestemmelse af total GABA plus SSAL eller SSAL alene på den samme plade. Medmindre andet er angivet, blev reaktionen udført ved stuetemperatur og blev beskyttet mod lys i 30 minutter. Opnået fra resorufin, den fluorescerende produkt af resazurin signal, blev kvantificeret under anvendelse af en Fluostar Optima mikropladelæser (BMG Labtech) med en 544 nm excitation /590 nm emission filter sæt (gain, 1327; 10 blink pr brønd). Kinetic analyser blev udført med 1 minut cykler.

Signalet for total GABA plus SSAL i hver prøve blev trukket fra den alene SSAL signal at opnå signalet til GABA. Standardkurver for GABA og SSAL blev konstrueret til kvantificering og blev korrigeret for reaktionen blank med og uden tilstedeværelse af 2-aminoethyl-hydrogensulfat. GABA og SSAL målinger blev normaliseret til protein i lysaterne, kvantificeret med bicinchoninsyre (BCA) assay (Pierce) ved anvendelse af et bovint serumalbumin standardkurve. Data blev behandlet med GraphPad Prism. Næringsstoffer og pH stress grupper blev analyseret med en måde ANOVA og Dunnett post-test for statistisk analyse.

Resazurin-baserede assay for glutamat Bestemmelse

En enzymatisk assay til bestemmelse af glutamat blev udført som tidligere beskrevet [41]. Kort beskrevet reaktionskomponenterne inkluderet 10 uM resazurin, 4 U /ml glutamat dehydrogenase, 0,25 U /ml glutaminsyre-pyrodruesyre-transaminase, 100 uM alanin, 0,5 mg /ml NAD +, og 0,5 U /ml diaphorase i 100 mM Tris-HCI, pH 7.5. 10 pi af ovennævnte prøver blev tilsat til 90 pi af reaktionsblandingen og assays udføres i mørke ved stuetemperatur. Resorufin signal blev målt til 15 minutter. Næringsstoffer og pH stress grupper blev analyseret med en måde ANOVA og Dunnett post-test for statistisk analyse.

NAD (P) H Fluorescens-baserede GABase Assay

Analysen blev ændret fra Passoneau [26 ]. Mastermiksen bestod af 0,08 U /ml GABase, 5 mM alpha-ketoglutarat, 500 pM NADP, 100 pM DTT og 4 mM EGTA i 100 mM natriumpyrophosphat, pH 8,6. Alikvoter af prøven (10 pi) blev tilsat til 96-brønds optiske plader (Falcon 353.261) efterfulgt af 90 pi mastermiksens. Reaktionen blev udført ved stuetemperatur i 1 time og målt i en Fluostar Optima med en 340 nm excitation /450 nm emission filter sæt (gain, 2103, 10 blink pr brønd).

Western blotting af metaboliske enzymer

PNEC-celler blev udpladet, stresset, og vasket som beskrevet ovenfor. 100 pi iskold RIPA-buffer (10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 140 mM natriumchlorid, 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS), 0,1% natriumdeoxycholat og 1% Triton X-100) indeholdende 1 mM natriumorthovanadat og phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) blev tilsat. Celler blev skrabet fra brøndene på is og tilsat til mikrocentrifugerør. Prøverne blev centrifugeret i 10 minutter ved 10.000 x g ved 4 ° C for at fjerne uopløseligt bundfald. Protein blev kvantificeret med BCA assay som beskrevet ovenfor

I alt 30 ug protein blev sat på en 4-12% Bis-Tris polyacrylamidgel (Bolt; Life Technologies). Med reduktionsmiddel ifølge producentens specifikationer. Gelen blev overført til en Immobilon membran (Millipore) og blokeret med phosphatpufret saltvand indeholdende 5% bovint serumalbumin og 0,1% tween-20. De følgende primære antistoffer blev anvendt: anti-GAD1 (MAB5406, Millipore) ved 1:5000 fortynding, anti-ALDH5A1 (HPA029716, Sigma) ved 1:1000 fortynding, anti-GLUL (MAB302, Millipore) ved 1:1000 fortynding og anti-ACTB (ab8226; ABCAM) ved 1:4000 fortynding. Primære antistoffer blev inkuberet natten over ved 4 ° C. Sekundært gede-anti-muse eller anti-kanin peberrodsperoxidase-konjugeret antistof (Cell Signaling) blev derefter anvendt ved 1:5000 fortynding. Den samme blot blev anvendt til at undersøge ekspression af alle proteiner. Efter brug af hvert antistof blev blottet strippet med Western Re-probe (G Biosciences) ifølge producentens specifikationer. Blots blev udviklet og afbildet under anvendelse af WesternBright Quantum detektion kit (Advansta).

enzymatiske assays

PNEC-celler blev udpladet, stresset, og vasket som beskrevet ovenfor. Celler blev skrabet i 100 pi iskold lysepuffer (100 mM natriumphosphat, pH 7,0, 20 uM pyridoxalphosphat og 0,1% triton X-100) og gentaget endnu en gang for hver brønd. Prøver blev kortvarigt sonikeret (2-3 sekunder) på is og efterfølgende centrifugeret i 10 minutter ved 10.000 x g ved 4 ° C for at fjerne uopløseligt materiale. Forud for prøve kvantificering blev alle assays bedømt for linearitet med hensyn til tid og mængde af tilsat lysat. Alle enzymaktiviteter blev normaliseret til tiden og mængden af ​​protein i lysatet. Statistiske analyser blev udført som beskrevet ovenfor.

glutamatdecarboxylase assay.

Metoden blev modificeret fra en oprindelige protokol [42]. Assaypufferen indeholdt 100 mM natriumphosphat, pH 7,0, 250 uM pyridoxalphosphat, 50 mM glutamat og 0,4% beta-mercaptoethanol. En reaktion tomt blev udført for hver prøve og indeholdt ikke pyridoxalphosphat eller glutamat. 50 pi lysat blev tilsat til 50 pi reaktionsbuffer i en PCR-plade og inkuberes i op til 8 timer ved 37 ° C i en thermocycler uden opvarmet låg. Assayet blev afsluttet ved tilsætning af 17 pi 350 mM HCI og opvarmet i 30 minutter ved 60 ° C i en thermocycler. Pladen blev fjernet, og kortvarigt centrifugeret for at fjerne kondensat. 17 pi af 400 mM Tris-base blev tilsat for at neutralisere prøven og pladen centrifugeret i 10 minutter ved 1000 x g for at fjerne protein bundfald. Brønde blev derefter fortyndet ti gange til måling af GABA, produktet af den enzymatiske reaktion ved anvendelse af GABase-resazurin assay som beskrevet ovenfor.

Glutaminsynthetase assay.

Metoden blev modificeret fra en original protokol ved at anvende spektrofotometrisk bestemmelse af γ-glutamyl hydroxamat [43]. Assaypufferen indeholdt 50 mM imidazol, pH 6,8, 50 mM hydroxylamin, pH 6,8, 100 mM glutamin, 25 mM natriumarsenat, 0,2 mM adenosindiphosphat (ADP) og 0,5 mM manganchlorid. En reaktion blank blev udført for hver prøve og indeholdt ikke arsenat, ADP, eller glutamin. 10 pi lysat blev tilsat til 90 pi reaktionsbuffer i en PCR-plade og inkuberes i op til 8 timer ved 37 ° C i en thermocycler uden opvarmet låg. Reaktionen blev afsluttet ved tilsætning af 100 pi fremkaldelsesreagens (0,37 M jern (III) chlorid, 0,3 M trichloreddikesyre, 0,6 M HCI). Prøverne blev centrifugeret for at fjerne bundfald og absorbansen måles ved 505 nm. Prøve absorbans blev kalibreret med γ-glutamyl hydroxamat standard.

ALDH5A1 (SSADH) assay.

Metoden blev ændret fra tidligere protokoller [26], [44]. Assaypufferen indeholdt 100 mM Tris pH 8,8, 50 mM kaliumchlorid, 1 mM dithiothreitol, 2,5 mM nikotinamidadenindinukleotid (NAD), 1,25 mM SSAL, og 0,02% bovint serumalbumin. En reaktion blank blev udført for hver prøve og indeholdt ikke SSAL. 10 pi lysat blev tilsat til 90 pi reaktionsbuffer i en PCR-plade og inkuberes i op til 8 timer ved 45 ° C i en thermocycler uden opvarmet låg. Reaktioner blev overført til en mikroplade og absorbansen af ​​NADH, den enzymatiske produkt, blev målt ved 355 nm. Prøve absorbans blev kalibreret med NADH standard.

Resultater

kliniske implikationer af GABA Shunt

Vi har tidligere fastslået med udtryk analyser, GABA-syntese er beriget i høj kvalitet NE maligniteter [13] og valideret tilstedeværelsen af ​​et funktionelt GABA shunt i prostata NE cancer (PNEC) cellelinie ved anvendelse af en kombination af genekspression profilering, metabolit og enzymaktivitet kvantificering [13], [25]. GABA kan afledes af tricarboxylsyre (TCA) cycle mellemprodukter og polyamin /kationiske aminosyre produkter, der kobler GABA metabolisme til flere veje i cellulær energimetabolisme (fig. 1). I én vej, er GABA produceret af glutamat-decarboxylase 1 (GAD1) ​​-medieret decarboxylering af glutamat afledt af enten glutamin eller alpha-ketoglutarat fra TCA-cyklus. I en anden pathway, produkter af polyamin og kationiske aminosyre nedbrydning gennem putrescin undergår redox-medieret omdannelse til GABA. GABA kan derefter metaboliseres af aminobutyrat transaminase (ABAT, GABA-T) og ravsyre semialdehyd dehydrogenase (ALDH5A1, SSADH) ind succinat for indrejse i TCA cyklus

Glud:. Glutamat dehydrogenase; GLS: glutaminase; GLUL: glutamat-ammoniak-ligase; GAD1: glutamatdecarboxylase; ODC1: ornithindecarboxylase; ABP1: diamin oxidase; ABAT: GABA-transaminase; SSAL: succinylsemialdehyd; ALDH5A1: ravsyre semialdehyd-dehydrogenase; ALDH9A1: aldehyddehydrogenase; SAT1:. Spermidin /spermin N-acetyltransferase

For det første at afgøre, om overekspression af GABA shunt enzymer var påviselige i humane prostata-maligniteter og hvis overekspression korreleret med uønskede kliniske hændelser, vi brugte cBioPortal [37] [38] af TCGA at afhøre et offentligt tilgængeligt prostatakræft genekspression datasæt og dens tilsvarende kliniske oplysninger [39] for kohorter af patienter, hvis kræft overudtrykt komponenter af GABA shunt. Ud af alle de enzymer, der er anført i fig. 1,

GAD1

var den eneste gen, hvis overekspression var forbundet med reduceret sygdomsfri overlevelse. Vi identificerede i alt 6 patienter ud af i alt 216 patienter (2,8%), hvis kræft vises

GAD1

overekspression med en z-score større end to. Patienter med kræft, der overudtrykt

GAD1

havde en median sygdomsfri overlevelse tid på 19,8 måneder versus 110,3 måneder (p = 0,003) (Fig. 2A). Denne kohorte af patienter havde en bred vifte af prostata serum antigen (PSA) niveauer fra 3,5 til 40,2 mg /dl, Gleason kvaliteter fra 3 + 3 til 4 + 5, og rastende spænder fra T2C til T3B. Selvom der var kun én dokumenteret tilfælde af metastatisk lymfadenopati på tidspunktet for kirurgi, alle prøver demonstrerede extracapsular forlængelse. Interessant nedsat ekspression af glutaminsyntetase (

GLUL

), som potentielt kan konkurrere med GAD1 enzym til glutamat blev også forbundet med nedsat sygdomsfri overlevelse. I alt 14 patienter med z-scores mindre end -2 blev identificeret med en median overlevelse på 27,9 måneder versus 110,3 måneder (p = 0,006;. Figur 2B).

A.

GAD1

mRNA overekspression i prostata adenocarcinomer korrelerer med nedsat sygdomsfri overlevelse. Tumorer med

GAD1

udtryk z-score større end to display faldt sygdomsfri overlevelse (median 19,8 måneder) i forhold til tumorer, der ikke har øget

GAD1

udtryk (median 110,3 måneder; p = 0,002). B.

GLUL

nedregulering i prostata adenocarcinomer korrelerer med sygdomsfri overlevelse (median 27,9 måneder) i forhold til tumorer uden

GLUL

nedregulering (median 110,3 måneder; p = 0,006). C.

GAD1

mRNA-ekspression i prostata cancer cellelinjer målt med kvantitativ PCR.

GAD1

ekspression kan påvises i kastrationsniveauer-resistente cellelinier NCI-H660, PC3, og DU145, men ikke androgen-responsive cellelinier LNCaP og LAPC4. 18S rRNA blev anvendt som en intern standard. ΔC

t er forskellen på tærsklen cyklus af

GAD1

og tærsklen cyklus af 18S rRNA. ND: Ikke bestemt. D.

GAD1

mRNA overekspression i klar celle nyrecellecancere korrelerer med reduceret samlet overlevelse. Tumorer med

GAD1

z-score 2 display faldt samlet overlevelse (median 52,5 måneder) i forhold til tumorer, der ikke har øget

GAD1

udtryk (median 80,6 måneder; p = 0,01 ). Tumorer med

GAD1

z-score 3 skærm større faldt median overlevelsestid (median 31,1 måneder) i forhold til resten af ​​tumorer (median 78,4 måneder; p = 0,002)

Som ekspressionen af ​​NE-gener er blevet impliceret i kastrationsniveau-resistent prostatacancer, specielt med hensyn til den forøgede ekspression af NE markør aromatiske aminosyre decarboxylase (

DDC

) i kastrationsniveau-resistent prostata kræft [21], bestemte vi, hvis

GAD1

mRNA blev beriget i human kastrationsniveau-resistent prostatacancer. Interessant

GAD1

mRNA-ekspression var påviselig kun i kastrationsniveauer-resistente cellelinier (fig. 2C), med lignende ekspressionsniveauer i NCI-H660 NE cancercellelinie og PC3 og DU145 adenocarcinom cellelinier. Ingen påviselig udtryk for GAD1 blev identificeret i en af ​​androgen-responsive LNCaP og LAPC4 cellelinjer.

På grund af en rapport fra GAD1 proteinekspression i en delmængde af nyrecellecarcinomer [45], vi afhørt en nylig offentliggjort undersøgelse af den klare celle undertype af nyrecellecarcinomer [40], der er fastsat gennem cBioPortal at afgøre, om der var lignende overlevelsesegenskaber. Vi identificerede 39 patienter ud af i alt 499 patienter (8%), hvis tumorer overeksprimeres

GAD1

mRNA med en z score større end to. Denne kohorte viste en signifikant nedsat samlede overlevelse i forhold til den samlede clear cell cancer population med en median overlevelsestid på 52,5 måneder sammenlignet med 80,6 måneder (p = 0,01). Vi isoleret derefter en kohorte af

GAD1

overekspression tumorer (n = 18) med en z-score større end 3, og identificeret et yderligere fald i den samlede overlevelse med en median overlevelsestid på 31,1 måneder sammenlignet med 78,4 måneder (p = 0,002) (fig. 2D). Der var ingen signifikant effekt af

GLUL

mRNA-ekspression på patientens overlevelse i denne population.

Assay udvikling

Potentialet for GABA at have prognostisk betydning at identificere undergrupper af kræftpatienter med nedsat overlevelse fik os til at udvikle en analyse for GABA, der kunne være almindeligt vedtaget, og uafhængig af teknisk udfordrende instrumentering såsom massespektrometri og NMR. Den skematiske af den koblede reaktion kræves til kvantificering GABA er tilvejebragt i fig. 3. Det kommercielt tilgængelige “GABase” præparat fra

Pseudomonas fluorescens

er en kombination af Abat og ALDH5A1 enzymaktiviteter, der oxiderer GABA gennem en serie af to reaktioner i succinat, hvilket resulterer i reduktion af cofaktoren NADP til NADPH. NADPH oxideres derefter til NADP ved mitokondrisk diaphorase således kobling reduktionen af ​​resazurin til fluorescerende produkt resorufin. Selvom ALDH5A1 kan bruge både NAD + og NADP som substrater, er NADP traditionelt er blevet brugt som en co-faktor med dette enzympræparat [26].

GABase forberedelse, en kombination af ABAT og ALDH5A1 enzymer fra

P. fluorescens

konverterer GABA til succinat ved konvertering af alfa-ketoglutarat til glutamat og NADP til NADPH. Selvom NAD eller NADP potentielt kan anvendes som substrater ved ALDH5A1 er NADP konventionelt anvendes som en cofaktor for dette præparat. Succinylsemialdehyd (SSAL), et mellemprodukt med GABA-metabolisme er også metaboliseres i GABase præparatet. Diaphorase oxiderer NADPH og reducerer resazurin til fluorescerende resorufin. Anvendelse af 2-aminoethyl-hydrogensulfat (2-AEHS), kan en inhibitor af ABAT anvendes til at bestemme bidrag SSAL til den samlede signal, som genereres fra GABA og SSAL i cellelysater.

Assay Optimization

en klassisk NADPH fluorescens enzymaktivitetsassay [26] blev anvendt som grundlag for optimering af individuelle komponenter af en resazurin-baseret udlæsning af GABA. Hver komponent blev titreret over et område af koncentrationer, holde alle andre komponenter konstant (fig. 4). Som forventet var det målte følsom over resazurin, der påviser en 5,9 gange stigning i signal over baggrunden ved en koncentration på 6,25 uM.